劉紹偉 王 洋 田喜鳳

華北理工大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原生物學學科 河北唐山 063000

藍氏賈第鞭毛蟲α-4賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒構(gòu)建

劉紹偉 王 洋 田喜鳳

華北理工大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原生物學學科 河北唐山 063000

①目的 構(gòu)建α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒，為賈第素功能的研究奠定基礎(chǔ)。②方法 從α-4賈第素克隆載體pGM-T-α-4中雙酶切獲得α-4賈第素編碼序列，與酵母表達質(zhì)粒pGBKT7在DNA連接酶的作用下進行重組，重組載體通過熱休克法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，大腸桿菌經(jīng)過培養(yǎng)、篩選，堿裂解法提取質(zhì)粒酶切鑒定獲得pGBKT7-α-4誘餌載體。并對誘餌載體進行自激活驗證，利用Western blot鑒定誘餌蛋白的表達情況。③結(jié)果 經(jīng)酶切和測序鑒定，獲得了pGBKT7-α-4誘餌載體。轉(zhuǎn)化子Y187酵母細胞在SD/-Trp平板上能夠生長；而在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade平板上不能生長。說明pGBKT7-α-4質(zhì)粒無自我激活作用。Western blot鑒定結(jié)果顯示，pGBKT7-α-4轉(zhuǎn)化酵母菌在52KD 水平位置可檢測到α-4 融合C-Myc蛋白的表達。④結(jié)論 構(gòu)建α-4賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒。誘餌蛋白質(zhì)粒無自我激活作用，在酵母菌株中表達良好，為賈第素功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

α-4賈第素 構(gòu)建誘餌蛋白質(zhì)粒 酵母雙雜交

藍氏賈第鞭毛蟲是一種原始的單細胞真核生物，常引起賈第蟲病[1]。賈第蟲病通過糞口途徑傳播，患者通過飲用含有賈第蟲包囊的水感染，賈第蟲病具有傳染性強，發(fā)病率高的特點，在醫(yī)療衛(wèi)生條件較差的國家和地區(qū)常呈爆發(fā)性流行。鞭毛、腹吸盤等與賈第蟲感染過程密切相關(guān)，主要由細胞骨架構(gòu)成。而賈第素是賈第蟲特有的骨架蛋白[2,3]，在致病過程中起著重要的作用，可分成α、β、γ、δ四大類[4～6]，其中最大的一族是α賈第素。目前，大部分賈第素的定位已經(jīng)清楚，但每種α賈第素的具體功能尚未明晰[7]。

在生物體內(nèi)，任何一種細胞骨架蛋白需要與其他蛋白接觸聯(lián)合發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)相互作用的研究可以對生命活動有更好的認識。酵母雙雜交技術(shù)是近年來研究蛋白質(zhì)的一種重要方法[8]。

本研究利用酵母雙雜交技術(shù)，構(gòu)建α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒，為α-4賈第素功能的研究提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 菌株和質(zhì)粒；pGBKT7質(zhì)粒購自Clontech公司，大腸桿菌菌株XL1-Blue儲存于本實驗室；Mate & PlateTM文庫構(gòu)建試劑盒購自Clontech公司；DNA片段凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自百泰克公司； EcoRⅠ、T4 DNA連接酶，限制型內(nèi)切酶 NdeⅠ購自NEB公司；瓊脂糖凝膠購自BIOWEST公司；蛋白酶抑制劑cocktail、細胞裂解液、PMSF購自生工生物公司；HRP標記羊抗鼠IgG抗體、低背景化學發(fā)光檢測試劑盒、小鼠抗c-Myc標簽單克隆抗體購自康為世紀公司；酵母提取物、胰化蛋白胨購自O(shè)xoid公司；卡那霉素購自Sigma公司；氯化鈣、無水乙醇等均購于天津北科天津北科化學有限責任公司。自配試劑：LB培養(yǎng)基、PBS緩沖液、50×TAE電泳緩沖液、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、4×SDS凝膠加樣緩沖液、4×轉(zhuǎn)移緩沖液。

1.2儀器 倒置顯微鏡CKX31、超凈工作臺ZHJH-C1112B、臺式低溫高速離心機3K30、臺式低溫高速離心機Heraeus X1R、恒溫水浴箱HH-W、CO2孵箱2406、低溫循環(huán)水浴、超微量核酸蛋白測定儀Scandrop2000、PCR擴增儀T100、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-6C、凝膠成像系統(tǒng)92-1292、高壓蒸汽滅菌鍋SQ510C、氣浴振蕩搖床ZHWY-100D。

1.3實驗方法

1.3.1α-4賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建 α-4克隆質(zhì)粒PGM-T-α-4和pGBKT7 載體經(jīng)EcoRⅠ和NdeⅠ酶切作用，酶切產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離，利用DNA片段膠回收試劑盒，回收pGBKT7 載體和α-4 賈第素基因。α-4 賈第素基因與pGBKT7 載體在DNA連接酶作用下進行重組。重組載體轉(zhuǎn)化XL1-blue感受態(tài)大腸桿菌。大腸桿菌經(jīng)過培養(yǎng)，堿裂解法小量提取質(zhì)粒。

1.3.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和NdeⅠ酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物。獲得的質(zhì)粒進行測序。正確重組質(zhì)粒命名為pGBKT7-α-4，其對應的菌液繼續(xù)增菌培養(yǎng)，利用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒并純化、備用。

1.3.3α-4賈第素自激活實驗 pGBKT7-α-4質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化感受態(tài)的酵母細胞中，獲得轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子分成3份涂于不同平板上，1/3 涂在SD/-His/-Leu/-Trp，1/3 涂在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp，最后1/3 涂在SD/-Leu/-Trp上。30℃培養(yǎng)3～5天，觀察菌落生長情況。缺陷性平板篩選轉(zhuǎn)化子。

1.3.4Western Blot 驗證誘餌蛋白的表達 pGBKT7-α-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母，經(jīng)培養(yǎng)后，裂解轉(zhuǎn)化酵母細胞，收集裂解產(chǎn)物，其中包含裂解蛋白質(zhì)。Western blot檢測誘餌蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1α-4賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建 從α-4賈第素克隆載體pGM-T-α-4經(jīng)NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切下來的α-4賈第素全長基因與pGBKT7載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切作用。電泳結(jié)果顯示，克隆1、2分別在約900bp出現(xiàn)了目的基因片段，在約7.3kb出現(xiàn)了pGBKT7載體片段，提示構(gòu)建成功。經(jīng)測序，證實連入的確實為α-4賈第素基因，見圖1。

注：Marker：DNA分子量標準；1：克隆1；2：克隆2

圖1重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和NdeⅠ酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳分離結(jié)果

2.2自激活實驗結(jié)果 將對照質(zhì)粒和重組質(zhì)粒小量轉(zhuǎn)化Y187，轉(zhuǎn)化子鋪板，3天后觀察。陽性對照pCL1 在缺陷培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化酵母菌能夠生長，見圖2。陽性對照 (pGBKT7-53和pGADT7-T)，在缺陷培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化酵母菌均有克隆生長，見圖3。陰性對照(pGBKT7)轉(zhuǎn)化酵母菌在SD/-Trp平板上生長；但在缺乏組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)平板上，基本上不生長，見圖4。實驗組 pGBKT7-α-4轉(zhuǎn)化酵母菌在SD/-Trp平板上生長；但在缺乏組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)平板上，基本上不生長。說明pGBKT7-α-4質(zhì)粒無自我激活作用，見圖5。

注：A：SD/-Leu；B：SD/-Leu/-His；C：SD/-Leu/-Ade

圖2在缺陷培養(yǎng)基上pCL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌的成長情況

注：A：SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade；B：SD/-Trp/-Leu

圖3陽性對照(pGBKT7-53和pGADT7-T)共轉(zhuǎn)化酵母菌在缺陷培養(yǎng)基上的生長情況

注：A：SD/-Trp；B：SD/-Trp/-His；C：SD/-Trp/-Ade

圖4缺陷培養(yǎng)基上pGBKT7轉(zhuǎn)化酵母菌的生長情況

注：A：SD/-Trp；B：SD/-Trp/-His；C：SD/-Trp/-Ade

圖5重組載體pGBKT7-α-4的自激活實驗結(jié)果

2.3重組載體pGBKT7-α-4的表達情況鑒定 采用western blot鑒定pGBKT7-α-4在酵母菌中的表達情況。結(jié)果顯示，實驗組在 52 KD 水平可檢測到α-4X融合C-Myc蛋白的表達?？蛰d體對照組可在20KD左右處檢測到C-Myc-Tag蛋白的表達，見圖6，證明重組載體表達良好。

圖6 Western blot鑒定pGBKT7-α-4在Y187酵母菌中的表達

3 討論

賈第素是賈第蟲特有的骨架成分[2,3]，與賈第蟲的致病性關(guān)系密切[9～12]。賈第素蛋白成員眾多，其中α賈第素家族是其中最大的一族，共有21個成員，其大部分成員的具體功能未知[7]。本研究主要探索α-4 賈第素的功能，以便了解賈第蟲的致病機理。

酵母雙雜交技術(shù)是應用較為廣泛的研究方法，在研究中具有很多的優(yōu)勢[13,14]，所以，在蛋白質(zhì)的研究[15～17]、基因的研究[18～20]、蛋白連鎖圖的建立[21,22]、藥物及其作用位點[23]、抗原抗體反應[24]、病毒[25～27]、寄生蟲[28]等的研究中被廣泛應用。利用酵母雙雜交技術(shù)進行α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒構(gòu)建和自激活功能的研究，為最終通過賈第素相互作用蛋白以證實賈第素功能的研究奠定基礎(chǔ)。

若要構(gòu)建α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒，首先需要獲得α-4 賈第素基因與pGBKT7 載體。本研究利用α-4克隆質(zhì)粒PGM-T-α-4和pGBKT7 質(zhì)粒在雙酶切作用下分別獲得α-4 賈第素基因和 pGBKT7 載體編碼序列，并對其進行回收。重組后，轉(zhuǎn)化XL1-blue 感受態(tài)大腸桿菌中。經(jīng)過培養(yǎng)、篩選、提取，獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后，其正確性仍需進行驗證。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后電泳分離，從研究結(jié)果來看，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切電泳顯示，克隆1、2分別在約900bp出現(xiàn)了目的基因片段，在約7.3kb出現(xiàn)了pGBKT7載體片段，提示本次α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒構(gòu)建成功。為更進一步精確驗證重組質(zhì)粒的正確性，本研究還采用基因測序的方法，再次對質(zhì)粒進行測序驗證。經(jīng)測序證實連入的確實為α-4賈第素基因。含有pGBKT7-α-4質(zhì)粒的大腸桿菌繼續(xù)增菌培養(yǎng)，最后經(jīng)菌體破壞、收集、提取、純化獲得pGBKT7-α-4質(zhì)粒。

α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒是否能滿足實驗要求，除質(zhì)粒構(gòu)建成功外，需進行自激活能力的驗證，以排除自激活帶來的假陽性的發(fā)生[29]。除此之外，成功轉(zhuǎn)化的酵母菌株誘餌蛋白能夠正常表達。這兩個條件缺一不可。將對照質(zhì)粒和重組質(zhì)粒小量轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)種在缺陷培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，觀察菌落生長情況。

從培養(yǎng)結(jié)果可以看出，pCL1質(zhì)粒由于含有編碼亮氨酸(Leu)和野生型 GAL4的基因，因此不需要外界提供Leu、組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)，在相應的缺陷培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化菌可以生長。因此，在SD/-Leu，SD/-Leu/-His，SD/-Leu/-Ade 平板上，轉(zhuǎn)化酵母菌均有生長，和預期一致。

在酵母細胞內(nèi)，pGBKT7-53可表達GAL4 BD domain和鼠p53的融合蛋白，pGADT7-T表達GAL4 AD domain和large T-antigen的融合蛋白，兩融合蛋白通過BD-AD相互結(jié)合，p53和SV40 large T-antigen發(fā)揮激活活性，報告基因表達組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)，接種到缺陷培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化菌可以生長。從培養(yǎng)結(jié)果可以看出，在缺陷培養(yǎng)基上pGBKT7-53和pGADT7-T轉(zhuǎn)化酵母菌均能生長，和預期一致。

pGBKT7 質(zhì)粒能夠表達色氨酸(Trp)，不能表達組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)。因此，不需要外界提供Trp，將轉(zhuǎn)化菌接種到缺Trp培養(yǎng)平板上，可以生長。轉(zhuǎn)化菌接種到缺乏His或Ade的培養(yǎng)平板上，不能生長。從培養(yǎng)結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)化酵母菌在SD/-Trp平板上生長；但在缺乏組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)平板上，基本不生長，和預期一致。

實驗組pGBKT7-α-4質(zhì)粒由于含有編碼色氨酸(Trp)的基因，不需要外界提供Trp，將轉(zhuǎn)化菌接種到缺乏Trp的培養(yǎng)平板上，可以生長。若pGBKT7-α-4質(zhì)粒無自激活作用，則報告基因不會激活，也就不能表達組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)，在相應缺陷培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化菌則不能生長。因此，在SD/-Trp平板上，轉(zhuǎn)化酵母菌有生長；而在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade平板上，轉(zhuǎn)化菌不能生長。說明pGBKT7-α-4質(zhì)粒無自我激活作用。

將α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的酵母菌株中，經(jīng)過培養(yǎng)后，進行裂解，收集裂解產(chǎn)物。檢測誘餌蛋白的表達。經(jīng)證實實驗組和對照組分別在52KD 、20KD水平檢測到α-4 融合 C-Myc蛋白和C-Myc-Tag蛋白的表達，證明重組載體表達良好。

通過本次研究，利用酶切作用對α-4克隆質(zhì)粒PGM-T-α-4和pGBKT7 質(zhì)粒進行酶切獲得α-4 賈第素基因和 pGBKT7 載體片段，并利用DNA連接酶進行基因重組，經(jīng)過大腸桿菌轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、質(zhì)粒提取，最終成功構(gòu)建α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒。α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒無自我激活作用；在酵母菌株中表達良好。為賈第素功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

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(2017-09-16 收稿)(庫雪飛 編輯)

Constructionofα-4giardindecoyproteinparticles

LIUShaowei,WANGYang,TIANXifeng

(PathogenicBiology,CollegeofElementaryMedicine,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ObjectiveConstruction ofα-4 giardin decoy protein particles.In order to study the function of giardin.MethodsThe α-4 giardin encoding sequence was obtained by double enzyme digestion from the α-4 giardin cloning vector pGM-T-α-4. Under the action of DNA ligase, the α-4 giardin coding sequence was combined with the yeast expression plasmid pGBKT7. The recombinant plasmid transformed the competent cells of escherichia coli by heat shock. Coli was cultured and screened.Finally,the plasmid was extracted by alkaline lysis and identified by enzyme digestion.The pGBKT7-α-4 decoy vector was obtained.In addition, the self activation capability of bait vector was verified,and the expression of bait protein was identified by wstern blot.ResultsThe pGBKT7-alpha-4 decoy vector was obtained by restriction enzyme digestion and sequencing.Transformants Y187 yeast cells could grow on SD/-Trp plates, but not on SD/-Trp/-His and SD/-Trp/-Ade plates. Therefore, there was no self activation of pGBKT7-α-4 plasmid.Western blot identification showed that the expression ofα-4 fusion C-Myc protein could be detected at the level of 52KD in pGBKT7-α-4 transformed yeast.ConclusionSuccessful construction of α-4 giardin decoy protein particles.The bait protein granules show no self activation and are well expressed in yeast strains.It lays a foundation for the study of giardin function.

α-4 giardin.Construction of bait protein particles.Yeast two hybrid

R 37

A

2095-2694(2017)06-421-05

國家自然科學基金(編號：31471954)。

劉紹偉(1987- )，男，碩士研究生。研究方向：藍氏賈第鞭毛蟲α-4賈第素功能研究。

田喜鳳。