高娜 陶錚 段俊國

·實(shí)驗(yàn)研究·

糖尿病視網(wǎng)膜病變高糖細(xì)胞模型的建立

高娜1陶錚2段俊國2

目的建立一種高糖刺激下的糖尿病視網(wǎng)膜病變的細(xì)胞模型。方法分別采用不用葡萄糖濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),觀察細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性和細(xì)胞利用葡萄糖的能力,HUVEC分別與不同濃度的葡萄糖(5.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)共同孵育不同時(shí)間(6h、12h、24h、48h、72h),570nm處測OD值。結(jié)果各葡萄糖組對HUVEC活力的抑制率隨著葡萄糖濃度的升高,作用時(shí)間的延長而升高。30 mmol/L和35 mmol/L的葡萄糖作用48h及48h以上對HUVEC活性(OD值)有明顯抑制作用(Plt;0.01);各實(shí)驗(yàn)組葡萄糖濃度隨時(shí)間延長均有不同程度的降低,且各組減低程度不同,其中30mmol/L的實(shí)驗(yàn)組中的葡萄糖濃度在48h和72h處降低最顯著。結(jié)論30mmol/L 是篩選糖尿病視網(wǎng)膜病變藥物細(xì)胞模型中最佳的細(xì)胞培養(yǎng)濃度,培養(yǎng)時(shí)間48h是觀測藥物干預(yù)效果的最佳時(shí)間點(diǎn)。

糖尿病視網(wǎng)膜病變； 高糖細(xì)胞模型； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病微血管病變中最重要的表現(xiàn),是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的致盲性眼病難題。DR發(fā)病率高,有資料顯示,糖尿病患者DR的患病率高達(dá)27.29%。若不及早干預(yù),DR將嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量,加重社會(huì)負(fù)擔(dān),并帶來高昂的醫(yī)療開支。

目前中醫(yī)藥治療糖尿病視網(wǎng)膜病的優(yōu)勢日益凸顯,其作用療效的相關(guān)研究尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。由于細(xì)胞模型的易操作性及易重復(fù)性,使得高糖刺激下的細(xì)胞模型廣泛用于中醫(yī)藥防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究。但相關(guān)文獻(xiàn)中關(guān)于如何建立高糖培養(yǎng)下的細(xì)胞模型還鮮有報(bào)道。

本課題擬采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為體外觀察對象。如何建立最能模擬人體實(shí)際體內(nèi)環(huán)境下的細(xì)胞模型是本實(shí)驗(yàn)的研究目的。國內(nèi)外學(xué)者相繼建立了多種用于糖尿病研究的細(xì)胞模型,通過控制其外環(huán)境的理化因素實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定條件下藥物和其它作用的監(jiān)測研究。

高糖培養(yǎng)細(xì)胞模型的建立既要符合細(xì)胞能夠維持生長代謝的基本條件,又要模擬體內(nèi)高糖環(huán)境下對細(xì)胞有相應(yīng)損害的生長環(huán)境。對此,本課題同時(shí)采用兩種方法進(jìn)行考量,一是采用MTT比色法檢查細(xì)胞增殖能力,二是同時(shí)測定細(xì)胞代謝的實(shí)時(shí)葡萄糖濃度,即間接反映細(xì)胞在高糖培養(yǎng)模式下的代謝活性,綜合兩者即可篩選出最佳細(xì)胞培養(yǎng)的高糖濃度及觀測點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,代號(hào):HUVEC,來源:中科院上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑

DMEM低糖:SH30021.01(Hyclone);南美胎牛血清:FB15011,CLARK生產(chǎn);MTT:M-2128(Sigma);胰酶(+EDTA):J150031(Hyclone);二甲基亞砜(DMSO):D-5879(Sigma);葡萄糖:G8270,(sigma)。葡萄糖(Glu)測試盒,F006(南京建成生物工程研究所)。

MTT配制:稱取250mg MTT,避光條件下溶于50ml PBS中,在60°C水浴條件下小心晃動(dòng),使其溶解,用0.22um的微孔濾膜過濾分裝,-20°C條件下長期保存。用時(shí),無血清培養(yǎng)基稀釋為終濃度0.5mg/ml。

1.3方法

1.3.1MTT檢測細(xì)胞活性

細(xì)胞復(fù)蘇后按照1:3傳代培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用PBS清洗,胰蛋白酶消化離心(1000rpm,5min)后吸除上清液,加入適量培養(yǎng)基使其成為單細(xì)胞懸液;用血球計(jì)數(shù)板對該單細(xì)胞懸液所含細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)節(jié)細(xì)胞密度3.7*10∧4/ml,100ul/孔接種于無菌96孔板中,為防止長時(shí)間培養(yǎng)導(dǎo)致蒸發(fā),96孔板外圍一圈均加適量PBS保濕;待細(xì)胞完全貼壁后吸除原培養(yǎng)基,每孔加入200(l不同濃度的葡萄糖溶液,每個(gè)藥物濃度設(shè)6個(gè)平行孔,37℃、5%CO2恒溫分別繼續(xù)培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h、72h(表1)。

表1 葡萄糖作用分組

小心吸除原有培養(yǎng)液,每孔加入200ul終濃度為0.5mg/ml的MTT溶液;并輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板數(shù)次,37℃、5%CO2恒溫繼續(xù)培養(yǎng)4h;吸棄液體,每孔加入150ulDMSO,取出96孔板,用酶標(biāo)儀測定其在570nm處的吸光度值;

1.3.2細(xì)胞上清液中葡萄糖的濃度測定

根據(jù)3.1MTT的初步結(jié)果選擇24小時(shí),48小時(shí)及72小時(shí)為觀測點(diǎn)。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和過氧化氫,后者在過氧化物酶的作用下,將還原性4-氨基安替比林與酚偶聯(lián)縮合成可被分光光度計(jì)測定的醌類化合物。具體操作按照葡萄糖試劑盒說明進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)均用 SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1不同高糖濃度對細(xì)胞活性的影響

HUVEC分別與不同濃度的葡萄糖(5.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)共同孵育不同時(shí)間(6h、12h、24h、48h、72h),570nm處測OD值,結(jié)果如表2所示:與正常對照組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)相比,30 mmol/L和35 mmol/L的葡萄糖作用24h對HUVEC活性(OD值)有抑制作用(Plt;0.05),48h及72h有明顯抑制作用(Plt;0.01);l0mmol/L和15mmol/L的葡萄糖作用72h、20 mmol/L的葡萄糖作用48h以上,40mmol/L的葡萄糖作用24h以上對HUVEC活力(OD值)有明顯抑制作用(Plt;0.01),并呈現(xiàn)一定的時(shí)間和濃度依賴關(guān)系(表2)。各葡萄糖組對HUVEC活力的抑制率隨著葡萄糖濃度的升高,作用時(shí)間的延長而升高(表3)。

2.2不同高糖濃度對細(xì)胞活性的影響

根據(jù)MTT細(xì)胞活性的檢測結(jié)果,本研究選取24h,48h,72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清液中葡萄糖的濃度。結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組葡萄糖濃度隨時(shí)間延長均有不同程度的降低(表4),且各組減低程度不同(表5),其中30mmol/L的實(shí)驗(yàn)組中的葡萄糖濃度在48h和72h處降低最顯著。

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)系由于高血糖損害血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞周細(xì)胞為基礎(chǔ)病理改變的代謝性疾病。目前新藥研究還普遍局限于動(dòng)物模型,但整體動(dòng)物模型篩選藥物效率低成本高,因此尋找藥靶基因,建立體外篩選的細(xì)胞模型,結(jié)合現(xiàn)代化新技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量藥物篩選,將成為DR治療的新方向。

表2 高糖對HUVEC細(xì)胞平均光密度的影響

注:各濃度葡萄糖組與空白對照組相比,*Plt;0.05;**Plt;0.01

表3 不同時(shí)間和不同濃度葡萄糖作用HUVEC的抑制率

表4 各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間段培養(yǎng)基中葡萄糖濃度值(平均值)

MTT比色法可用來檢測細(xì)胞增殖能力,即細(xì)胞數(shù)量;同時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)液中的葡萄糖又是細(xì)胞代謝的唯一能量來源,通過檢查培養(yǎng)液上葡萄糖降低值可以反映細(xì)胞利用葡萄糖的能力,即可間接反映細(xì)胞代謝活性[1,2,3]。

表5 各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間段培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低值

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)上清液中糖濃度為30mmol/L時(shí),HUVEC利用葡萄糖的能力顯著,同時(shí),與正常對照組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)相比,30 mmol/L的葡萄糖作用48h及以上對HUVEC活性(OD值)有顯著抑制作用(Plt;0.01);故30mmol/L是篩選DR藥物細(xì)胞模型中最佳的刺激濃度,同時(shí),為排除作用時(shí)間增長代謝產(chǎn)物本身對細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用,在該濃度刺激下作用48h是觀察藥物干預(yù)作用的最佳觀測點(diǎn)。

由于人視網(wǎng)膜材料來源有限,進(jìn)行人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)比較困難,很難獲得純化的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞,傳代過程中細(xì)胞性狀也容易發(fā)生改變,因此本研究選用較易生長的HUVEC來進(jìn)行研究,通過在體外增加培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的方法來培養(yǎng) HUVEC,模擬DR中內(nèi)皮細(xì)胞所處的高糖微環(huán)境。本細(xì)胞藥物篩選模型具有成本低、效率高、周期短的特點(diǎn),并且可重復(fù)性好,操作性強(qiáng)。故可以用作篩選動(dòng)物模型的補(bǔ)充模型。

[1] 燕建鋒.高糖誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷及丹參多酚酸鹽對其保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].揚(yáng)州大學(xué),2009.

[2] 李賽美,凌家杰,王志高.加味桃核承氣湯及其拆方對高糖誘導(dǎo)HUVEC損傷培養(yǎng)液中ET-1、NO及ICAM-1含量的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(8):535-538.

[3] 王玉風(fēng),楊俠,董曉光.玻連蛋白對高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志,2013,31(1):49-54.

Acellmodelfordiabeticretinopathyresearchunderhigh-glucosestimulation

GAO Na1,TAO Zheng2,DUAN Junguo2

(1.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu Sichuan,610075;2.Ophthalmic College,Chengdu University of TCM,Chengdu,Sichuan,610075)

ObjectiveTo establish a cell model for diabetic retinopathy research under high-glucose stimulation.MethodsDifferent glucose concentration(5.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)were co-cultured with human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).MTT and the concentration of glucose in supernatant were observed at 6h、12h、24h、48h、72h respectively.ResultsThe inhibitory rate under high-glucose stimulation on HUVEC increased with the increase of glucose concentration.HUVEC co-cultured with 30 mmol/L and 35 mmol/L glucose for 48h and longer had significant inhibitory rate(Plt;0.01).Meanwhile,the glucose concentration decreased obviously in 30mmol/L group at 48h and 72h.Conclusion30mmol/L high-glucose concentration is the optimal concentration of HUVEC for DR research,and the 48h is the best time to observe the effect of drug intervention.

Diabetic retinopathy; Cell model under high-glucose stimulation; Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.03.004

R774

1.610075,四川成都,成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院;2.610075,四川成都，成都中醫(yī)藥大學(xué)眼科學(xué)院

高娜,E-mail:gaonazsu@126.com