儲文淵 王玉嬌 朱東悅 陳 竹 嚴涵薇,2 項 艷,2

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學林學與園林學院 合肥 230036； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學作物抗逆育種與減災國家地方聯(lián)合工程實驗室 合肥 230036)

鹽和干旱脅迫下楊樹新內(nèi)參基因的篩選*

儲文淵1王玉嬌1朱東悅1陳 竹1嚴涵薇1,2項 艷1,2

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學林學與園林學院 合肥 230036； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學作物抗逆育種與減災國家地方聯(lián)合工程實驗室 合肥 230036)

【目的】 通過楊樹的多個基因芯片數(shù)據(jù)，篩選出在鹽和干旱脅迫下能夠穩(wěn)定表達的基因作為楊樹的新內(nèi)參基因，為挖掘出更穩(wěn)定、更理想的內(nèi)參基因提供途徑?！痉椒ā?利用已公布的基因芯片數(shù)據(jù)庫獲取不同生長時期、不同逆境處理下的楊樹表達數(shù)據(jù)，將這些數(shù)據(jù)進行歸一化處理，對基因在不同試驗條件下表達量的穩(wěn)定性進行排序。結(jié)合基因的功能注釋信息，篩選新的內(nèi)參基因。為進一步驗證基因表達的穩(wěn)定性，以經(jīng)過NaCl, PEG處理的南林95楊(組培苗)的葉片材料為研究對象，利用實時熒光定量PCR方法，對6個傳統(tǒng)內(nèi)參基因(PtUKN1,PtUBQ,Actin,EF1α, 18SrRNA,TUA8)和本研究篩選的6個新內(nèi)參基因在處理后的0, 1, 4, 8, 12, 24 h的基因表達量進行分析，再利用geNorm, NormFinder和BestKeeper內(nèi)參基因分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和排序，以比較這12個基因的表達穩(wěn)定性，從而篩選到合適的內(nèi)參基因。【結(jié)果】 篩選6個穩(wěn)定表達的新內(nèi)參基因(PtRG1,PtRG2,PtRG3,PtRG4,PtRG5,PtRG6)。將這6個新內(nèi)參基因與6個傳統(tǒng)內(nèi)參基因進行穩(wěn)定性比較后發(fā)現(xiàn)，在geNorm程序分析中鹽脅迫下PtRG2和PtRG3穩(wěn)定性較好，干旱脅迫下PtRG3和PtRG5的穩(wěn)定性較好； 在NormFinder程序分析中鹽脅迫下TUA8和PtRG1穩(wěn)定性較好，干旱脅迫下PtRG1和PtRG2穩(wěn)定性較好； 在BestKeeper程序分析中鹽脅迫下PtRG1和PtRG5穩(wěn)定性較好，干旱脅迫下PtRG3和PtRG5穩(wěn)定性較好。綜合以上3個內(nèi)參基因分析軟件的結(jié)果，PtRG1,PtRG3和PtRG5的穩(wěn)定性較好。為了進一步驗證新內(nèi)參基因的可靠性，以在NaCl和PEG處理條件下受誘導表達的PtVQ6,PtVQ13和PtVQ37作為對照進行熒光定量PCR試驗，發(fā)現(xiàn)3個VQ基因的總體表達趨勢與使用其他內(nèi)參基因的結(jié)果一致?！窘Y(jié)論】 本研究鑒定的PtRG1,PtRG3和PtRG5適宜作為楊樹在鹽和干旱脅迫下的內(nèi)參基因，這些新內(nèi)參基因的挖掘?qū)蚀_校正實時熒光定量PCR試驗中目的基因的表達水平具有重要意義。

楊樹； 實時熒光定量PCR； 內(nèi)參基因； 鹽脅迫； 干旱脅迫

楊樹是重要的綠化能源樹種，大力發(fā)展楊樹產(chǎn)業(yè)，對于豐富森林資源、改善自然生態(tài)環(huán)境大有裨益(劉敏等， 2014)。楊樹在我國主要分布于華北、西北等干旱和半干旱地區(qū)(孫梅霞等， 2004)，干旱不僅會影響葉片的光合速率、枝條生長速率和干物質(zhì)積累，也會使楊樹干物質(zhì)量減輕、材積減少，從而制約著楊樹的速生豐產(chǎn)(何梅等， 2015)。干旱往往與高鹽度引起的滲透脅迫有關(guān)，影響楊樹的生長和產(chǎn)量。楊樹作為重要的木本模式植物，在抗旱、抗高鹽等抗逆境脅迫等分子遺傳改良方面的研究成效顯著。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，抗逆基因的研究也越來越受到大家的青睞。而如何準確地檢測與分析抗逆基因的表達水平對于楊樹抗逆優(yōu)良植株的分子選育工作至關(guān)重要。

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)是最常用、最快速、最簡單的基因表達水平定量分析的方法，它不僅能分析基因在不同生長時期、不同組織器官及不同環(huán)境條件下的樣本間基因表達量的差異，而且相較于以往的分子技術(shù)具有更寬泛的動態(tài)范疇(Gachonetal., 2004； Nolanetal., 2006； Wongetal., 2005)。也正是這些優(yōu)點使得它對內(nèi)參基因的選取十分嚴苛(Bustin, 2000)。由于在PCR過程中的各種差異，結(jié)果的校正和標準化仍然是最具挑戰(zhàn)性的問題(Guéninetal., 2009)，使用內(nèi)參基因可以靈敏地修正RNA起始量和反轉(zhuǎn)錄效率等的差異 (Udvardietal., 2008)，進而獲取靶基因特異表達的真差，因而被認為是最合適的標準方法(Huggettetal., 2005)。

理想的內(nèi)參基因應當在任何情況下都能夠穩(wěn)定表達。由于看家基因是細胞的重要組分，且表達穩(wěn)定，因此在實時熒光定量PCR表達分析中是最常用的內(nèi)參基因。甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate,GAPDH)、肌動蛋白(Actin)、泛素(ubiquitin,UBQ)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin conjugating enzyme,UBC)、18S核糖體RNA(18SrRNA)、25S核糖體RNA(25SrRNA)、轉(zhuǎn)錄延伸因子(elongation factor 1 alpha,EF1α)、微管蛋白(tubulin beta,TUB)和翻譯延長因子(translation elongation factor,TEF)等看家基因常被用來作為內(nèi)參基因校正目的基因的表達(Kimetal.， 2003)。研究(Mehdietal., 2012)發(fā)現(xiàn)，在紅車軸草(Trifoliumpratense)葉片中，UBC2和UBQ10表達最穩(wěn)定； 在莖中，UBC2和YLS8表達較為穩(wěn)定； 在根中，EIF-4α和UBC2表達穩(wěn)定。然而，由于植物發(fā)育階段和試驗條件的不同，大多數(shù)看家基因的表達量也會有所變化(Suzukietal.， 2000； Thellinetal.， 1999； Vandesompeleetal.， 2002)。目前，仍未鑒定到一個廣譜的內(nèi)參基因適用于所有基因和條件(Schmittgenetal.， 2000)。為保證基因表達水平分析的準確性，現(xiàn)大都采用雙內(nèi)參基因的方法。然而，為了降低這種方法帶來的數(shù)據(jù)處理的難度以及減少試劑的消耗，研究者堅持在尋找一個在大多數(shù)情況下表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因。隨著生物信息學的發(fā)展，通過基因芯片技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以全面快速地獲得基因在不同組織和生長時期下的表達信息，這為篩選時空表達譜下穩(wěn)定表達的基因作為廣譜性內(nèi)參基因提供了一種有效方法，而這種方法仍未在木本植物中廣泛應用。

為了提高實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)的準確性，篩選合適的內(nèi)參基因就顯得尤為重要。目前，Actin,PtUBQ, 18SrRNA,EF1α,TUB8和PtUKN1常被作為內(nèi)參基因應用于楊樹的實時熒光定量PCR分析中。本研究系統(tǒng)分析了這6個傳統(tǒng)的內(nèi)參基因和通過基因芯片技術(shù)篩選得到的6個新內(nèi)參基因(PtRG1-PtRG6)在NaCl及PEG處理下的南林95楊(Populusdeltoides‘Nanlin95’)組培苗葉中的表達，熒光定量PCR獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)geNorm(Vandesompeleetal.， 2002)、NormFinder(Andersenetal.， 2004)和BestKeeperet(Pfaffletal.， 2004)3個統(tǒng)計學軟件分析從而評價候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為生長4周、株高約10 cm的南林95楊組培苗，培養(yǎng)條件為每天光照16 h，光照強度30 lx，室溫(25±3) ℃。

1.2試驗方法

1.2.1 楊樹葉片總RNA的提取、質(zhì)量檢測和反轉(zhuǎn)錄 1) 選取約10 cm高的南林95楊組培生根苗，分別對其葉片進行鹽和干旱誘導處理。誘導處理方法為： 25% PEG噴灑葉片處理0，1，4，8，12，24 h， 200 mmol·L-1NaCl噴灑處理0，1，4，8，12，24 h，對照苗木噴灑等量的純凈水。葉RNA的提取采用Trizol方法(Bio Basic Inc)。為了使試驗結(jié)果更準確，均進行3次生物學重復和4次技術(shù)重復。

2) 完整性檢測： 將SYBRGreenⅠ, Loading Buffer和RNA按1∶2∶5體積比混勻，使用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)拍攝照片并保存。純度和含量的檢測： 吸取1 μL總RNA滴加到微量分光光度計探頭，進行檢測。一般OD260/OD280介于1.8～2.0且電泳條帶清晰無雜帶，提取的總RNA質(zhì)量合格。

3) RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA： 利用TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript TM RT Master Mix(R036A)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 新內(nèi)參基因的篩選 1) 從已公布的數(shù)據(jù)庫中獲取楊樹葉片在不同的生長發(fā)育時期(編號為GSE13990)、不同的處理條件下的基因芯片數(shù)據(jù)(編號為GSE15242，GSE21171，GSE23637)。

2) 利用昂飛公司開發(fā)的歸一化基因芯片數(shù)據(jù)的軟件Expression Console，對4個芯片數(shù)據(jù)進行歸一化處理。首先，通過軟件提供的MAS5算法計算出所有數(shù)據(jù)的P值，篩選Plt;0.05的探針； 再利用軟件提供的RMA算法計算出所有探針在不同試驗條件下的信號表達值及變異系數(shù)(CV)。綜合考慮每個探針的P和CV值，對探針進行排序。

3) 以探針的Plt;0.05、CV值越小越好為原則，初步鑒定內(nèi)參基因。

4) 根據(jù)內(nèi)參基因的功能預測，進一步篩選功能保守的基因。

5) 通過檢索公開數(shù)據(jù)庫，確保篩選的內(nèi)參基因在相關(guān)研究中未有報道，最終篩選出了6個候選內(nèi)參基因，按照染色體位置排序，分別命名為PtRG1,PtRG2,PtRG3,PtRG4,PtRG5和PtRG6。

1.2.3 引物設計 除了通過基因芯片技術(shù)篩選出的6個候選內(nèi)參基因外，本研究還選擇了PtUKN1,PtUBQ,Actin,EF1α, 18SrRNA和TUA8這6個傳統(tǒng)內(nèi)參基因進行對比研究。用Primer5.0軟件設計引物，參數(shù)設置如下: 擴增長度80～200個堿基對，引物序列長度17～25個堿基，GC含量45%～55%，正向引物和反向引物的退火溫度差值的絕對值小于3 ℃。引物由上海生工工程公司合成，詳細情況見表1。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 使用Bio-Radi Cycler IQ實時定量PCR儀和96孔板，選用大連寶生物工程有限公司的SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行基因的表達分析。每個孔按照20 μL體系添加樣品： 1 μL模板cDNA，1 μL上游引物(10 μmol·L-1)，1 μL下游引物(10 μmol·L-1)，10 μL 2× SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ, 7 μL無菌水。每個樣品重復4次。擴增反應程序為： 95 ℃預變性30 s； 95 ℃變性5 s，60 ℃退火18 s，72 ℃延伸15 s，39個循環(huán)，采集溶解曲線熒光信號。試驗數(shù)據(jù)采用相對定量法分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)整理與分析 首先通過Bio-Rad iQ5軟件，導出經(jīng)過不同處理的南林95楊組培苗葉片的Ct值。然后根據(jù)公式Q=E(minCt - sampleCt)(Livaketal.， 2001； Schmittgenetal.， 2008)計算出試驗樣品中每一個基因的相對表達量(E為基因的擴增效率，E值取2，minCt為最小Ct值，sampleCt為各基因的Ct值)，然后將該數(shù)據(jù)分別導入至geNorm和NormFinder軟件中，對基因表達的穩(wěn)定性進行分析。BestKeeper軟件可直接對樣品的Ct值進行分析。

表1 基因相關(guān)信息①Tab. 1 The information of genes

①*表示GenBank數(shù)據(jù)庫中的檢索號；**表示Phytozome數(shù)據(jù)庫(V3版本)中毛果楊基因編號；#表示基因在GenBank數(shù)據(jù)庫中的功能描述；##表示基因所屬的蛋白家族；###表示通過ProtFun數(shù)據(jù)庫預測的功能信息。*represents a accession number in the GenBank database;**represents gene identifier ofPopulustrichocarpain the Phytozome database (V3 version);#represents the functional description of the gene in the GenBank database;##represents the protein family to which the gene belongs;###represents the functional information predicted by the ProtFun database.

2 結(jié)果與分析

2.1RNA的質(zhì)量評價

使用DNase I處理RNA樣品后，經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測未發(fā)現(xiàn)雜帶，說明所提取的RNA未降解。通過Nanodrop ND-1000紫外分光光度計檢測樣品的OD值(OD260/OD280)均在1.8～2.0之間，且為單峰曲線，這表示樣品的純度和完整性符合試驗要求。

2.2引物特異性驗證

通過對實時熒光定量PCR溶解曲線的分析，發(fā)現(xiàn)各內(nèi)參基因都只產(chǎn)生單溶解峰(圖1)，這表示設計的引物特異性良好，實時熒光定量PCR反應的專一性高，試驗結(jié)果可信度高。

圖1 12個內(nèi)參基因的溶解曲線Fig.1 Melting curves of 12 reference genes橫軸為溫度，縱軸為熒光強度的變化值。The horizontal axis represents the temperature, and the vertical axis represents the change in fluorescence intensity.

2.3鹽和干旱脅迫下內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1Ct值分析 實時熒光定量PCR的Ct值是指每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，它能直觀地反映出基因的表達量大小，基因的表達量與Ct值成反比關(guān)系。實時熒光定量PCR的結(jié)果表明，在NaCl和PEG處理下，12個內(nèi)參基因中Ct值最小的基因均為18SrRNA，表達量最大； 而PtUKN1的Ct值最大，表達量最小。其他基因的Ct值介于15～35 之間。這說明在相同的條件下，不同的內(nèi)參基因表達量有所差異； 而在鹽和干旱處理不同時間后，這12個內(nèi)參基因自身的表達量也存在差異。

2.3.2 geNorm分析 geNorm程序是利用M值(平均表達穩(wěn)定指數(shù))評價內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，即geNorm會通過計算出的M值對基因的穩(wěn)定性進行排序，M值越低則表示基因的表達越穩(wěn)定。如果某個基因的M值小于1.5，那么該基因可以作為備選的內(nèi)參基因(Vandesompeleetal.， 2002)。geNorm軟件分析表明，在NaCl處理下，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性從高到低排序為PtRG2=PtRG3gt;PtRG4gt;PtRG1gt;PtRG5gt;PtRG6gt;TUA8gt;PtUKN1 gt;EF1αgt;Actingt;PtUBQgt;18SrRNA，其中PtRG2,PtRG3,PtRG4,PtRG1,PtRG5,PtRG6的M值均低于或接近1.5，表明它們相對較為穩(wěn)定(圖2A)。

在PEG處理下，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性從高到低排序為PtRG3=PtRG5gt;PtRG1gt;PtRG6gt;TUA8gt;PtRG4gt;PtRG2gt;EF1αgt;PtUBQgt;Actingt;PtUKN1gt; 18SrRNA，其中6個基因PtRG1,PtRG3,PtRG4,PtRG5,PtRG6,TUA8的M值均小于1.5，表明它們的表達較為穩(wěn)定，且PtRG3,PtRG5的M值最小，表示它們相對于其他基因來說表達更為穩(wěn)定(圖2B)。

綜上所述，發(fā)現(xiàn)PtRG3在NaCl和PEG處理下表現(xiàn)均為最穩(wěn)定，適宜做內(nèi)參基因； 此外，與傳統(tǒng)的看家基因相比較，通過基因芯片技術(shù)篩選得到的新內(nèi)參基因更為穩(wěn)定。

圖2 geNorm軟件分析鹽(A)及干旱(B)處理下內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性Fig.2 Expression stability of reference genes under salt(A)and drought(B)treatments by geNorm

2.3.3 NormFinder分析 NormFinder軟件是通過EXCEL軟件計算基因的穩(wěn)定指數(shù)M，M值越低，則該基因的表達越穩(wěn)定。

在NaCl處理下，12個候選基因的M值如表2所示，其穩(wěn)定性按從高到低依次排序。TUA8的M值最低，穩(wěn)定性最好； 18SrRNA的M值最高，穩(wěn)定性最差。此外，發(fā)現(xiàn)新內(nèi)參基因的穩(wěn)定性相對傳統(tǒng)內(nèi)參基因排名靠前，前5個基因中僅有1個傳統(tǒng)內(nèi)參基因TUA8。

表2 NormFinder軟件分析鹽脅迫下內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性Tab. 2 Expression stability of reference genesunder NaCl treatment by NormFinder analysis

在PEG處理下，12個候選基因的M值如表3所示，其穩(wěn)定性按從高到低依次排序。其中PtRG1的M值最低，穩(wěn)定性最好； 而18SrRNA的M值最高，穩(wěn)定性最差。同時發(fā)現(xiàn)，與在NaCl處理下的情況相似，新內(nèi)參基因的穩(wěn)定性相對傳統(tǒng)內(nèi)參基因排名靠前，前5名中僅只有1個傳統(tǒng)內(nèi)參基因TUA8，只是排名的順序有所不同。

表3 NormFinder軟件分析干旱處理下內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性Tab.3 Expression stability of reference genes underdrought treatment by NormFinder analysis

2.3.4 BestKeeper分析 BestKeeper程序可以直接使用內(nèi)參基因的Ct值，并經(jīng)過EXCEL軟件計算得到標準差SD。SD值與基因的穩(wěn)定性成負相關(guān)性。在NaCl和PEG處理下，穩(wěn)定性最好的基因均為PtRG5，穩(wěn)定性最差均為18SrRNA，其他基因的穩(wěn)定性排序略有不同(表4，表5)。同時也發(fā)現(xiàn)，新內(nèi)參基因相對傳統(tǒng)看家基因穩(wěn)定性更高。

表4 BestKeeper軟件分析鹽脅迫下內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性①Tab.4 Expression stability of reference genes under salt stress by BestKeeper analysis

①Ct: 熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的閾值所對應的循環(huán)次數(shù)。下同。Ct: The fluorescence signal begins to enter the loop number of cycles corresponding to the threshold of the exponential growth phase. The same below.

表5 BestKeeper軟件分析干旱脅迫下內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性Tab.5 Expression stability of reference genes under drought stress by BestKeeper analysis

2.3.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證 為了驗證PtRG1,PtRG3和PtRG5是否適宜作為楊樹在鹽和干旱脅迫下的內(nèi)參基因，分別以PtRG1,PtRG3和PtRG5為內(nèi)參基因，運用qPCR法分析了受鹽和干旱脅迫誘導表達的3個楊樹VQ基因(PtVQ6,PtVQ13,PtVQ37)(Chuetal.， 2016)的相對表達量。發(fā)現(xiàn)以PtRG1,PtRG3和PtRG5為內(nèi)參基因時，在鹽和干旱脅迫下各個時間段的表達變化趨于一致(圖3、圖4)，且其結(jié)果與Chu等(2016)的研究結(jié)果基本一致，均表明PtRG1,PtRG3和PtRG5能夠穩(wěn)定表達，這將為進一步研究楊樹VQ基因的功能奠定基礎(chǔ)。

圖3 分別以PtRG1, PtRG3和PtRG5為內(nèi)參基因校正PtVQ6, PtVQ13和PtVQ37在鹽處理下的表達水平Fig.3 The expression of PtVQ6, PtVQ13 and PtVQ37 under salt treatment calibrated by PtRG1, PtRG3 and PtRG5 as reference genes separately

圖4 分別以PtRG1, PtRG3和PtRG5為內(nèi)參基因校正PtVQ6, PtVQ13和PtVQ37在干旱處理下的表達水平Fig.4 The expression of PtVQ6, PtVQ13 and PtVQ37 under drought treatment calibrated by PtRG1, PtRG3 and PtRG5 as reference genes separately

3 討論

實時熒光定量PCR技術(shù)作為常用的基因表達分析方法，其內(nèi)參基因的選擇至關(guān)重要，合適的內(nèi)參基因能更好地校正試驗數(shù)據(jù)，減小誤差。理想的內(nèi)參基因應當在任何情況下都表達穩(wěn)定，然而許多研究表明這樣的理想內(nèi)參基因是不存在的。不同的細胞、不同的生長階段、不同的生長環(huán)境，內(nèi)參基因的表達也不同(Huetal.， 2009； Dieetal.， 2010)。蘇曉娟等(2013)發(fā)現(xiàn)，楊樹在鋅脅迫下ubiquitin,EF1α, 18SrRNA和Actin的穩(wěn)定性較好，GAPDH的穩(wěn)定性最差； Lovdal等(2009)發(fā)現(xiàn)在氮缺乏，低溫和弱光脅迫的番茄(Solanumlycopersicum)葉片中ACT最適宜作為內(nèi)參基因。這些研究結(jié)果證實了在不同的脅迫條件下，所選擇的內(nèi)參基因也不盡相同。因此，本文對楊樹在鹽和干旱脅迫下內(nèi)參基因的選擇問題進行了深入的研究，以篩選出在這2個處理下表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

選擇看家基因作為實時熒光定量PCR表達分析中的內(nèi)參基因是普遍得到共識的，但看家基因在不同的試驗條件下表達也會有很大的差異，前期的研究結(jié)果已經(jīng)表明，常用的內(nèi)參基因在一定條件下由于不穩(wěn)定性的表達不適合作為內(nèi)參基因，它們已逐漸被新的參考基因所取代。而新內(nèi)參基因的發(fā)掘可以通過基因芯片的表達數(shù)據(jù)篩選得到，目前基因芯片技術(shù)仍未在木本植物中廣泛應用，使得并不適合所有試驗條件的傳統(tǒng)內(nèi)參基因仍被不少研究者沿用。為了找到更合適的內(nèi)參基因，在本研究中，通過基因芯片技術(shù)篩選出了6個新內(nèi)參基因。目前，關(guān)于這6個基因的功能未有報道，通過基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域以及功能預測分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與維持細胞基本功能的作用(表1)。為了比較內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，將傳統(tǒng)的內(nèi)參基因與本研究中通過基因芯片篩選的內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR試驗，從而選擇一種合適的內(nèi)參基因用于校正目的基因的表達量。

為了進一步比較這12個待定的內(nèi)參基因在鹽和干旱脅迫下的穩(wěn)定性，本研究使用geNorm, NormFinder和BestKeeper這3個軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果表明： 通過基因芯片技術(shù)篩選得到的新基因比傳統(tǒng)看家基因更穩(wěn)定，其中g(shù)eNorm軟件分析得出PtRG3在鹽脅迫和干旱脅迫下表現(xiàn)均為最穩(wěn)定，最適宜做內(nèi)參基因； NormFinder軟件分析得出在鹽脅迫下，TUA8穩(wěn)定性最好，最適宜做內(nèi)參基因，而在干旱脅迫下，PtRG1的穩(wěn)定性最好，最適宜做內(nèi)參基因； BestKeeper程序分析得出在鹽脅迫和干旱脅迫下，PtRG5穩(wěn)定性最好，最宜做內(nèi)參基因。這3款軟件分析得出的結(jié)果略有不同，這種不一致性可能是由于計算機軟件的統(tǒng)計學算法不同及試驗數(shù)據(jù)的誤差造成的。geNorm程序是通過兩兩對比的方式，同時對2個以上候選基因進行篩選，從而篩選得到2個以上的內(nèi)參基因，geNorm程序可以減小系統(tǒng)誤差，使數(shù)據(jù)更加準確，尤其對微小表達差異的基因的表達研究具有十分重要的意義； NormFinder程序能夠?qū)?個變異的來源進行平衡，但無法規(guī)避樣品制備過程中存在的系統(tǒng)誤差，這種統(tǒng)計分析方法適用于無法適當?shù)丶毞謽悠返臄?shù)據(jù)統(tǒng)計； BestKeeper程序是根據(jù)數(shù)據(jù)的離散程度來分析基因的穩(wěn)定性，但極端值對結(jié)果的影響很大，且無法規(guī)避系統(tǒng)誤差。

4 結(jié)論

在鹽脅迫和干旱脅迫下，通過基因芯片技術(shù)篩選出的新內(nèi)參基因表達穩(wěn)定，豐富了楊樹內(nèi)參基因的選擇。其中，PtRG1,PtRG3和PtRG5相較于傳統(tǒng)內(nèi)參基因更適合作為楊樹在鹽和干旱脅迫下實時熒光定量PCR的內(nèi)參基因。

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(責任編輯 徐 紅)

SelectionofNovelReferenceGenesinPoplarunderSaltandDroughtStresses

Chu Wenyuan1Wang Yujiao1Zhu Dongyue1Chen Zhu1Yan Hanwei1,2Xiang Yan1,2

(1.SchoolofForestryandLandscapeArchitecture,AnhuiAgriculturalUniversityHefei230036; 2.NationalEngineeringLaboratoryofCropStressResistanceBreeding,AnhuiAgriculturalUniversityHefei230036)

【Objective】 Choosing a suitable reference gene is an effective method to improve the accuracy and to reduce the experimental error of quantitative real-time PCR (qPCR). It has become an important technique to select stable expression of genes as novel reference genes using gene expression data in recent years. The purpose of our study is to select the novel reference genes which are expressed stably under salt and drought stresses in poplar using multiple microarray data. Our study will enrich the reference genes in poplar, and provide more channels for exploring stable and desirable reference genes.【Method】 The gene microarray data ofPopulustrichocarpain different growth periods under different stress treatments were collected from public gene chip database. The data were normalized to rank the stability of the expression of genes under different experimental conditions. Based on the functional annotation information of the genes, six novel reference genes were selected. In order to further verify the stability of gene expression, we have chosen the leaves ofPopulusdeltoides‘Nanlin95’ assessed by NaCl, PEG for analysis. Six traditional reference genes(PtUKN1,PtUBQ,Actin,EF1α, 18SrRNA,TUA8)and six novel reference genes were assessed by qPCR at six points (0, 1, 4, 8, 12, 24 h). Using the reference gene analyzing programs of geNorm, NormFinder and BestKeepe, the experimental data were counted and ranked in order to compare the expression stability of the 12 genes and accordingly select the suitable novel reference genes.【Result】 In this study, six stable expression genes (PtRG1,PtRG2,PtRG3,PtRG4,PtRG5,PtRG6) were selected from the gene chip database. Comparisons of the stability between these six new reference genes and the six traditional reference genes displayed that, in the geNorm program analysis, the stability ofPtRG2 andPtRG3 was better under salt stress and the stability ofPtRG3 andPtRG5 was better under the drought stress; in NormFinder program analysis, the stability ofTUA8 andPtRG1 was better under salt stress and the stability ofPtRG1 andPtRG2 was better under the drought stress; in BestKeeper program analysis, the stability ofPtRG1 andPtRG5 was better under salt stress and the stability ofPtRG3 andPtRG5 was better under the drought stress. To further verify the stability of these gene expression,PtVQ6,PtVQ13 andPtVQ37 expressed highly in the poplar VQ gene family under NaCl and PEG treatment were selected as the target gene to conduct qPCR again and found the results were consistent with the previous study, suggestingPtRG1,PtRG3 andPtRG5 were stable.【Conclusion】PtRG1,PtRG3 andPtRG5 identified in our study are suitable as the reference genes in poplar under salt and drought stresses, which would contribute to a more accurate analysis for the expression of the resistance genes in qPCR.

poplar； quantitative real-time PCR； reference genes； salt stress； drought stress

10.11707/j.1001-7488.20171008

2017-01-16；

2017-06-03。

國家自然科學基金項目(31370561)； 國家科技支撐計劃子課題(2015BAD07B070104)。

*嚴涵薇為通訊作者。

S718.46

A

1001-7488(2017)10-0070-10