孫麗娟 王曉榮 倪曉詳 程龍軍

(浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

巨桉非生物逆境響應基因EgrNAC1的基因結構和表達分析*

孫麗娟 王曉榮 倪曉詳 程龍軍

(浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

【目的】 NAC(NAM，ATAF和 CUC2 蛋白)是植物中一類特異轉錄因子，廣泛參與植物生長、發(fā)育、激素信號轉導和逆境響應過程。本文通過對巨桉EgrNAC1(Eucgr.I00058)編碼蛋白結構、蛋白亞細胞定位特點，以及低溫、干旱和高鹽等非生物逆境條件下的基因表達分析，研究EgrNAC1基因與非生物逆境響應的關系，為其功能的深入研究提供基礎。【方法】 首先從巨桉基因組數(shù)據庫下載EgrNAC1基因、啟動子和編碼蛋白序列，利用SMART、MatInspector 和MEGA等軟件對EgrNAC1蛋白結構特征、進化分類及啟動子上的順式作用元件進行分析； 并以pCAMBIA1300為基礎載體，用酶切法構建EgrNAC1∷sGFP載體，采用基因槍轟擊洋蔥表皮方法，對EgrNAC1蛋白表達的亞細胞定位特點進行研究。然后，以4 ℃不同時間處理的數(shù)字表達譜數(shù)據為基礎，利用WGCNA軟件進行基因共表達分析，了解低溫下與EgrNAC1高度相關的共表達基因特征。為進一步了解EgrNAC1在不同非生物逆境處理下的表達特征，同樣利用3個月巨桉無性系幼苗進行不同低溫(-8，-4，0，4，8 ℃)、4 ℃不同時間(2， 6， 12， 24， 48 h)、高溫(42 ℃)、高鹽、干旱、脫落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的不同處理，用實時熒光定量RT-PCR方法對這些處理下EgrNAC1的表達情況進行分析?！窘Y果】 EgrNAC1中NAC結構域包含A，B，C，D，E 5個典型亞結構域，其中含2個α螺旋5個β折疊片結構，有核定位序列，無跨膜域。進化樹構建結果表明，EgrNAC1屬于NAC家族的Ⅰ類亞家族ATAF子組，逆境類NAC分類中屬于SNAC-A亞類。EgrNAC1啟動子序列上含有ABRE、MBS、MCS和DREB等大量與逆境脅迫相關的順式作用元件。亞細胞定位結果表明EgrNAC1在核中表達。4 ℃不同處理時間(0，2，6，12，24，48 h)下與EgrNAC1共表達相關系數(shù)最高的20個基因中，大多數(shù)基因參與逆境脅迫響應相關的調控過程。不同時間處理下，葉片中EgrNAC1誘導水平隨處理時間延長不斷提高； 不同低溫下， 4 ℃和8 ℃處理中EgrNAC1的誘導水平相對較高； 干旱處理1天后基因表達即受到誘導，然后又有所下降； 鹽(200 mmol·L-1NaCl)脅迫48 h，才能誘導EgrNAC1表達； 100 μmol·L-1ABA和100 μmol·L-1MeJA均能誘導葉片中EgrNAC1基因表達，MeJA誘導速度更快，處理2 h后基因表達即明顯提高，而ABA的誘導效應則需要24 h?！窘Y論】EgrNAC1是參與巨桉逆境脅迫響應的1個NAC類轉錄因子基因，其不僅參與低溫、干旱和高鹽的非生物逆境脅迫響應，還可能與ABA、MeJA信號轉導有交叉互作效應。

巨桉； NAC基因； 非生物逆境； 基因表達

植物容易遭受各種環(huán)境脅迫危害，僅干旱、鹽、高溫和低溫等非生物逆境因子造成的全球范圍內主要作物減產就達到50%以上(Rodriguezetal., 2005)。而且，隨全球氣候急劇變化，這一現(xiàn)象日趨嚴重(Lobelletal., 2011)。因此，研究植物應對各種逆境因子的分子生物學機制，通過遺傳工程和分子輔助育種手段提高植物對逆境脅迫的抗性，對農林業(yè)生產有非常重要的意義。

植物本身為應對各種逆境因子，在長期進化過程中形成了一系列逆境響應機制。植物細胞通過信號傳遞效應接收逆境信號后，發(fā)生一系列基因調控過程，進而產生適應逆境環(huán)境的生理和代謝變化，如脯氨酸、甜菜堿等滲透調節(jié)物質積累等，以提高對逆境的適應性(Xiongetal., 2001; Shulaevetal., 2008)。

在基因調控階段，轉錄因子作為效應基因控制開關，發(fā)揮極為重要的作用。重要轉錄因子(如WRKY，bZIP，MYB，AP2和NAC等)家族都參與了逆境響應調控過程(Agarwaletal., 2010; Crameretal., 2011)。其中NAC(NAM，ATAF和 CUC2 蛋白)轉錄因子家族成員廣泛參與植物對不同逆境因子的響應，并在其中發(fā)揮非常重要的作用(Nakashimaetal., 2012; Shaoetal., 2015)。

NAC轉錄因子基因為植物所特有，其成員眾多，是一個龐大的基因家族。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和毛果楊(Populustrichocarpa)中分別有117，151和163個成員(Ookaetal., 2003; Huetal., 2010; Nuruzzamanetal., 2010)。NAC基因最早是從矮牽牛(Petuniahybrida)中分離的NAM(no apical meristem，無頂端分生組織)，該基因缺失影響根尖分生組織和葉片發(fā)育(Soueretal., 1997)。但近些年來的研究表明，NAC類基因的生物學功能非常廣泛，幾乎涉及植物生長發(fā)育各個方面，包括植物生殖、營養(yǎng)發(fā)育、次生生長和激素信號轉導以及生物和非生物逆境脅迫響應等(Olsenetal., 2005)。植物NAC基因家族中相當比例的成員參與非生物逆境脅迫響應，如擬南芥中有33個NAC基因表達在鹽脅迫下發(fā)生非常大的變化(Jiangetal., 2006)； 水稻中40個NAC基因響應干旱和鹽脅迫(Fangetal., 2008)； 大豆(Glycinemax)中也有38個NAC基因參與干旱響應(Leetal., 2011)。因此，植物NAC基因在非生物逆境脅迫中發(fā)揮的作用越來越被重視(Shaoetal., 2015)。

桉樹(Eucalyptus)作為一個重要工業(yè)用材樹種，其生長過程中往往受低溫、缺水和鹽脅迫等非生物逆境限制，研究桉樹逆境響應相關的重要基因對其分子輔助育種意義重大。本研究在巨桉(Eucalyptusgrandis)低溫處理的數(shù)字表達譜(digital gene expression，DGE)中發(fā)現(xiàn)1個受低溫誘導的NAC類基因，該基因具有典型的NAC結構域，命名為EgrNAC1。對該基因結構特征和不同非生物逆境條件下的表達變化進行了分析，旨在為桉樹抗逆分子輔助育種提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

選取定植3個月、生長一致的巨桉無性系幼苗作為試驗材料。所有試驗處理均在Snijders微氣候控制生長箱(MC1000，荷蘭)中進行，培養(yǎng)條件： 白天25 ℃ 14 h，夜間22 ℃ 10 h，光照強度150 μmol·m-2s-1，相對濕度70%。相應非生物逆境處理結束后，收集植株葉片迅速凍存于液氮，進行后續(xù)RNA提取。

1.2EgrNAC1編碼蛋白結構和啟動子分析

EgrNAC1(Eucgr.I00058)基因、蛋白序列從巨桉基因組數(shù)據庫(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Egrandis)下載，利用在線軟件Protparam(http:∥www.expasy.ch/tools)預測EgrNAC1基因編碼蛋白分子量和等電點。蛋白質二級結構、跨膜結構域和核定位序列預測分別用PSIPRE(http:∥bionf.cs.ucl.ac.uk/index.php)，Tmhmm2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和cNLS Mapper(http:∥nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)進行。根據Ooka等(2003)對植物中NAC家族的分類，擬南芥不同NAC子組成員各選取2個作為該子組代表，將它們的蛋白序列與EgrNAC1蛋白序列用Clustalx軟件進行多序列聯(lián)配，再用MEGA4.0軟件構建1 000個自舉重復的進化樹(Ookaetal., 2003)，以此為依據對EgrNAC1進行分類。EgrNAC1與其他植物中同源蛋白進化樹構建，則在NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)上，利用blast程序篩選與序列相似程度較高的蛋白序列，進行多序列聯(lián)配后，同樣用MEGA4.0軟件構建進化樹。啟動子上順式作用元件分析則是截取EgrNAC1基因起始密碼子上游1.5 kb序列，在線利用MatInspector軟件(http:∥www.genomatix.de/cgi-bin∥matinspector_prof)進行分析。

1.3EgrNAC1蛋白亞細胞定位

在插入35S∷sGFP的載體pCAMBIA1300中，利用多克隆位點處BamHⅠ和XbaⅡ酶切位點連入去掉終止密碼子的EgrNAC1編碼序列PCR擴增產物(表1)，構建EgrNAC1∷sGFP融合蛋白表達載體。進行DH5α轉化后，抽提質粒，金粉(1 μm，Bio-Rad)包埋，用PDS-1000/He型基因槍轟擊洋蔥(Alliumcepa)表皮細胞，然后用激光共聚焦顯微鏡掃描成像。

1.44℃不同處理時間EgrNAC1基因共表達分析

3個月苗齡巨桉幼苗，4 ℃低溫下，采用先后間隔0，24，36，42，46 h依次放入生長箱，作為48，24，12，6，2 h的低溫處理，以25 ℃生長條件下的幼苗作為0 h(對照)處理，處理完畢后一起收獲葉片(摘取枝條頂芽下面第3-5片完全展開的葉片，下同)，提取RNA進行數(shù)字表達譜(DGE)測序(諾禾致源)。結果中的差異表達基因(gt;2倍)用WGCNA計算與EgrNAC1具有共表達關系基因的Pearson系數(shù)(cor),根據cor的大小進行基因排序。

1.5低溫、高溫、干旱、高鹽、ABA和MeJA處理下的EgrNAC1基因表達分析

參考魏曉玲等(2015)的方法，在生長箱中以25 ℃生長條件下幼苗作為對照(CK)。-8，-4，0，4，8 ℃作為低溫處理溫度，42 ℃作為高溫處理溫度，處理2 h收獲葉片提取RNA備用。4 ℃低溫不同時間試驗處理方法同1.4，處理結束一起提取葉片RNA備用。高鹽處理則將植株置于不同塑料容器(60 L)內，處理組塑料容器內保持植株栽培盆1/3高度的200 mmol·L-1NaCl溶液，對照組則用清水保持同樣液面高度； 同樣采用間隔0，24，48，60，66 h的方法依次放入處理苗作為72，48，24，12，6 h處理。干旱處理用5，3，2，1天不澆水植株作為處理組，正常澆水的作為對照。100 μmol·L-1ABA(脫落酸)和100 μmol·L-1MeJA(茉莉酸甲酯)處理采用植株葉面噴施的方法，以噴施激素溶液后2，6，24 h植株作為處理組，未噴施植株作為對照組，試驗結束后，統(tǒng)一收獲葉片，提取RNA。以上試驗均為每處理組3株植株，進行3次重復。

1.6RNA提取、cDNA合成及基因定量表達分析

根據王亞紅等(2010)的方法提取處理葉片RNA。利用PrimeScript?RT reagent Kit(TaKaRa，大連，中國)試劑盒完成反轉錄。實時熒光定量 RT-PCR試驗中采用SYBR-Green染料(Takara，大連，中國)和BIO-RAD CFX96實時PCR系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)。以Egr18SrRNA作為內參基因，設計引物進行實時熒光定量RT-PCR，3次重復試驗(表1)。用系統(tǒng)自帶的Bio-Rad CFX Manager(Version 1.5.5.34)軟件進行結果分析，并用GraphPad (ver 4.0)作圖。

表1 實時熒光定量 RT-PCR、亞細胞定位sGFP載體構建所用引物序列Tab. 1 List of primer sequences used in real timefluorescence quantitative RT-PCR and sGFPvector construction

圖1 EgrNAC1蛋白與其他植物同源蛋白序列的比對(a)及系統(tǒng)進化樹(b)Fig.1 Mutiple alignment (a) and phylogenetic tree (b) of EgrNAC1 in Eucalyptus grandis and its homologus proteins from other plantsA, B, C, D和E劃線處為NAC結構域的5個亞結構域; NLS: 核定位序列，用雙劃線表示。The amino acid sequences underlined with A, B, C, D and E are subdomain of NAC domain, and nuclear localization sequence(NLS) is indicated with double lines.

2 結果與分析

2.1EgrNAC1基因編碼蛋白結構分析

EgrNAC1是4 ℃不同時間(0，2，6，12，24，48 h)處理下，數(shù)字表達譜中被強烈誘導表達的基因。巨桉基因組數(shù)據庫(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Egrandis)中該基因編號為： Eucgr.I00058，數(shù)據庫中該基因注釋為1個編碼含NAC結構域的蛋白。該基因全長1 968 bp，含3個外顯子、2個內含子。開放閱讀框長885 bp，編碼蛋白氨基酸殘基數(shù)量為294個。Protparam軟件預測該蛋白的等電點為5.86，分子量為33.46 kDa。

所有NAC基因編碼蛋白在N末端都含有1個約150個氨基酸殘基組成的NAC結構域，該結構域高度保守，而且不同于目前已知的經典結構域，是由數(shù)個α螺旋環(huán)繞反向平行的β折疊構成，分為A，B，C，D，E 5個亞結構域，DNA結合結構域就位于其中。而C末端序列高度多樣化，為轉錄激活區(qū)(Puraniketal., 2012)。通過蛋白結構域分析發(fā)現(xiàn)EgrNAC1的NAC結構域為8-158位氨基酸，包含A，B，C，D，E 5個典型NAC亞結構域，結構域中有2個α螺旋和5個β折疊(圖1a)，結構域中含有核定位序列： KALVFYAGKAPKGVKTNWI。TMHMM軟件分析表明EgrNAC1蛋白不具有跨膜結構域。不同植物NAC基因編碼蛋白的進化樹結果表明EgrNAC1與楊樹、大豆中同源蛋白親源關系比較近，氨基酸序列相似程度最高達到67%，而與單子葉植物中水稻親源關系較遠，同水稻中SNAC基因編碼蛋白氨基酸序列相似程度僅為49%(圖1b)。

由于NAC基因家族成員眾多，根據Ooka等(2003)對擬南芥和水稻NAC家族的分類標準，NAC蛋白分為2個亞家族Ⅰ和Ⅱ，共18個子組； 其中，亞家族Ⅰ含14個子組，亞家族Ⅱ含4個子組。將EgrNAC1與不同子組的擬南芥NAC蛋白序列聯(lián)配后構建進化樹進行聚類分析，結果表明EgrNAC1屬于亞家族Ⅰ類ATAF子組(圖2)。Nakashima等(2012)則對不同植物中響應逆境脅迫的NAC類轉錄因子SNAC(stress-responsive NAC)基于進化關系進行了分類，按照這種分類模式，EgrNAC1屬于SNAC-A亞類(Nakashimaetal., 2012)。

圖2 EgrNAC1在不同NAC子類中的分類Fig.2 Classification of EgrNAC1 in NAC subgroups

2.2EgrNAC1啟動子順式作用元件分析

MatInspector軟件對EgrNAC1啟動子序列分析結果表明，在其啟動子序列上含有大量參與植物生長發(fā)育、代謝調控以及逆境響應相關的順式作用元件。其中，可能與逆境響應相關的有脫落酸響應元件(ABRE)、MYB轉錄因子結合序列(MBS)、MYC蛋白結合序列(MCS)、WRKY轉錄因子結合元件(W-BOX)、熱擊蛋白結合元件(HSE)、NAC蛋白結合序列(NACR)、干旱應答元件(DREB)、乙烯響應元件(ERE)及茉莉酸甲酯響應序列(JARE)等，而且部分元件數(shù)目眾多(表2)。

2.3EgrNAC1蛋白的亞細胞定位

盡管大部分NAC蛋白都屬于轉錄因子，為核定位蛋白，但仍有部分NAC基因家族成員，其編碼產物含有跨膜域，具有膜定位的屬性(Kimetal., 2010)。EgrNAC1融合GFP序列構建表達載體，用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞的結果發(fā)現(xiàn)，EgrNAC1蛋白僅在細胞核中表達(圖3)，與其不具備跨膜結構域的預測相呼應，其應該僅參與核內基因表達調控作用。

2.44℃不同處理時間EgrNAC1基于數(shù)字表達譜的基因共表達分析

4 ℃不同處理時間(0，2，6，12，24，48 h)數(shù)字表達譜中，隨處理時間延長，EgrNAC1基因在葉片中的表達受到強烈誘導，0，2，6，12，24，48 h的RPKM(Reads Per Kilobase per Million mapped reads，每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù))值分別為10.15，18.89，215.28，1 094.90，1 295.44，1 755.42，48 h處理的植株葉片RPKM值為對照(0 h)的173倍。將差異表達基因(11 458個)與EgrNAC1進行共表達分析，獲得與EgrNAC1表達高度相關(Pearson系數(shù)corgt;0.9)基因有128個，占差異表達基因總數(shù)的1.1%。表3中為相關系數(shù)最高的20個基因，其中包括6個轉錄因子基因，即5個NAC轉錄因子基因和1個AP2基因。

表2 EgrNAC1啟動子順式作用元件分析Tab.2 List of cis-elements in the promoter of EgrNAC1

2.54℃不同時間、不同溫度、干旱、高鹽、ABA以及茉莉酸甲酯處理對EgrNAC1基因表達的影響

4 ℃不同處理時間(0，2，6，12，24，48 h)下EgrNAC1基因實時熒光定量 RT-PCR分析結果也表明，該基因隨4 ℃處理時間延長，誘導水平不斷提高，處理48 h后基因表達量是對照處理(0 h)的163倍(圖4b)，與數(shù)字表達譜數(shù)據相吻合。同時，不同低溫(-8，-4，0，4，8 ℃)和高溫(42 ℃)處理中，相對于25 ℃正常生長溫度(CK)，不同低溫條件下EgrNAC1基因表達水平都大幅度增強，4 ℃處理和8 ℃處理2 h葉片中EgrNAC1表達水平分別達到了對照(25 ℃)的9.1倍和11.1倍；而高溫(42 ℃)處理卻能抑制EgrNAC1基因表達，處理2 h后，基因表達水平僅為對照的0.13倍(圖4a)。

圖3 EgrNAC1的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of EgrNAC1

干旱處理1天后，EgrNAC1表達水平為未進行干旱處理的7.2倍，而隨著處理時間延長，其表達水平又有所下降，處理第5天時，下降為對照的2.68倍，但仍處于誘導狀態(tài)。鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl)對EgrNAC1的誘導作用需要較長時間，處理48 h后，EgrNAC1表達水平才有較為明顯的上升，在72 h處理時誘導效應表現(xiàn)強烈。EgrNAC1對100 μmol·L-1脫落酸(ABA)的誘導效應也需要24 h才能體現(xiàn)出來； 而100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)對EgrNAC1的誘導在2 h后就已發(fā)生，而且這種誘導作用比較穩(wěn)定，24 h內沒有隨時間延長而發(fā)生較大幅度變動(圖5)。

表3 4 ℃不同處理時間共表達分析中與EgrNAC1表達相關性最強的20個基因Tab.3 Top 20 genes for the co-expression analysis of EgrNAC1 under time course treatment at 4 ℃

圖4 不同溫度(a)和4 ℃不同時間(b)處理下EgrNAC1的相對表達差異Fig.4 Relative expression of EgrNAC1 under different temperatures (a) and time course treatment at 4 ℃ (b)

圖5 干旱、高鹽、ABA和MeJA處理下EgrNAC1的相對表達差異Fig.5 Relative expression of EgrNAC1 under drought, high salinity, ABA and MeJA treatments

3 討論

NAC基因家族中，有約20%～25%的成員參與至少1種以上逆境因子響應(Puraniketal., 2012)。而且，基于蛋白質序列的系統(tǒng)進化分類中，參與逆境響應的NAC類轉錄因子往往同屬于一個子類(Fangetal., 2008; Leetal., 2011; Wangetal., 2016)。在Ooka等(2003)的分類系統(tǒng)中EgrNAC1屬于Ⅰ類亞家族ATAF子組，同時也屬于基于逆境脅迫NAC分類中的SNAC-A亞類。而擬南芥、水稻ATAF子組中基因基本都屬于SNAC-A亞類(Ookaetal., 2003; Nakashimaetal., 2012)。ATAF子組中的代表基因ATAF1在擬南芥中是逆境脅迫響應中的一個負調控因子，其表達水平被干旱、高鹽和機械損傷所誘導，擬南芥超表達ATAF1會提高植株對干旱、鹽、ABA和氧化脅迫的敏感性 (Luetal., 2007; Wuetal., 2009)。但是，ATAF1超表達轉基因水稻植株則能提高其對鹽脅迫的耐受性(Liuetal., 2016)。暗示了該NAC轉錄因子在調控植物應對逆境脅迫響應中的復雜性。ATAF子組中水稻NAC轉錄因子基因OsNAC5和OsNAC6超表達轉基因植株和對照相比，抗旱、耐低溫和耐鹽程度則都得到不同程度提升(Takasakietal., 2010; Songetal., 2011)。由此可見，進化上即使親緣關系較近的NAC轉錄因子在不同物種中，參與逆境響應的功能也有很大差異?；谄湓谀婢趁{迫響應中的重要性，對不同植物中逆境相關的NAC轉錄因子進行深入研究是非常必要的。

EgrNAC1蛋白序列具有典型NAC結構域，結構域中含有DNA結合結構域和核定位序列，這些都是轉錄因子的明顯特征。植物中部分NAC蛋白在C末端還存在跨膜結構域，負責蛋白的質膜和內質網膜錨定作用，它們參與轉錄調控的同時，還參與環(huán)境信號響應和細胞分裂調控作用(Kimetal., 2010; Lietal., 2016)。但無論跨膜域預測結果還是亞細胞定位試驗，都表明EgrNAC1不具備跨膜結構域，其應該是一個在細胞核內發(fā)揮基因調控作用的轉錄因子。

干旱、低溫和高鹽都對EgrNAC1基因表達具有誘導作用。2 h處理條件下，不同低溫(-8，-4，0，4，8 ℃)相對于正常溫度對EgrNAC1都有明顯誘導作用，而且在較高低溫(8 ℃)下即產生明顯響應，當溫度降至0 ℃以下時，誘導水平反而有所下降，暗示EgrNAC1基因表達對低溫有比較強的敏感性，這對植物提前感知低溫，在生理上提高低溫適應能力，降低低溫傷害具有重要意義。4 ℃不同時間(0，2，6，12，24，48 h)處理下，隨時間延長，EgrNAC1基因誘導水平持續(xù)增強； 鹽脅迫條件下，EgrNAC1基因響應速度則比較慢，處理72 h后，誘導效應才有明顯體現(xiàn)； 而干旱處理下，EgrNAC1的誘導表現(xiàn)出先強后弱的特點。另外，高溫(42 ℃)處理對EgrNAC1有抑制作用。這些都說明EgrNAC1廣泛參與了非生物逆境脅迫響應過程，但不同逆境中，其參與調控的途徑和方式可能有很大不同。

非生物逆境響應中，ABA和MeJA 2種激素具有重要作用，很多逆境響應相關基因都與它們有密切關系(Turneretal., 2002; Wasternack, 2007; Agarwaletal., 2010)，NAC類轉錄因子也不例外(Chenetal., 2014)。ATAF1，OsNAC5和OsNAC6基因表達都受ABA和MeJA誘導(Luetal., 2007; Takasakietal., 2010)。EgrNAC1表達在MeJA處理2 h后就受到穩(wěn)定誘導，而ABA對基因的誘導則需要24 h。結合其他非生物逆境處理下EgrNAC1的表達情況，說明不同逆境響應中，該基因對這2種激素信號的反應可能也是不同的。

另外，EgrNAC1啟動子上的順式作用元件在一定程度上也說明該基因與非生物逆境脅迫關系密切。DREB上結合的轉錄因子往往參與干旱和低溫逆境響應(Agarwaletal., 2006)； 植物中相當數(shù)量的MYB和MYC蛋白參與干旱、低溫和ABA調控基因的表達(Abeetal., 1997)，而EgrNAC1啟動子上的MBS和MCS元件分別有7個和5個； 與WRKY轉錄因子結合的W-BOX序列也有5個，WRKY在非生物逆境因子和生物逆境因子響應的基因表達調控中都發(fā)揮重要作用(Eulgemetal., 2007; Chenetal., 2012)； 與ERE相結合的乙烯響應蛋白則可能從正、負2個方向調控下游逆境相關基因表達(Fujimotoetal., 2000)； ABRE和JARE元件的存在則呼應了EgrNAC1基因在ABA和MeJA處理下的表達情況。另外，其他NAC類轉錄因子也可能參與EgrNAC1調控，因為在EgrNAC1啟動子上也存在NACR元件。

基因共表達分析在一定程度上可以揭示基因間的關系，對研究基因功能和調控機制具有重要意義(Aokietal., 2007; Maoetal., 2009)。在低溫不同處理中，參與葉綠體淀粉降解、LEA蛋白積累、果膠分解、多囊泡體轉運等的基因，以及有5個NAC和1個AP2轉錄因子基因與EgrNAC1基因協(xié)同表達關系非常強。這些基因涉及的代謝途徑都與非生物逆境脅迫有密切關系，如葉綠體淀粉酶在冷脅迫下可促進葉綠體淀粉降解，提高葉片中可溶性糖含量，增強植物抗寒性(Nagaoetal., 2005)。LEA在低溫、干旱等逆境下發(fā)揮清除氧自由基、穩(wěn)定膜結構的功能(Shaoetal., 2005)。ESCRT(endosomal sorting complex required for transport，內體蛋白分選復合物)則在多囊泡體蛋白轉運尤其是泛素化蛋白分揀中有重要功能，與逆境下細胞代謝平衡關系密切(Reyesetal., 2011)。CBS結構域蛋白具有AMP(腺苷一磷酸)激活的蛋白激酶活性，參與鹽脅迫的SOS信號轉導途徑(Kushwahaetal., 2009)。ARM重復蛋白在植物激素信號傳遞和抗病反應中發(fā)揮重要功能(Samueletal., 2006)。此外，巨桉中多個其他NAC轉錄因子和AP2轉錄因子基因與EgrNAC1的共表達關系，暗示了NAC類轉錄因子在逆境脅迫中參與基因調控的復雜性。這些信息為EgrNAC1基因在低溫逆境下參與的基因和代謝途徑調控研究提供了線索，為進一步對其逆境條件下在桉樹中所發(fā)揮功能的研究指明了方向。

4 結論

EgrNAC1屬于典型NAC類轉錄因子，基于蛋白序列的聚類分析表明其屬于參與逆境脅迫響應的子類成員。低溫逆境下EgrNAC1基因共表達分析，不同非生物逆境及ABA、MeJA處理下的表達變化，都暗示EgrNAC1參與了低溫、干旱和高鹽脅迫響應，并可能與ABA、MeJA信號轉導有交叉互作效應。

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(責任編輯 徐 紅)

TheStructureandExpressionofEgrNAC1GeneAssociatedwithStressResponseinEucalyptusgrandis

Sun Lijuan Wang Xiaorong Ni Xiaoxiang Cheng Longjun

(TheStateKeyLaboratoryofSubtropicalSilvicultureZhejiangAamp;FUniversityHangzhou311300)

【Objective】 NAC(NAM，ATAF and CUC2 proteins) is a family of special transcriptional factors in plants. The members in this family play important roles in life process of plants such as growth, development, signal transduction of hormones and stress responses.In order to provide more clues for further studies of the functions ofEgrNAC1(Eucgr.I00058) gene, which possibly plays a very important role inEucalyptusgrandis, EgrNAC protein sequence, subcellular localization, gene expression under low temperature, high temperature, drought, salinity, ABA and MeJA were analyzed.【Method】 Firstly, sequences of gene, promoter, and protein ofEgrNAC1 were downloaded from genome database ofEucalyptusgrandis. Then, bioinformatics software of SMART, MatInspector, and MEGA were applied to analyze the coding protein structure and cis-elements in promoter ofEgrNAC1. EgrNAC1∷sGFP fused expression vector was also constructed with enzyme cutting method in the primary vector of pCAMBIA1300. And, the plasmid of EgrNAC1∷sGFP was transformed into onion epidermal cells via gene gun bombardment to identify subcellular localization of EgrNAC1 protein. Secondly, with the DGE (digital gene expression) data from the treatment of different time course under 4 ℃ with 3-month-old seedlings, genes co-expression withEgrNAC1 were analyzed with WGCNA software. Finally, to get more information of expression pattern ofEgrNAC1 under different abiotic stress conditions, expression ofEgrNAC1 under different temperatures (-8, -4, 0, 4, 8 ℃), time courses(0，2，6，12，24，48 h)at 4 ℃, high temperature (42 ℃), drought, salinity, ABA and MeJA were evaluated by real time fluorescence quantitative RT-PCR method .【Result】 The NAC domain in EgrNAC1 contains 5 classical sub-domains A, B, C, D and E, including 2 α-helix and 5 β-sheets. There was also one nuclear localization sequence but no transmembrane region was found in the protein sequence. Phylogenetic analysis result showed that EgrNAC1 was classified into ATAF group in subfamilyⅠof NAC. In the NACs that were involved in stress responses, it belongs to SNAC-A subclass. ABRE, MBS, MCS, DREB and other cis-elements were found in the promoter ofEgrNAC1 and most of them are related with abiotic stresses.Result of EgrNAC1 merged protein with GFP in onion cells showed the EgrNAC1 mainly expressed in the nuclear. InEgrNAC1 co-expression analysis under treatment of different time courses(0，2，6，12，24，48 h)at 4 ℃, among the 20 genes with the highest correlation coefficients,most were involved in the stress responses.EgrNAC1 was induced under the low temperature. The expression level of it increased with the time course under 4 ℃ treatment. For different low temperature treatments, the improvement ofEgrNAC1 expression was higher under 4, 8 ℃ compared to the other low temperature. The induction ofEgrNAC1 were also found under treatment of drought, high salinity (200 mmol·L-1NaCl), ABA(100 μmol·L-1) and MeJA(100 μmol·L-1). After 1-day treatment of drought stress,EgrNAC1 expression level increased, followed by a slow decrease. It only needs 2 hours to stimulateEgrNAC1 expression under MeJA treatment, but for the induction by ABA, it needs 24 hours.【Conclusion】EgrNAC1 is an important NAC gene which is not only involved in responses to abiotic stresses such as low temperature, drought, high salinity, but also possibly have interactions with ABA and MeJA hormone signal transduction in these stress responses.

Eucalyptusgrandis； NAC gene； abiotic stress； gene expression

10.11707/j.1001-7488.20171007

2017-01-25；

2017-03-13。

國家自然科學基金項目(31270657)； 浙江省科技廳林木新品種選育重大科技專項“沿海防護林重點樹種高抗品種選育”(2016C02056-9)。

*程龍軍為通訊作者。

S718.46

A

1001-7488(2017)10-0060-10