林裕勝 ， 江錦秀 ， 游 偉 ， 胡奇林

(福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 福建 福州 350013)

山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒和支原體混合感染山羊的診斷

林裕勝 ， 江錦秀 ， 游 偉 ， 胡奇林

(福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 福建 福州 350013)

2016年10月福州市一山羊養(yǎng)殖戶的山羊發(fā)病，經(jīng)臨床癥狀、剖檢病變及實驗室檢驗，確診為羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒(Enzooticnasaltumorvirus, ENTV)、綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae, Mo)和絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri,Mmc)混合感染引起的山羊呼吸道疾病，報告如下。

1 發(fā)病情況

福州市北峰一農(nóng)戶共飼養(yǎng)山羊150只，以山地放牧為主。2016年4月3日發(fā)現(xiàn)2只1歲左右山羊發(fā)病，表現(xiàn)為流鼻涕、咳嗽和呼吸困難，病羊被毛粗亂，采食量減少、消瘦，發(fā)病后期，羊鼻甲骨軟化，用手按即可凹陷。到9月11日，已有8只山羊發(fā)病，其中2～6 月齡羊發(fā)病6只，成年羊發(fā)病2只，其中1只面部腫脹。這次疫情共發(fā)病8只，發(fā)病率為5.3%，未出現(xiàn)死亡。該羊場發(fā)病早期已用青霉素、恩諾沙星、林可霉素、替米考星、氧氟沙星、卡拉霉素、頭孢菌素等抗生素進行治療，無明顯療效，2～3 d后又復發(fā)。

2 剖檢病變

剖檢2只病羊，發(fā)現(xiàn)肺臟與肋骨粘連，胸腔內(nèi)有少量積液，胸膜增厚，肺部一側(cè)呈“肉變”，肺小葉間質(zhì)明顯增寬，氣管和支氣管有大量黏液分泌。心包內(nèi)有清亮積液，心包膜增厚；鋸開鼻竇，可見左側(cè)鼻道內(nèi)有灰白色息肉狀物，與鼻黏膜相連，表面光滑，呈透明狀。質(zhì)地柔軟、易碎(見中插彩版圖1、圖2)。

3 實驗室檢驗

3.1 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Promega公司；PremixTaqTM聚合酶、DL-2 000 Marker，購自寶生物工程(大連)有限公司；動物組織/細菌DNA提取試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司；病毒RNA提取試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

3.2 引物設計 針對Mo P80基因、Mmc MLC_1760基因和山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae, Mccp)arcA基因序列，利用Primer 6.0軟件分別針對這3種病原設計特異性引物；ENTV、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida, Pm)和溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica, Mh)則直接采用參考文獻[1-2]所設計的特異性引物，見表1；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

表1 特異性引物

3.3 病料的處理 在生物安全柜內(nèi)對采集的鼻內(nèi)容物和肺臟經(jīng)剪碎、研磨，加0.01 mol/L pH值7.2 PBS(緩沖液)制成10%勻漿，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 病毒、支原體和細菌核酸的提取

3.4.1 病毒RNA提?。喝?00 μL病料研磨上清液加到1.5 mL離心管中，利用北京全式金生物技術(shù)有限公司病毒RNA提取試劑盒提取ENTV基因組RNA， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4.2 支原體和細菌DNA提?。喝? mL病料研磨上清液加入1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心3 min，棄上清收集菌體，利用生工組織/細菌DNA提取試劑盒提取支原體和細菌DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.5 RT-PCR及PCR檢測 按Progema公司RT-PCR試劑盒說明書進行，采用20 μL的反轉(zhuǎn)錄反應體系。

檢測ENTV PCR反應體系參考文獻[1]，以經(jīng)測序驗證的ENTV RNA作陽性對照，以Pm DNA作陰性對照。

檢測Mo、Mmc、Mccp多重PCR反應體系：PremixTaq10 μL，Mo上下游引物各1.3 μL，Mmc上下游引物各0.7 μL，Mccp上下游引物各1.0 μL，模板3 μL，無菌去離子水4 μL，混勻，進行短暫快速離心后進行擴增，反應條件為： 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、59 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，37個循環(huán)；72 ℃7 min，以Mo、Mmc和Mccp混合DNA作陽性對照，以Pm DNA作陰性對照。

3.6 檢測結(jié)果 用PCR對2只病羊病料進行ENTV、Mo、Mmc、Mccp檢測的結(jié)果顯示：2份樣品只檢測到Mo、Mmc和ENTV的特異性條帶，大小分別約為700 bp、300 bp和800 bp，Pm、Mh和Mccp均為陰性。結(jié)果見圖3、4。

圖3 Mo、Mmc、Mccp PCR檢測結(jié)果

圖4 ENTV PCR檢測結(jié)果

4 診斷結(jié)果

結(jié)合流行病學、臨床癥狀、剖檢病變及實驗室檢驗結(jié)果，確定該山羊養(yǎng)殖場山羊本次發(fā)病是由于ENTV、Mo和Mmc混合感染所致。

5 討論

山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤是由ENTV引起的一種慢性、進行性、接觸性傳染病，其臨床特征表現(xiàn)為呼吸困難，鼻漏，食欲減退，鼻內(nèi)單側(cè)或兩側(cè)增生；該病的發(fā)病率為0.5%～15%[3]，致死率為100%。Mo可引起羊支原體性肺炎，其臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、咳嗽、喘氣、漸進性消瘦、肺和胸膜發(fā)生漿液性和纖維素性炎癥, 臨床上呈急性或慢性經(jīng)過, 病死率一般為30%～50%, 有的高達80%～100%[4-5]。Mmc是羊支原體性肺炎的病原之一，此外還可引起乳房炎、角膜結(jié)膜炎和敗血病等[6]。近年來國內(nèi)多省市均有羊病混合感染的報道[6-8]，尚未見ENTV、Mo和Mmc混合感染的報道。

在本次病例中，我們對病料進行了PCR檢測，未檢測到Mccp、Pm和Mh，只檢測到了ENTV、Mo和Mmc，同時結(jié)合該病例臨床上主要表現(xiàn)為流鼻涕、咳嗽和呼吸困難，剖檢病變主要是胸腔積液，胸膜增厚，肺部 “肉變”，左側(cè)鼻道內(nèi)有灰白色息肉狀物，與鼻黏膜相連等特點，確認該病例是由ENTV、Mo和Mmc混合感染所致。關于支原體和細菌混合感染引起山羊呼吸道疾病的案例李璞君等已有報道[7]，但關于ENTV和支原體混合感染的病例尚未見報道，本病例表明，引起山羊呼吸道疾病的病原體已經(jīng)不單是支原體或者細菌的單一感染或者混合感染，已出現(xiàn)病毒和支原體混合感染的現(xiàn)象，使羊的疫病更加復雜化。

呼吸道疾病是一類制約當前山羊養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病，給山羊養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，當前能夠引起山羊呼吸道疾病的病原主要包括Mmc、Mccp、山羊支原體山羊亞種等絲狀支原體簇成員、Mh、Pm、Mo和ENTV[6 ]。本研究室近3年來對福建省送檢樣品的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，福建省當前引起山羊呼吸道疾病的支原體主要是Mo和Mmc，病毒主要是ENTV。推測可能與當前主要接種山羊傳染性胸膜肺炎疫苗，對Mo和Mmc等支原體缺乏有效保護有關。ENT在世界多個國家流行，導致嚴重的經(jīng)濟損失。近年來，我國湖南、內(nèi)蒙古、四川等地均有該病發(fā)生的報道。ENT具有接觸傳染性，病程長，臨床癥狀主要表現(xiàn)為呼吸困難，鼻漏，出現(xiàn)鼻內(nèi)單側(cè)或雙側(cè)性增生物，這與本研究病例相一致[1]。ENT是當前世界養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)中的一個難題，國內(nèi)外至今未分離到ENTV,同時，ENTV免疫應答的缺陷限制了該病疫苗的研究，國內(nèi)外還沒有ENTV的疫苗。因此，養(yǎng)殖戶在引種時加強監(jiān)控，做好檢驗檢疫和隔離等生物安全工作是預防該病的主要措施。對于該病的治療，有人通過外科手術(shù)摘除增生物，但這種方法費時費力，不適合于基層推廣應用。

綜上所述，ENTV、Mo和Mmc可混合感染山羊引起嚴重的呼吸道疾病，對山羊養(yǎng)殖業(yè)形成嚴重威脅。因此，在山羊養(yǎng)殖過程中，需要加強對羊支原體性肺炎尤其是 ENT的防控，對ENT，目前國內(nèi)外最有效的措施是凈化，通過撲殺病羊及帶毒羊的方法來控制該病。所以需要加強羊群的防疫工作，提高山羊的飼養(yǎng)管理水平，避免天氣變化等因素造成的應激導致免疫功能降低從而感染ENTV。本文首次報道了福建省山羊混合感染ENTV、Mmc和Mo的臨床癥狀和剖檢病變等，為今后進行羊病的有效防治和開展流行病學調(diào)查等提供了理論依據(jù)。

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S855.1

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0529-6005(2017)10-0059-02

2017-02-07

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0500906)；公益類科研院所專項(2016R1022-10)；福建省科技創(chuàng)新平臺建設項目(2014N2003-5)；福建省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新團隊PI項目(2016PI-7)；福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所基金(MYQJ2015-3)

林裕勝(1988-)，男，研究實習員，碩士，主要從事動物傳染病研究，E-mail：369807285@qq.com

胡奇林，E-mail：hql562713@163.com