宋麗麗，張 日，潘迎英?，郜 曉

（1.張家港市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤血液科，江蘇 張家港 215600；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，江蘇 蘇州 215000）

不同化療方案對多發(fā)性骨髓瘤患者T細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響

宋麗麗1，張 日2，潘迎英?1，郜 曉1

（1.張家港市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤血液科，江蘇 張家港 215600；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，江蘇 蘇州 215000）

目的：探討不同化療方案對多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）患者T淋巴細(xì)胞亞群和相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響。方法：將2011年6月至2013年12月期間張家港市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤血液科收治的60例MM患者隨機分為硼替-地塞組（30例）和VAD-沙利組（30例）。為硼替-地塞組患者采用VD方案（硼替佐米+地塞米松）進(jìn)行化療，為VAD-沙利組患者聯(lián)合應(yīng)用改良的VAD方案（長春新堿+表柔比星+地塞米松）和沙利度胺進(jìn)行化療，并對比兩組患者治療的效果及治療前后其調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg)、輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)、IL-6（白細(xì)胞介素-6）、IL-17（白細(xì)胞介素-17）和TGF-β（轉(zhuǎn)化生長因子-β）的水平。結(jié)果：硼替-地塞組患者治療的總有效率高于VAD-沙利組患者，治療后其Treg的水平高于VAD-沙利組，其TH17、IL-6、IL-17的水平低于VAD-沙利組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：與聯(lián)合應(yīng)用改良的VAD方案和沙利度胺相比，用VD方案治療MM的臨床效果更好。

多發(fā)性骨髓瘤；硼替佐米；沙利度胺；細(xì)胞因子；輔助性T細(xì)胞17；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤。此病的發(fā)病原因主要是患者骨髓中的漿細(xì)胞發(fā)生異常的克隆性增生[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[2]，MM患者的血液循環(huán)中常存在T淋巴細(xì)胞與細(xì)胞因子的異常表達(dá)，前者主要包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg)和輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)等，后者主要包括白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)等。相關(guān)的臨床研究證實，Treg與Th17的水平與

MM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。為了對比用VD方案與聯(lián)合應(yīng)用改良的VAD方案和沙利度胺治療MM的臨床效果，筆者對張家港市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤血液科收治的60例MM患者進(jìn)行了對照研究。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象的納入標(biāo)準(zhǔn)

病情符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第三版）中規(guī)定的MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)。2）Durie-Salmon分期為Ⅰ期、Ⅱ期或Ⅲ期。

1.2 研究對象的臨床資料

選取2011年6月至2013年12月期間張家港市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤血液科收治的60例MM患者。將這60例患者隨機分為硼替-地塞組（30例）和VAD-沙利組（30例）。硼替-地塞組患者中有男24例，女6例；其年齡在58歲至72歲之間，平均年齡（64.2±3.7）歲；其中Durie-Salmon分期為Ⅰ期的患者有5例，為Ⅱ期的患者有18例，為Ⅲ期的患者有7例；其中血中M蛋白類型為IgG型的患者有12例，為IgA型的患者有8例，為IgM型的患者有5例，為輕鏈型的患者有5例。VAD-沙利組患者中有男23例，女7例；其年齡在58歲至70歲之間，平均年齡（63.1±2.6）歲；其中Durie-Salmon分期為Ⅰ期的患者有6例，為Ⅱ期的患者有18例，為Ⅲ期的患者有6例；其中血中M蛋白類型為IgG型的患者有14例，為IgA型的患者有6例，為IgM型的患者有3例，為輕鏈型的患者有7例。兩組患者的一般臨床資料相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.3 治療方法

為硼替-地塞組患者采用VD方案進(jìn)行化療。具體的化療方法是：1）在對患者進(jìn)行化療的第1天、第4天、第8天、第11天，使用1.3 mg/m2的硼替佐米（商品名：萬珂，由西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)）對其進(jìn)行靜脈推注，1次/d。2）在對患者進(jìn)行化療的第1天、第2天、第4天、第5天、第8天、第9天、第11天、第12天，使用20 mg/m2的地塞米松對其進(jìn)行靜脈滴注，1次/d。3）治療28天為1個周期，應(yīng)連續(xù)治療2個周期。為VAD-沙利組患者聯(lián)合應(yīng)用改良的VAD方案和沙利度胺進(jìn)行化療。具體的化療方法是：1）讓患者口服沙利度胺（商品名：反應(yīng)停，由常州制藥廠有限公司生產(chǎn)）進(jìn)行治療，開始用藥時每天服100 mg。然后，根據(jù)患者的耐受情況逐漸為其增加用藥量（每周最多增加50 mg），直至用藥量達(dá)到200 mg/d。2）將0.5 mg的長春新堿加入到20 ml的生理鹽水中，對患者進(jìn)行靜脈注射，1次/d。用藥時間為對患者進(jìn)行化療的第1天和第4天。3）將l0 mg的表柔比星加入到20 ml的生理鹽水中，對患者進(jìn)行靜脈注射，1次/d。用藥時間為對患者進(jìn)行化療的第1天和第4天。4）將40 mg的地塞米松加入到250 ml的生理鹽水中，對患者進(jìn)行靜脈滴注，1次/d。用藥時間為對患者進(jìn)行化療的第1天、第2天、第3天、第4天、第9天、第10天、第11天、第12天、第17天、第18天、第19天、第20天。5）治療28天為1個周期，應(yīng)連續(xù)治療2個周期。

1.4 檢測設(shè)備和試劑

1.4.1 檢測設(shè)備 本次研究所用的檢測設(shè)備主要包括：1）1.5 ml的微量離心管、2 ml的微量離心管、移液器和微量高速離心機（均由Eppendorf公司生產(chǎn)）。2）超凈工作臺（由蘇州凈化設(shè)備儀器廠生產(chǎn)）。3）37 ℃恒溫箱（由福意聯(lián)恒溫箱公司生產(chǎn)）。4）550酶標(biāo)儀（由Bio-rad公司生產(chǎn)）。5）COBAS INTEGRA 400 Plus型全自動生化分析儀（由Roche公司生產(chǎn)）。6）MDF-328E型低溫冰箱（由日本三洋公司生產(chǎn)）。7）FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（由美國Becton Dickinson公司生產(chǎn)）。

1.4.2 檢測試劑 本次研究所用的檢測試劑主要包括：1）CD3/CD4/CD8單克隆抗體、CD4/ CD25單克隆抗體、鼠抗人Foxp3型單克隆抗體、CD3單克隆抗體、CD8單克隆抗體、IL-17A單克隆抗體、同型對照IgG2a和同型對照IgG1（均由美國Becton Dickinson公司生產(chǎn)）。2）IL-6檢測試劑盒和IL-17檢測試劑盒（均由上海拜力生物科技有限公司生產(chǎn)）。3）TGF-β檢測試劑盒（由上海富眾生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）。

1.5 檢測方法

1.5.1 進(jìn)行Treg檢測和Th17檢測的方法 采用流式細(xì)胞技術(shù)對兩組患者Treg、Th17的水平進(jìn)行檢測。進(jìn)行Treg檢測的方法是：1）取兩支流式管，分別標(biāo)記為測定管和同型對照管。2）在這兩支流式管中均加入20μl的 CD4-FITC抗體。然后，將5μl的CD25-APC抗體加入到測定管中，并將等量的同型抗體加入到同型對照管中。3）在測定管和同型對照管中分別加入受檢者的細(xì)胞懸液100μl，避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液對這兩支流式管中的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心洗滌，然后棄去上清液。4）在這兩支流式管中加入固定液和破膜液，避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液重懸細(xì)胞。5）將20μl的Foxp3-PE抗體加入到測定管中，并將等量的同型抗體加入到同型對照管中，避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液對細(xì)胞懸液進(jìn)行離心洗滌，然后棄去上清液。6）使用0.3ml的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，然后使用流式細(xì)胞儀對流式管中Treg的含量進(jìn)行檢測。進(jìn)行TH17檢測的方法是：1）取兩支流式管，分別標(biāo)記為測定管和同型對照管。2）在這兩支流式管中均加入受檢者的細(xì)胞懸液100μl。然后，將20μl的CD4抗體（FITC標(biāo)記）和5 μl的CD3抗體（APC標(biāo)記）加入到測定管中，將等量的同型抗體加入到同型對照管中，避光孵育30min。3）孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液對這兩支流式管中的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心洗滌。棄去上清液后，用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，并對細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞染色。4）將染色后的細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，按標(biāo)準(zhǔn)工作濃度依次加入佛波酯、離子霉素和含莫能霉素的Golgistop蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑，吹打混勻后將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5h。5）將培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液重新置于測定管和同型對照管中，并在這兩支流式管中均加入固定液和破膜液，避光孵育30min。孵育結(jié)束后，使用PBS緩沖液對細(xì)胞懸液進(jìn)行離心洗滌。棄去上清液后，使用PBS緩沖液重懸細(xì)胞。6）將20μl的IL-17-PE抗體加入到測定管中，并將等量的同型抗體加入到同型對照管中，避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液對細(xì)胞懸液進(jìn)行離心洗滌，然后棄去上清液。7）使用0.3 ml的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，然后使用流式細(xì)胞儀對流式管中TH17的含量進(jìn)行檢測。

1.5.2 進(jìn)行IL-6、IL-17和TGF-β檢測的方法 采用ELISA雙抗體夾心法對兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β的水平進(jìn)行檢測（嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書中規(guī)定的實驗步驟進(jìn)行實驗操作）。

1.6 觀察指標(biāo)

觀察并對比兩組患者治療的效果及治療前后其Treg、Th17、IL-6、IL-17和TGF-β的水平。

1.7 療效評定標(biāo)準(zhǔn)

CR（完全緩解）：患者的腫瘤病灶消失。2）PR（部分緩解）：患者的腫瘤病灶縮小50%以上。3）MR（微效）：患者的腫瘤病灶縮小25%至50%。4）NC（穩(wěn)定）：患者的腫瘤病灶縮小不足25%。5）PD（進(jìn)展）：患者的腫瘤病灶未縮小，甚至在增大。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，患者Treg、Th17、IL-6、IL-17和TGF-β的水平用（±s）表示，采用t檢驗，治療的總有效率用%表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療效果的比較

硼替-地塞組患者中治療效果為CR的患者有10例（占33.3%），為PR的患者有7例（占23.3%），為MR的患者有2例（占6.7%），為NC的患者有9例（占30.0%），為PD的患者有2例（占6.7%）。硼替-地塞組患者治療的總有效率為93.3%（28/30）。VAD-沙利組患者中治療效果為CR的患者有3例（占10.0%），為PR的患者有11例（占36.7%），為MR的患者有1例（占3.3%），為NC的患者有5例（占16.7%），為PD的患者有10例（占33.3%）。VAD-沙利組患者治療的總有效率為66.7%（20/30）。與VAD-沙利組患者相比，硼替-地塞組患者治療的總有效率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 治療前后兩組患者Treg、Th17水平的比較

在進(jìn)行治療前，兩組患者Treg、Th17的水平相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)過2個周期的化療后，兩組患者Treg的水平均較治療前明顯升高，其Th17的水平均較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與VAD-沙利組患者相比，硼替-地塞組患者Treg水平升高的幅度和Th17水平降低的幅度均更大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 治療前后兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β水平的比較

在進(jìn)行治療前，兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β水平相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)過2個周期的化療后，兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β水平均較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與VAD-沙利組患者相比，硼替-地塞組患者IL-6水平和IL-17水平降低的幅度均更大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者TGF-β水平降低的幅度相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

表1 兩組患者治療效果的比較

表2 治療前后兩組患者Treg、Th17水平的比較 （ %，±s）

表2 治療前后兩組患者Treg、Th17水平的比較 （ %，±s）

注：▲與治療后比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；△與VAD-沙利組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。

組別 例數(shù) Treg的水平 Th17的水平治療前 治療后 治療前 治療后硼替-地塞組 30 3.48±1.20▲ 4.87±1.32△ 2.67±0.93▲ 1.73±0.91△VAD-沙利組 30 3.46±1.27▲ 4.35±1.22 2.64±0.97▲ 2.04±0.90

表3 治療前后兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β水平的比較 （ ±s）

表3 治療前后兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β水平的比較 （ ±s）

注：▲與硼替-地塞組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；△與治療前比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。

組別 例數(shù) IL-6(pg/ml) IL-17(pg/ml) TGF-β(ng/ml)治療前 治療后 治療前 治療后 治 療前 治療后硼替-地塞組 30 17.82±3.56 6.73±1.77△ 48.33±5.64 19.41±3.84△ 21.87±3.73 9.07±2.45△VAD-沙利組 30 17.14±3.48 8.15±1.90▲△ 48.25±5.57 23.27±3.91▲△ 21.29±3.84 8.83±2.75△

3 討論

MM是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤。此病的發(fā)病機制十分復(fù)雜。有研究指出，MM的發(fā)生、發(fā)展與電離輻射、慢性抗原刺激、免疫功能紊亂、EB病毒或皰疹病毒感染誘發(fā)的C-MYC、N-RAS、K-RAS或H-RAS密切相關(guān)。

Treg是一種同時具有免疫無能和免疫抑制兩大特性的T細(xì)胞亞群。臨床研究發(fā)現(xiàn)，MM患者Treg的水平與其病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[3]。Th17是一種以分泌IL-17為主要特征的T細(xì)胞亞群。Schmidmaier H等[4]在臨床研究中應(yīng)用流式細(xì)胞儀對MM患者外周血及骨髓中Th17的水平進(jìn)行檢測。研究結(jié)果顯示，MM患者外周血及骨髓中Th17的水平均明顯高于正常人。

IL-6是一種細(xì)胞因子，具有刺激初始CD4+T細(xì)胞向Th17分化的作用[5]。有研究指出，MM患者IL-6的水平明顯高于正常人，且其IL-6的水平與其病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[6]。Fulciniti M等[7]指出，IL-6是促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞生長的關(guān)鍵因子。

IL-17是Th17的主要效應(yīng)分子。2006年，Alexandrakis MG等[8]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，MM患者IL-17的水平明顯高于正常人，且其IL-17的水平與其病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。TGF-β是一種具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化作用的細(xì)胞因子[9]。研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中都可以檢測到TGF-β的mRNA[10]。

硼替佐米、地塞米松、長春新堿、表柔比星、地塞米松和沙利度胺均為臨床上常用的抗腫瘤藥物[11]。硼替佐米(bortezomib)屬于氨基硼酸衍生物，其商品名為萬珂。此藥能夠有效地抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和IL-6的活性，降低骨髓基質(zhì)細(xì)胞的粘附能力[12]。沙利度胺(Thalidomide)屬于谷氨酸衍生物，其商品名為反應(yīng)停。此藥具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性、抑制炎性細(xì)胞因子活性和誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)等作用，從而可有效地抑制骨髓瘤細(xì)胞的生長和增殖[13]。為了對比用VD方案（硼替佐米+地塞米松）與聯(lián)合應(yīng)用改良的VAD方案（長春新堿+表柔比星+地塞米松）和沙利度胺治療MM的臨床效果，筆者將2011年6月至2013年12月期間張家港市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤血液科收治的60例MM患者隨機分為硼替-地塞組和VAD-沙利組。為硼替-地塞組患者采用VD方案進(jìn)行化療，為VAD-沙利組患者聯(lián)合應(yīng)用改良的VAD方案和沙利度胺進(jìn)行化療。治療結(jié)束后，對比兩組患者治療的效果及治療前后其Treg、Th17、IL-6、IL-17和TGF-β的水平。本次研究的結(jié)果顯示，硼替-地塞組患者治療的總有效率高于VAD-沙利組患者，治療后其Treg的水平高于VAD-沙利組，其TH17、IL-6、IL-17的水平低于VAD-沙利組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，與聯(lián)合應(yīng)用改良的VAD方案和沙利度胺相比，用VD方案治療MM的臨床效果更好。

[1]King AJ, Gooding S, Ramasamy K.Managing multiple myelo ma in the over 70s:a review[J].Maturitas, 2015, 80(2):148-154.

[2]Dasgupta A, Saxena R.Regulatory T cells:a review[J].Natl Med J India, 2012, 25(6):341-351.

[3]Joao C, Costa C, Coelho I,et al.Long-term su rvival in mul tiple myeloma[J].Clin Case Rep, 2014, 2(5):173-179.

[4]Schmidmaier R, Oversohl N, Schnabel B,et al.Helper T cell s (CD3 + /CD4 + ) within the autologous peripheral blood stem cell graft positively correlate with event free sur vival of multiple myeloma patients[J].Exp Oncol, 2008,30(3):240-243.

[5]全麗娜, 劉愛春, 郭秀臣,等.B非霍奇金淋巴瘤患者Th17、Treg水平及Th17/Treg失衡的研究[J].實用腫瘤學(xué)雜志, 2013, 27(5):400-405.

[6]Schaffert H, Pelz A, Saxena A,et al.IL-17-producing CD4 T cells contribute to the loss of B-cell tolerance in ex perimental autoimmune myasthenia gravis[J].Eur J Immun ol, 2015, 45(5):1339-1347.

[7]Fulciniti M, Hideshima T, Vermot-Desroches C,et al.A hig h-affinity fully huma n anti-IL-6 mAb, 1339, for the tr eatment of multiple myeloma[J].Clin Cancer Res, 2009,15(23):7144-7152.

[8]Alexandrak is MG, Pappa CA, Miyakis S,et al.Serum interle ukin-17 and its relationship to angiogenic factors in multip le myel oma[J].Eur J Intern Med, 2006, 17(6):412-416.

[9]Nowak R, Kwiecien M, Tkacz M,et al.Transforming growth factor-beta (TGF- beta) signaling in paravertebral musc les in juvenile and adolescent idiopathic scoliosis[J].Biomed Res Int, 2014（2014）:594287-594287.

[10]Stephen TL, Rutkowski MR, Allegrezza MJ,et al.Transformi ng growth factor beta-mediated suppression of antitumo r T cells requ ires FoxP1 transcription factor expression[J].Immunity, 2014, 41(3):427-439.

[11]Soriani A, Fionda C, Ricci B,et al.Chemotherapy-elicited upregulation of NKG2D and DNAM-1 ligands as a therapeu ti c target in multiple myeloma[J].Oncoimmunology, 2013,2(12):e26663-e26663.

[12]李娟, 劉俊茹, 黃蓓暉,等.含硼替佐米的誘導(dǎo)化療序貫自體造血干細(xì)胞移植治療多發(fā)性骨髓瘤的療效和安全性[J].中華內(nèi)科雜志, 2012, 51(4):279-282.

[13]Mitsiades CS, Che n-Kiang S.Immunomodulation as a thera peutic strategy in the treatment of multiple myeloma[J].Crit Rev Oncol Hematol, 2013, 1(10):5-13.

R73

B

2095-7629-（2017）8-0064-04

宋麗麗，女，1983年12月出生，江蘇張家港人，主治醫(yī)師，碩士， 研究方向為血液疾病的診斷與治療

＊通訊作者：潘迎英