鄭 峰 陳 波 汪易嵐 葉宏偉

（江蘇省常熟市第一人民醫(yī)院，江蘇 常熟 215500）

涼膈散干預(yù)治療對(duì)急性胰腺炎患者血清相關(guān)miRNAs水平的影響*

鄭 峰 陳 波 汪易嵐 葉宏偉△

（江蘇省常熟市第一人民醫(yī)院，江蘇 常熟 215500）

目的觀察中醫(yī)藥經(jīng)典湯劑涼膈散干預(yù)治療對(duì)急性胰腺炎患者血清相關(guān)miRNAs水平的影響并探討其機(jī)制。方法連續(xù)性收錄2014年1月至2016年12月本院重癥醫(yī)學(xué)科收治的中重癥/重癥急性胰腺炎（MSAP/SAP）患者共46例，隨機(jī)數(shù)字表法分為涼膈散組和對(duì)照組。兩組患者分別于入組前和治療后第10日檢測(cè)miR-216和miR-92水平，并進(jìn)行APACHEⅡ評(píng)分和Ranson評(píng)分，評(píng)估病情危重程度。結(jié)果在治療后第10日，兩組患者血清miR-216和miR-92均明顯下降（P<0.05），涼膈散組患者miR-216和miR-92均明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。治療后涼膈散組患者APACHEⅡ評(píng)分明顯下降（P<0.05）。涼膈散組患者APACHEⅡ評(píng)分和Ranson評(píng)分均明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。涼膈散干預(yù)治療與miR-216和miR-92呈正相關(guān)。結(jié)論涼膈散干預(yù)治療可以明顯降低MSAP/SAP血清AP相關(guān)miR-216和miR-92濃度，改善患者臨床預(yù)后。

急性胰腺炎 涼膈散 微小RNA-216 微小RNA-92

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，人民群眾生活水平和方式逐步改變，急性胰腺炎（AP）的發(fā)病率逐年提高［1］。根據(jù)嚴(yán)重程度不同，AP可以分為輕癥，中重癥（MSAP）和重癥（SAP）。MSAP和SAP主要的區(qū)別為器官功能衰竭持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度的不同，后兩者是內(nèi)科常見(jiàn)急危重癥，治療方案類似，均具有發(fā)病急劇，病情復(fù)雜，并發(fā)癥高以及預(yù)后差等特點(diǎn)［2］。薈萃分析證實(shí)早期MSAP/SAP更適合內(nèi)科保守治療，包括液體復(fù)蘇、器官功能維持、抗感染、營(yíng)養(yǎng)支持以及中藥治療［3］。涼膈散是我國(guó)經(jīng)典的傳統(tǒng)中藥湯劑，出自 《太平惠民和劑局方》，具有瀉火解毒，清上泄下功用，主治上中焦邪郁生熱證。研究發(fā)現(xiàn)涼膈散可以有效抑制膿毒癥小鼠體內(nèi)血小板的活化，同時(shí)下調(diào)多種炎癥因子，具有明顯的抗炎和改善凝血功能作用［4］。本課題組前期發(fā)現(xiàn)在常規(guī)內(nèi)科治療的基礎(chǔ)上，加用涼膈散可明顯縮短MSAP/SAP患者病程及治療費(fèi)用，同時(shí)減少并發(fā)癥的發(fā)生，但是其中的機(jī)理尚未深入研究。微小RNA（miRNA）是一組內(nèi)源性高度保守非編碼單鏈RNA，由20～22個(gè)核糖核苷酸組成，調(diào)控上游基因表達(dá)和下游蛋白翻譯過(guò)程，參與體內(nèi)多種病理和生理反應(yīng)［5］。目前已有部分研究發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)AP相關(guān)miRNAs［6］，而關(guān)于涼膈散對(duì)于這些miRNAs水平影響的報(bào)道極少。本研究選擇miR-216和miR-92兩個(gè)已報(bào)道的AP相關(guān)miRNA作為切入點(diǎn)［6］，綜合分析46例MSAP/SAP患者經(jīng)涼膈散治療后上述兩種miRNA的改變情況。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2013年美國(guó)胃腸病學(xué)會(huì)急性胰腺炎治療指南中重度/重癥胰腺炎（MSAP/SAP）的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；年齡 18～80 歲；簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有胃腸穿孔、腸梗阻、化膿性膽囊炎等及其他原因無(wú)法內(nèi)科保守治療，必須急診外科手術(shù)患者；妊娠或哺乳期婦女；入組后3 d內(nèi)死亡，或治療期間放棄治療或轉(zhuǎn)院造成臨床數(shù)據(jù)不全者；嚴(yán)重休克，需大劑量血管活性藥物患者；持續(xù)意識(shí)障礙患者；無(wú)法完成鼻飼或灌腸治療的患者。

1.2 臨床資料 本研究連續(xù)性收錄2014年1月至2016年12月本院重癥醫(yī)學(xué)科收治的MSAP/SAP患者46例，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為涼膈散組和對(duì)照組各23例。涼膈散組男性 13 例，女性 10 例；平均年齡（48.2±8.5）歲；BMI（26.9±1.3） kg/m2；吸煙 11 例，飲酒 8 例；心率（110.1±9.1）次/min；平均動(dòng)脈壓（68.4±7.1） mmHg；氧合指數(shù)（205.5±22.6）；血清肌酐（243.7±19.8） μmol/L，血清尿素氮（14.6±1.3） μmol/L，血乳酸（3.1±0.3） mmol/L；冠心病2例，高血壓5例，糖尿病6例；誘發(fā)因素為膽源性11例，暴飲暴食7例，高脂血癥3例，其他2例。對(duì)照組男性 12 例，女性 11 例；平均年齡（44.6±7.1）歲；BMI（25.8±1.7） kg/m2；吸煙 10 例，飲酒 9 例；心率（108.4±8.9）次/min；平均動(dòng)脈壓（70.1±5.2） mmHg；氧合指數(shù)（215.9±17.6）；血清肌酐（231.8±24.5） μmol/L，血清尿素氮（13.3±1.2）μmol/L，血乳酸（2.8±0.2） mmol/L；冠心病3例，高血壓4例，糖尿病5例；誘發(fā)因素為膽源性13例，暴飲暴食6例，高脂血癥2例，其他2例。兩組患者資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.3 治療方法 對(duì)照組患者給予常規(guī)內(nèi)科治療，包括液體復(fù)蘇、器官功能維持、抗感染、營(yíng)養(yǎng)支持等，同時(shí)維持酸堿及水電解質(zhì)平衡。治療組在常規(guī)內(nèi)科治療的基礎(chǔ)上加用涼膈散：連翹15 g，梔子、竹葉、薄荷葉、黃芩各10 g，大黃、玄明粉各9 g，甘草6 g。每日1劑，水煎取汁400 mL，分成200 mL各1份，1份行胃管注入，1份行保留灌腸，每日1次，療程10d。

1.4 觀察項(xiàng)目 1）miRNA檢測(cè)。兩組患者分別于入組前和治療后第10日留取靜脈血15mL左右，用于檢測(cè)miR-216和miR-92?；颊哐簶颖居?℃3000 r/min條件下離心30 min，留取上清液置于-80℃冰箱中凍存待檢。通過(guò)Trizol法提取血清總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)合成相應(yīng)miRNA的cDNA，并通過(guò)7600型（ABI公司）序列檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)其含量。以U6作為內(nèi)參，miR-16標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清miRNA的絕對(duì)含量。2）所有患者分別于入組時(shí)和治療后第10天進(jìn)行APACHEⅡ評(píng)分和Ranson評(píng)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。通過(guò)Pearson和Spearman相關(guān)性分析比較涼膈散與不同miRNAs水平變化的相關(guān)性比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者AP相關(guān)miRNAs水平和臨床評(píng)分比較見(jiàn)表1。在治療后第10日，兩組患者血清miR-216和miR-92 均明顯下降（P＜0.05），涼膈散組患者 miR-216和miR-92均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。治療后涼膈散組患者 APACHEⅡ評(píng)分明顯下降（P＜0.05）。 涼膈散組患者APACHEⅡ評(píng)分和Ranson評(píng)分均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表1 兩組患者AP相關(guān)miRNAs水平和臨床評(píng)分比較（±s）

表1 兩組患者AP相關(guān)miRNAs水平和臨床評(píng)分比較（±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05；與對(duì)照組治療后比較，△P＜0.05。

組 別 時(shí)間m i R-2 1 6（f m o l/L）m i R-9 2（f m o l/L）A P A C H EⅡ評(píng)分（分）R a n s o n評(píng)分（分）涼膈散組 治療前（n＝2 3） 治療后對(duì)照組 治療前8 4 3.1±9 8.4 3 3 3.7±2 8.5 1 9.2±2.5 7.1±0.8 6 6 5.2±9 3.7*△ 2 1 0.8±1 3.5*△ 1 2.4±1.1*△ 5.1±0.5*△9 3 1.8±1 1 2.6 3 6 8.9±2 2.6 1 8.0±2.9 6.8±0.7（n＝2 3） 治療后7 9 5.4±1 0 2.8* 2 8 4.8±1 6.6* 1 4.3±1.8* 5.8±0.6*

2.2 相關(guān)性分析 見(jiàn)表2。以相關(guān)系數(shù)r>0.6為基準(zhǔn)，Pearson和Spearman相關(guān)性分析提示涼膈散干預(yù)治療與 miR-216 和 miR-92 水平呈正相關(guān)（P<0.05）。

表2 涼膈散、miRNA和臨床評(píng)分三者相關(guān)性分析（相關(guān)系數(shù)r/P值）

2.3 死亡風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 見(jiàn)表3。通過(guò)cox回歸分析顯示MSAP/SAP患者使用涼膈散治療后，第7日、21日和28日死亡率分別減少2%、4%和10%，而第14日死亡率增加4%，但除了28 d死亡率外，其他均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

3 討 論

目前的循證醫(yī)學(xué)提示AP患者早期更適合內(nèi)科保守治療，包括液體復(fù)蘇、抗感染、營(yíng)養(yǎng)支持等，而中醫(yī)藥是內(nèi)科治療的重要組成部分。傳統(tǒng)中醫(yī)藥湯劑可以明顯提高內(nèi)科治療療效，改善臨床癥狀，減少死亡率。本課題組前期發(fā)現(xiàn)通過(guò)鼻飼和灌腸給藥經(jīng)典方劑涼膈散，可以明顯改善患者臨床癥狀，降低炎癥指標(biāo)并減少住院時(shí)間。本研究則進(jìn)一步選擇了miR-216和miR-92兩種AP相關(guān)miRNA作為觀察點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)涼膈散干預(yù)治療后可以明顯降低血清miR-216和miR-92水平。

表3 涼膈散使用者和非使用者死亡風(fēng)險(xiǎn)比較

miRNA是近十年來(lái)的研究熱點(diǎn)，是一種內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，通過(guò)與靶點(diǎn)mRNA的3’非翻譯區(qū)特異性的結(jié)合，形成靜默復(fù)合物抑制靶點(diǎn)mRNA翻譯或促進(jìn)靶點(diǎn)mRNA的降解［8］。在大鼠胰腺和人類胰腺標(biāo)本中均已證實(shí)miR-216在胰腺組織中高特異性表達(dá)［9-10］。在AP時(shí)胰腺組織損傷壞死，細(xì)胞內(nèi)miR-216大量入血，導(dǎo)致循環(huán)中miR-216濃度升高［11］。因此，血清miR-216水平是反映胰腺損傷的生物學(xué)標(biāo)記物。本研究發(fā)現(xiàn)涼膈散組和對(duì)照組患者治療10 d后miR-216水平均明顯下降，而涼膈散組更加明顯。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-216作為胰腺特異性miRNA，在胰腺受到損傷時(shí)可以沉默PTEN和Smad7基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，進(jìn)而調(diào)控PI3k/Akt信號(hào)通路，上調(diào)轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β表達(dá)，參與AP病理生理學(xué)過(guò)程。因此，可以猜測(cè)涼膈散可能是通過(guò)調(diào)控miR-216表達(dá)，進(jìn)而改善PI3K/Akt信號(hào)通路激活程度，進(jìn)而改善AP患者臨床預(yù)后。

miR-92是本研究選擇的另一個(gè)AP相關(guān)miRNA，也是胰腺組織中高特異性表達(dá)的miRNA［12］。研究發(fā)現(xiàn)miR-92和miR-17之間可以形成群集結(jié)構(gòu)，共同調(diào)控胰腺β細(xì)胞對(duì)于體內(nèi)糖代謝的反饋和適應(yīng)，調(diào)控胰島素的合成和釋放［13］。本研究發(fā)現(xiàn)涼膈散組和對(duì)照組患者治療10 d后miR-92水平均明顯下降，而涼膈散組更加明顯。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AP時(shí)凋亡的胰腺細(xì)胞中miR-92水平明顯高于正常胰腺細(xì)胞，提示miR-92可能參與胰腺細(xì)胞凋亡的病理過(guò)程。通過(guò)過(guò)表達(dá)和沉默miR-92進(jìn)一步證實(shí)miR-92是AP時(shí)胰腺細(xì)胞凋亡的重要因子［14］。而涼膈散也可能是通過(guò)抑制miR-92的表達(dá)進(jìn)而減少胰腺細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善患者臨床癥狀和預(yù)后。

涼膈散作為傳統(tǒng)中藥經(jīng)典方劑，主治上中焦邪郁生熱證，即為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的重癥胰腺炎等。目前對(duì)于涼膈散的臨床療效和藥物機(jī)理研究甚少，主要是對(duì)涼膈散中的單味中藥（連翹、黃芩、梔子、大黃和芒硝等）進(jìn)行研究。有學(xué)者通過(guò)大鼠SAP模型發(fā)現(xiàn)，連翹能顯著降低核因子κB的活性及肝臟組織中核因子κB和Foxp3的mRNA表達(dá)，從而減輕SAP肝損傷的嚴(yán)重程度［15］。研究證實(shí)黃芩對(duì)SAP大鼠肝損傷有預(yù)防和治療作用，可以有效減輕肝、胰組織損傷程度［16］。在去氧膽酸造成的SAP大鼠模型中可以觀察到梔子苷能提高谷胱甘肽、超氧化物歧化酶的濃度，并且降低丙二醛含量，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)［17］。大黃和芒硝是研究較多的治療SAP的中藥，臨床研究發(fā)現(xiàn)大黃和芒硝均可顯著改善SAP患者炎癥指標(biāo)和住院時(shí)間［18］。中醫(yī)傳統(tǒng)辨證思維強(qiáng)調(diào)整體觀念，上述研究均為涼膈散中的單味中藥研究，缺乏對(duì)于涼膈散整體療效和藥理的研究。

綜上所述，本課題組在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥湯劑涼膈散干預(yù)治療可以明顯降低MSAP/SAP血清AP相關(guān)miR-216和miR-92濃度，進(jìn)而改善患者臨床預(yù)后，其中的具體機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

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Effect of Intervention Treatment of Liangge Decoction on Serum Related miRNAs Levels in Patients with Acute Pancreatitis

ZHENG Feng，CHEN Bo，WANG Yilan，et al. The First people′s Hospital of Changshou City，Jiangsu，Changshu 215500，China.

Objective：To evaluate the effect of Liangge Decoction on serum pancreatitis related miRNA in patients with moderate/severe acute pancreatitis（MSAP/SAP）.Methods：46 patients with MSAP/SAP were enrolled in this study and divided into two groups equally and randomly：LGS group and the control group.The levels of miR-216 and miR-92 were measured on admission day（T0） and ten days after treatment（T1）.APACHE II and Ranson score were used for disease assessment.Results：The contents of miR-216 and miR-92 in both LGS group and the control group were significantly reduced on T1.The levels of miR-216 in LGS group were lower than those in control group on T1 （P<0.05）.The levels of△miR-216（P<0.05） and △miR-92 （P<0.05） in LGS group were higher than those in control group.The levels of APACHEⅡin LGS group were significantly decreased on T1 （P<0.05）.Both △APACHEⅡ（P<0.05）and △Ranson （P<0.05） in LGS group were higher than those in the control group.Correlation analysis showed that Liangge Decoction treatment was positively associated with △miR-216 （r=0.688，P<0.05） and △miR-92 （r=0.613，P<0.05）.Cox regression analysis suggested that Liangge Decoction might reduced the 28 day mortality in MSAP/SAP patients.Conclusion：Liangge Decoction may improve the prognosis of MSAP/SAP patients by reducing serum levels of miR-216 and miR-92 related to serum AP.

Acute pancreatitis；Liangge Decoction；miR-216；miR-92

R576

A

1004-745X（2017）11-2028-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.045

江蘇省常熟市科技發(fā)展計(jì)劃（CS201510）；蘇州市科教興衛(wèi)項(xiàng)目（LCZX201319）

△通信作者（電子郵箱：yehongwei2016@sina.com）

2017-04-26）