李亭亭，潘德鋒，朱紅

冠心病研究

血漿微小核糖核酸-1和微小核糖核酸-146b表達水平與急性ST段抬高型心肌梗死診斷及預后的相關性研究

李亭亭，潘德鋒，朱紅

目的：觀察早期急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者血漿微小核糖核酸（miR）-1和miR-146b表達水平的變化，探討其對急性STEMI的早期診斷價值和與患者預后的相關性。

方法：選取急性STEMI患者47例和健康對照受試者23例，在患者入院即刻、發(fā)病12 h（T12）、24 h（T24）、48 h（T48）、72 h（T72）、1周（T1W）收集血液標本并用實時定量聚合酶鏈式反應檢測血漿miR-1和miR-146b表達水平，同時收集患者對應時間點血漿心肌肌鈣蛋白（cTnT）水平，并與對照受試者進行對比。用受試者工作特征（ROC）曲線評估患者入院即刻血漿miR-1、miR-146b表達水平對急性STEMI的診斷價值；評估入院即刻血漿miR-1、miR-146b表達水平與C反應蛋白、B型利鈉肽、白細胞計數(shù)的相關性；隨訪患者確診1個月內主要不良心血管事件發(fā)生情況；分析峰值時間血漿miRNA-1、miR-146b不同表達水平患者的30天累積生存率。

結果：急性STEMI患者入院即刻、T12、 T24、T48血漿中miR-1、miR-146b的表達水平以及入院即刻、T12、T24、T48、T72外周血中cTnT表達水平較對照受試者均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；入院即刻血漿miR-1、miR-146b表達水平對于診斷急性STEMI的ROC曲線下面積分別為0.800、0.789（P均＜0.001）；入院即刻血漿miR-146b表達水平與C反應蛋白、B型利鈉肽、白細胞計數(shù)呈正相關關系（P均＜0.05）；峰值時間血漿miR-1、miR-146b高表達患者的30天累積生存率明顯低于低表達患者（P均＜0.05）。

結論：血漿miR-1和miR-146b有可能作為早期診斷急性STEMI的生物標志物，血漿miR-1和miR-146b表達水平的高低與急性STEMI患者預后存在相關性。

心肌梗死；微小RNAs；預后

急性心肌梗死（AMI）是最嚴重的心血管疾病之一?？焖佟蚀_地診斷AMI并予以及時、有效的治療對患者預后至關重要。目前，心肌梗死標志物中尤以心肌肌鈣蛋白（cTn）在診斷AMI中扮演著重要角色，在胸痛發(fā)作4～12 h即可在患者血清中檢測到cTn，但在AMI發(fā)病的早期仍不夠敏感。而且，cTn是心肌損傷標志物，不是AMI的標志物，其在慢性腎臟疾病、心力衰竭、快速心律失常等疾病中亦可升高[1-3]。近年來，被廣泛熱議的高敏心肌肌鈣蛋白（hs-cTn）檢測相比之前雖在靈敏度、分析精密度方面有顯著提高[4]，但仍需要檢測其動態(tài)演變情況。因此，臨床上還需要更早、敏感性和特異性更高的標志物。

微小核糖核酸（miRNA）是一類內源性單鏈非編碼的小RNA，于轉錄后水平調節(jié)基因表達，通過靶向于相應的 miRNA，致使其降解或者抑制翻譯。近年來，國內外多項研究證實，miRNA在心臟的生理及病理過程中發(fā)揮重要作用，如心臟發(fā)育、心肌肥厚、心力衰竭、心律失常、心肌損傷、凋亡、心肌缺血等[5-7]。已有研究表明，miR-1具有心肌特異性，在AMI患者中表達異常，但尚未得出一致結論；miR-146b是miR-146家族中的一員，有研究表明，其在病毒性心肌炎、圍產(chǎn)期心肌病、缺血再灌注引起的心肌損傷等情況下表達升高[8-10]，但其在AMI患者血液中的表達情況少見報道。本研究旨在探討miR-1、miR-146b在循環(huán)中的表達水平及其在急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）早期診斷中的價值和與患者預后的相關性。

1 資料與方法

研究對象：納入徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2016-06至2017-01期間收治的符合2012年全球統(tǒng)一心肌梗死定義[11]的47例確診為急性STEMI的患者，同期納入23例無心血管病史且心電圖、肝腎功能均正常的健康人作為對照受試者。排除標準：先天性心臟病、慢性阻塞性肺疾病、呼吸衰竭、腫瘤、近期感染、風濕性心臟病、外周血管疾病、肝腎功能不全、血液系統(tǒng)、免疫性疾病及近期有外傷史。

臨床資料采集：收集受試者的年齡、性別、發(fā)病時間、血脂、高血壓、糖尿病、吸煙史等一般資料；并記錄患者入院即刻白細胞、C反應蛋白、B型利鈉肽及其各發(fā)病時間點cTnT等指標。通過門診復查或電話隨訪的方式隨訪STEMI患者自確診后1個月內主要不良心血管事件（MACE，包括心原性死亡、心絞痛發(fā)作、心力衰竭和靶血管再次血運重建）的發(fā)生情況。

樣本采集：在心肌梗死發(fā)作后的不同時間段即急性STEMI 患者入院即刻[距發(fā)?。?.33±2.77）h]、發(fā)病 12 h（T12）、24 h（T24）、48 h（T48）、72 h（T72）、1周（T1W）收集全血樣本；并根據(jù)患者入院即刻距發(fā)病時間分為4 h以內（T4）、8 h以內（T8）兩種情況；將標本置于1 000 r/min的離心機中離心，吸取上清液，保存于-80℃冰箱中。

RNA提取及實時定量聚合酶鏈式反應（RTPCR）：應用 TRIzol LS Reagent（Invitrogen life technologies）提取總RNA，取2 μg總RNA應用MMLV反轉錄酶反轉錄合成cDNA,將各樣品的目的miRNA和內參hsa-miR-93-5p分別進行RT-PCR。RT-PCR使用引物序列見表1，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。

表1 實時定量聚合酶鏈式反應使用引物列表

統(tǒng)計學方法：采用SPSS20.0 軟件對收集的所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計計算，正態(tài)分布資料用（ ±s）表示，不服從正態(tài)分布的資料用中位數(shù)（M）表示；經(jīng)正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，兩組間數(shù)值比較采用 t檢驗。不同組間各項指標比較用單因素方差分析（ANOVA）和t檢驗，組內比較用 F 檢驗；對服從正態(tài)分布的變量采用 Pearson 檢驗進行相關性分析，對不服從正態(tài)分布的數(shù)值變量采用 Spearman 檢驗進行相關性分析。應用受試者工作特征（ROC）曲線來評估入院即刻血漿中 miRNA-1、miR-146b表達水平對急性STEMI的診斷價值。應用中位數(shù)分組法將47例急性STEMI患者的峰值時間血漿miRNA-1、miR-146b表達水平分為高表達和低表達兩種情況，并運用Kaplan-Meier單因素分析法來分析不同表達水平miRNA-1、miR-146b與急性STEMI患者的累積生存率。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

急性STEMI患者和對照受試者的基線臨床資料比較（表2）：急性STEMI患者和對照受試者在年齡、性別、高血壓、糖尿病、吸煙、總膽固醇水平等方面之間的差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），在高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平之間的差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

表2 急性STEMI患者和對照受試者的基線臨床特征資料比較（ ±s）

急性STEMI患者在各發(fā)病時間點血漿中miR-1和miR-146b的表達水平與對照受試者比較（表3、圖1）：與對照受試者比較，急性STEMI患者發(fā)病T4、T8、T12、T24、T48時血漿中miR -1和miR-146b表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），發(fā)病T72、T1W時血漿中miR -1和miR-146b表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。與對照受試者相比，急性STEMI患者發(fā)病T4、T8、T12、T24、T48、T72時外周血中cTnT表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），發(fā)病T1W時cTnT表達水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。從時間曲線圖上可以看出，miR-1于AMI發(fā)病4 h開始升高，8 h達到峰值，72 h后趨于正常；miR-146b于發(fā)病4 h開始升高，12 h達到峰值，72 h后亦趨于正常。而cTnT于發(fā)病4 h內開始升高，24 h達到峰值，1周后趨于正常。

表3 急性STEMI患者在各發(fā)病時間點血漿miR-1、miR-146b和cTnT表達水平與對照受試者比較（ ±s）

圖 1 急性 STEMI患者血漿中 miR-1、miR-146b（1A）和 cTnT水平（1B）隨時間變化的曲線圖

急性STEMI患者入院即刻血漿中miR-1和miR-146b表達水平對急性STEMI的診斷價值（圖2）： ROC曲線分析顯示，急性STEMI患者入院即刻血漿中miR-1表達水平對于診斷急性STEMI的曲線下面積（AUC）為0.800，敏感性、特異性及準確性分別為72.3%、78.3%和73.4%（P均＜0.001）；入院即刻血漿中miR-146b表達水平對于診斷急性STEMI的AUC為0.789，敏感性、特異性及準確性分別為74.5%、69.2%和70.1%（P均＜0.001）。

圖2 急性STEMI患者入院即刻血漿中miR-1（2A）和miR-146b（2B）的受試工作特征曲圖線分析結果

急性STEMI患者入院即刻血漿中miR -1、miR-146b表達水平與C反應蛋白、B型利鈉肽、白細胞計數(shù)的相關性（圖3）：急性STEMI患者入院即刻血漿中miR-146b表達水平與C反應蛋白、B型利鈉肽、白細胞計數(shù)呈正相關關系（P均＜0.05），入院即刻血漿中miR-1表達水平與C反應蛋白、B型利鈉肽、白細胞計數(shù)則不相關（P均＞0.05）。

急性STEMI患者中MACE發(fā)生情況：47例急性STEMI患者確診1個月內，共發(fā)生7例（14.9%）MACE，其中心原性死亡1例（2.1%）、心絞痛發(fā)作3例（6.4%）、心力衰竭3例（6.4%），無靶血管再次血運重建。

急性STEMI患者中峰值時間血漿miRNA-1、miR-146b高表達和低表達患者的基本情況和30天累積生存率比較（圖4）：在47例急性STEMI患者中，血漿miRNA-1、miR-146b平均表達水平分別3.491±0.315和3.913±0.397時為高表達（均24例），分別1.570±0.365和2.921±0.415時為低表達（均23例）。不論miRNA-1還是miR-146b，高表達和低表達的患者在性別構成、年齡、入院距發(fā)病時間、糖尿病患病率以及高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、總膽固醇水平等方面的差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）；血漿miRNA-1高表達患者中高血壓患病率明顯高于低表達患者（65.21% vs 29.17%，P=0.02），吸煙者比例上的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而血漿miRNA-146b高表達患者中吸煙者的比例明顯高于低表達患者（43.48% vs 37.50%，P=0.03），高血壓患病率上的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Kaplan-Meier分析顯示，血漿中miR-1和miR-146b高表達患者的30天累積生存率都低于低表達患者（miR-1：82.60% vs 91.30%；miR-146b：78.26% vs 95.65 %，P均 ＜0.05）。

圖3 急性STEMI患者入院即刻血漿中miR-1、miR-146b表達水平與C反應蛋白（3A、3B）、B型利鈉肽（3C、3D）、白細胞計數(shù)（3E、3F）相關性散點圖

圖4 急性STEMI患者中血漿miR-1（4A） 和miR-146b（4B）高表達和低表達患者的30天累積生存率比較

3 討論

AMI是臨床上常見的急危重癥，快速準確地確診該病能夠明顯改善患者預后及生活質量。cTnT在AMI診斷中有著不可替代的地位，但若患者胸痛癥狀、心電圖表現(xiàn)等臨床證據(jù)不足的情況下，需要動態(tài)監(jiān)測其變化，對于早期診斷AMI存在一定的局限性，且該指標在心力衰竭、嚴重高血壓、快速心律失常等疾病中也會出現(xiàn)異常，給臨床診斷帶來一定干擾。miRNA是一種非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)，其在心臟細胞的生長及分化過程中，扮演著重要角色[3,7]。有數(shù)據(jù)表明，miRNA非常穩(wěn)定，不容易被降解，能順利進入血液，并長期滯留，作為臨床檢測指標具有一定的可靠性[12]。本研究選取具有心肌特異性的miR-1及與炎性相關的miR-146b為研究對象，觀察其在急性STEMI患者血液中的表達情況。

急性心肌梗死指南指出，cTnT在心肌梗死起病后3～4 h后升高，于11～24 h達高峰，7～10 d降至正常[13]。本研究所選病例的cTnT于發(fā)病4 h升高，24 h達高峰，變化趨勢與指南基本一致。本研究提示，miR-1在AMI起病后4 h內升高，8 h內達到峰值，較cTnT更早達到峰值，1周后趨于正常，這與先前研究的AMI患者血漿中miR-1隨時間變化趨勢相一致；此外，ROC曲線分析結果顯示，入院即刻血漿中miR-1的AUC＞0.5，特異性及敏感度較高，這表明miR-1對于早期診斷AMI具有一定的可靠性；miR-146b亦在AMI發(fā)作后4 h內升高，12 h內達到峰值，AUC同樣＞0.5，但其達峰值時間較miR-1晚，在早期診斷AMI中不具有優(yōu)勢。

國外一項動物實驗表明，miRNA釋放到體循環(huán)可能是相對選擇性的過程,證明 miR-1具有心肌特異性，心肌壞死的程度及時間長短都有可能影響miR-1釋放到體循環(huán)[14]。本研究也提示，miR-1在AMI患者血液中的表達具有時間依賴性。目前國內外針對miR-146b的研究多集中在炎癥及腫瘤方面，對其在AMI患者血液中的變化未見報道。但本實驗室在動物實驗中通過高通量的miR基因芯片篩選及進一步的qRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)miR-146b在心肌缺血和再灌注損傷時均明顯上調。且有國外研究報道，miR-146b在小鼠心肌炎模型及病毒性心肌炎患者的心肌組織中表達升高[10]。這些都表明，miR-146b在心肌損傷的病理過程中發(fā)揮作用，具體機制及趨勢有待進一步研究。本研究由于收集患者入院時樣本的時間局限性，未能大量獲得患者更早期如發(fā)病1～2 h的血液標本，未來應進一步完善更早期血液中miR-1、miR-146b表達水平的變化。本研究表明，血漿中miR-1、miR-146b有望成為診斷AMI的新型標志物，但是否優(yōu)于傳統(tǒng)的心肌損傷標志物，需要更大樣本量的研究來證實。

AMI的病理基礎為冠狀動脈粥樣硬化，而冠狀動脈粥樣硬化病變的形成是動脈對內皮、內膜損傷做出的炎癥-纖維增生性反應的結果，是一種進展性炎性反應，因此患者常伴有C反應蛋白、白細胞計數(shù)等炎性標志物的升高。多項研究已證實，miR-146b是重要的炎性免疫反應調節(jié)因子之一，通過介導炎性因子的表達致使內皮損傷，參與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[15]。本研究通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，miR-146b與C反應蛋白、白細胞計數(shù)存在明顯正相關性，而未見miR-1與炎性指標存在相關性，進一步表明miR-146b可能通過調控與炎癥相關基因的表達，參與到AMI 的病理過程中。研究表明，miR-146a在心力衰竭患者血液中表達升高，在AMI 后心室重構過程中發(fā)揮作用[16,17]，作為與miR-146a同一家族的miR-146b是否也參與其中，目前尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b與B型利鈉肽存在相關性，與研究報道的miR-146a和B型利鈉肽無相關性結果不一致[16]，可能與血樣采集時間、病例選擇及檢測方法、同一家族不同亞型基因作用不同等因素有關。

眾所周知，心肌損傷標志物水平升高幅度與心肌梗死范圍及預后明顯相關。本研究將峰值時間血漿miR-1、miR-146b的表達水平分為高表達和低表達兩種情況，通過生存分析發(fā)現(xiàn)，miR-1、miR-146b高表達患者較低表達患者容易再發(fā)心血管事件，嚴重影響患者預后，有研究表明，miR-1表達水平與心肌梗死面積相關，miR-1、miR-146b參與心肌纖維化及心臟重構等過程[16,18,19]，故miR-1、miR-146b有潛力成為預測AMI患者MACE發(fā)生風險的指標,從而找出高?；颊?，及早對其進行干預治療，改善患者預后及生活質量。但本研究樣本量少，觀察到的終點事件例數(shù)亦少，且隨訪時間短，以此判斷其預后價值可能有一定的偏倚，需要進一步擴大樣本量及延長隨訪時間來進一步證實。

綜上，血漿中miR -1和miR-146b有可能作為早期診斷AMI的生物標志物，其表達水平的高低可能具有預測AMI患者MACE發(fā)生風險的潛在價值。

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2017-04-03）

（編輯：朱柳媛）

Correlation Study Between Plasma microRNA-1, microRNA-146b Expressions and Diagnosis, Prognosis of Acute ST-segment Elevation Myocardial Infarction

LI Ting-ting, PAN De-feng, ZHU Hong.

Department of Cardiology, Xuzhou Medical University Aff i liated Hospital, Xuzhou (221000), Jiangsu, China

ZHU Hong, Email: 18761433616@163.com

Objective: To observe the changes of plasma microRNA-1 (miR-1) and microRNA-146b (miR-146b) at the early stage of acute ST-segment elevation myocardial infarction (STEMI) and to explore the relationship between miR-1, miR-146b and STEMI diagnosis, prognosis in relevant patients.

Methods: Our research included in 2 groups: STEMI group, n=47 patients and Control group, n=23 healthy subjects.Blood samples were taken at immediate admission, 12 h of onset (T12), T24, T48, T72 and T1w (1 week of onset), plasma levels of miR-1, miR-146 and cardiac troponin (cTnT) were examined at different time points and compared between 2 groups. The value of miR-1, miR-146b on STEMI diagnosis was assessed by ROC curve; relationship between plasma levels of miR-1, miR-146 and CRP, BNP, WBC count at immediate admission was evaluated. All patients were followed-up for major adverse cardiac events (MACE) within 1 month of diagnosis; the impact of miR-1, miR-146 at peak time on 30-d cumulative survival rate was analyzed.

Results: Compared with Control group, STEMI group had increased plasma levels of miR-1 and miR-146b at immediate admission, T12, T24, T48; elevated cTnT at immediate admission, T12, T24, T48 and T72, all P＜0.05. At immediate admission, the area of miR-1 and miR-146b under ROC curve for STEMI diagnosis were 0.800 and 0.789, both P＜0.001; miR-146b was positively related to CRP, BNP and WBC count, all P＜0.05. Cumulative survival rate in patients with high expressions of miR-1, miR-146 at peak time was lower than those with low expressions of miR-1, miR-146, all P＜0.05.

Conclusion: Plasma levels of miR-1 and miR-146b might be become the biomarkers for early STEMI diagnosis; miR-1 and miR-146b were related to STEMI prognosis in relevant patients.

Myocardial infarction; MicroRNAs; Prognosis

徐州科技局項目（KC15SX003）

221000 江蘇省徐州市，徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 心內科

李亭亭 碩士研究生 主要從事冠心病研究 Email:767228530@qq.com 通訊作者：朱紅 Email:18761433616@163.com

R540.5

A

1000-3614（2017）11-1060-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.11.005

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1060.)