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        心痛方對(duì)急性心肌梗死大鼠MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響*

        2017-11-29 06:19:00謝榮苑范金茹周斐然王建湘歐陽(yáng)過(guò)廖建萍劉志云
        中國(guó)中醫(yī)急癥 2017年11期
        關(guān)鍵詞:手術(shù)模型

        謝榮苑 范金茹 周斐然 陳 彤 王建湘 歐陽(yáng)過(guò) 廖建萍 劉志云

        (1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙410007)

        心痛方對(duì)急性心肌梗死大鼠MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響*

        謝榮苑1范金茹2△周斐然2陳 彤2王建湘2歐陽(yáng)過(guò)1廖建萍2劉志云1

        (1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙410007)

        目的通過(guò)觀察心痛方對(duì)大鼠急性心肌梗死(AMI)后基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)mRNA和金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)mRNA表達(dá)及對(duì)心肌形態(tài)學(xué)的影響,探討心痛方治療AMI的療效機(jī)制。方法80只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、心痛方組、雙抗組(阿司匹林+氯吡格雷),冠脈結(jié)扎法制備AMI模型,灌胃給藥7 d后處死大鼠,運(yùn)用RT-PCR法測(cè)定心肌組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá),心肌細(xì)胞HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果心痛方能使AMI大鼠心肌內(nèi)MMP-9 mRNA表達(dá)減少 (P<0.01);TIMP-1 mRNA表達(dá)升高(P<0.01);MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值降低(P<0.01);心肌損傷程度及心梗面積與MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值呈正直線相關(guān)。結(jié)論心痛方對(duì)AMI缺血心肌具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與增加TIMP-1 mRNA表達(dá),降低MMP-9 mRNA表達(dá),從而調(diào)節(jié)MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的平衡有關(guān)。

        急性心肌梗死 心痛方 MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA

        細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是心臟和心血管壁的主要成分,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)與多種心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程相關(guān),在動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(CVD)的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[1]。MMPs是炎癥活動(dòng)的產(chǎn)物,炎性細(xì)胞因子可激活巨噬細(xì)胞使MMPs產(chǎn)生增多,同時(shí)某些細(xì)胞因子下調(diào)TIMPs的產(chǎn)生,使 MMPs/TIMPs的比例失衡[2]。 本研究通過(guò)觀察心痛方對(duì)急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA的表達(dá)以及對(duì)心肌組織結(jié)構(gòu)改變的影響來(lái)探討心痛方的療效機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        SPF級(jí)SD雄性大鼠80只,體質(zhì)量200~250 g,鼠齡8~10周,購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(湘)2014-0011。

        1.2 試藥與儀器

        心痛方(組方:柴胡 10 g,瓜蔞 10 g,川芎 10 g,桃仁 10 g,蒲黃 10 g,白芥子 10 g,郁金 10 g,九香蟲(chóng) 5 g,甘草5 g),購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)心血管實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一煎制成濃縮湯劑(含生藥0.652 g/mL)。阿司匹林(拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn),批號(hào):BJ33812);氯吡格雷(深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批號(hào):FF17090);RNA提取試劑Trizol Reagent(由Invitrogen Life Technologies公司提供,批號(hào):15596-026);熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司);PCR試劑盒、PCR引物 (武漢谷歌生物試劑有限公司提供)。

        1.3 分組及造模

        按體質(zhì)量分層,再按隨機(jī)表隨機(jī)分組,分為假手術(shù)組、模型組、心痛方組、雙抗組(阿司匹林+氯吡格雷),各20只。根據(jù)改進(jìn)的大鼠AMI模型制備法[3]對(duì)模型組、心痛方組及雙抗組大鼠進(jìn)行造模。以左心室前壁顏色變白和運(yùn)動(dòng)減弱且心電圖顯示Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背向上抬高≥0.1 mV或出現(xiàn)病理性Q波為結(jié)扎成功的標(biāo)志(S-T段無(wú)改變者淘汰)。假手術(shù)組僅開(kāi)胸,不結(jié)扎。術(shù)后7 d假手術(shù)組存活17只,模型組存活13只,心痛方組存活15只,雙抗組存活14只。

        1.4 給藥方法

        造模(或假手術(shù))后2 h開(kāi)始給藥,以60 kg人臨床用藥量為標(biāo)準(zhǔn),參照劑量-體表面積換算方法計(jì)算大鼠給藥量,藥物濃度按1 mL/100 g體質(zhì)量配制。心痛方組予心痛方 6.52 g/kg,雙抗組予阿司匹林 13.05 mg/kg、氯吡格雷26.10 mg/kg,模型組和假手術(shù)組分別予等量生理鹽水灌胃。每日1次,連續(xù)7 d。

        1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

        1.5.1 心肌病理組織學(xué)檢測(cè)并心肌損傷程度評(píng)分及心梗面積測(cè)定 灌胃給藥7 d后處死大鼠,取各組大鼠心肌梗死區(qū)組織,將組織浸沒(méi)于4%多聚甲醛中24 h固定,取出固定材料常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋、切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。觀察心肌病理學(xué)變化,并于光鏡下根據(jù)心肌形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行心肌損傷程度評(píng)分[4]:心肌纖維排列整齊、無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、無(wú)壞死記0分;心肌纖維凝固性壞死并出現(xiàn)輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)記1分;大量心肌纖維出現(xiàn)凝固性壞死并重度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)記2分。用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每張HE染色切片上的梗死區(qū)面積,計(jì)算心梗部分占心肌橫斷面面積的百分比。

        1.5.2 逆轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)檢測(cè)心肌 MMP-9mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)水平 取100 mg心肌組織加入Trizol試劑1 mL,按產(chǎn)品說(shuō)明步驟提取心肌總RNA。引物序列如下。 MMP-9(283 bp):上游 5′-GCAAACCCTGCGTATTTCCATT-3′; 下游 5′-GCGATAACCATCCGAGCGAC-3′。TIMP-1(326bp):上游 5′-TAAAGCCTGTAGCTGTGCCC-3′; 下游 5′-CATAACGCTGGTA TAAGGTGGTC-3′。 GAPDH(482 bp):上游 5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′, 下游 5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′。 RT-PCR 反 應(yīng) 體 系 :10×PCR Buffer 2.5 μL,25 mol/L MgCl21.5 μL,10 mmol/L dNTP 1 μL,Taq 酶 0.2 U,cDNA 2 μL,引物量 10 pmol。 總體系25 μL。反應(yīng)條件:94℃ 5 min,然后進(jìn)入PCR循環(huán),94℃預(yù)變性30 s,分別于60℃和58℃退火30 s,72℃延伸45 s,循環(huán)33次后再延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL于1.5%瓊脂糖凝膠電泳,然后在凝膠成像系統(tǒng)上掃描,測(cè)定各目的基因和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度值,分別計(jì)算其比值。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        2 結(jié) 果

        2.1 各組大鼠心肌組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。結(jié)果示,假手術(shù)組MMP-9 mRNA表達(dá)最少(P<0.01)。模型組MMP-9 mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,心痛方組、雙抗組MMP-9 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與假手術(shù)組相比,心痛方組、雙抗組MMP-9 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)。心痛方組、雙抗組比較,雙抗組MMP-9 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)。與模型組比較,心痛方組、雙抗組TIMP-1 mRNA 表達(dá)顯著增高(P<0.01),且心痛方組更有優(yōu)勢(shì)(P<0.01)。與假手術(shù)組相比,模型組MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA 的比值明顯增高(P < 0.01),TIMP-1 mRNA 的比值明顯降低(P<0.01)。與假手術(shù)組相比,心痛方組、雙抗組MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的比值升高(P<0.01)。心痛方組、雙抗組比較,雙抗組MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA 的比值升高(P<0.01)。

        表1 各組大鼠心肌組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)比較(±s)

        表1 各組大鼠心肌組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)比較(±s)

        與假手術(shù)組比較,△P<0.01;與模型組比較,*P<0.01;與心痛方組比較,#P<0.01。 下同。

        組別 n MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA假手術(shù)組 17 0.36±0.02模型組 13 0.93±0.01△心痛方組 15 0.45±0.01△*0.47±0.04 1.30±0.07 1.23±0.05△ 1.32±0.05 0.71±0.04△* 1.58±0.05△*雙抗組 14 0.57±0.01△*#0.84±0.03△*# 1.47±0.05△*#

        2.2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變、心肌損傷程度評(píng)分及心梗面積測(cè)定 見(jiàn)圖1,表2。如圖1示,假手術(shù)組心肌纖維著色均勻,排列整齊、規(guī)則,胞界清楚,間質(zhì)未見(jiàn)異常;模型組大鼠心肌纖維出現(xiàn)大量凝固性壞死并伴有重度嗜中性粒細(xì)胞點(diǎn)狀浸潤(rùn),心肌纖維水腫,肌漿疏松、淡染;心痛方組、雙抗組心肌纖維壞死程度及嗜中性粒細(xì)胞點(diǎn)狀浸潤(rùn)較模型組明顯減輕,只有部分心肌纖維水腫。如表2示,與假手術(shù)組比較,模型組、雙抗組心肌形態(tài)學(xué)評(píng)分增高(P<0.01),心痛方組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,心痛方組、雙抗組評(píng)分明顯降低(P<0.01);與心痛方組比較,雙抗組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。各給藥組心梗面積與模型組相比均縮?。≒<0.01),心痛方組在縮小心梗面積上較雙抗組更有優(yōu)勢(shì)(P<0.05)。

        圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE染色,400倍)

        表2 各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?cè)u(píng)分及心梗面積比較(±s)

        表2 各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?cè)u(píng)分及心梗面積比較(±s)

        組 別 n 心肌形態(tài)學(xué)評(píng)分(分) 心梗面積(%)假手術(shù)組 17 0.18±0.39模型組 13 1.69±0.48△ 35.43±1.44心痛方組 15 0.60±0.63# 22.12±0.96*雙抗組 14 0.93±0.73△ 23.19±0.89#*

        2.3 各組大鼠心肌MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變相關(guān)性分析 見(jiàn)表3。大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與各組大鼠對(duì)應(yīng)心肌形態(tài)學(xué)評(píng)分呈正直線相關(guān)(r=0.684,P=0.00)。

        表3 大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變相關(guān)性分析

        2.4 大鼠心肌MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與心梗面積相關(guān)性分析 見(jiàn)表4。大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與模型組、心痛方組、雙抗組對(duì)應(yīng)心梗面積呈正直線相關(guān)(r=0.975,P=0.00)。

        表4 大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值與心梗面積相關(guān)性分析

        3 討 論

        研究發(fā)現(xiàn),MMPs和TIMPs共同參與了許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,合理調(diào)控MMPs的活性與表達(dá)有利于心血管疾病的治療。而動(dòng)脈粥樣硬化是公認(rèn)的在幾個(gè)不同疾病階段發(fā)生的炎癥反應(yīng)過(guò)程,其中有許多是與MMPs的活性改變有關(guān)。正常生理情況下,MMPs/TIMPs保持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。血管細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白、彈性蛋白能夠被這些激活的MMPs降解,從而導(dǎo)致血管的老化以及動(dòng)脈粥樣硬化的形成[5]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的主要成員,也是冠心病的一個(gè)重要炎癥因子,可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的滲出,并與ACS的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系[6]。研究表明,ACS早期炎癥活動(dòng)較顯著,AMI患者M(jìn)MP-9水平明顯升高[7]。在AMI發(fā)生后,MMP-9的活性增加,從而促進(jìn)膠原蛋白的降解[8-9]。且 MMP-9 的表達(dá)與心肌受損程度相關(guān)[10],其對(duì)AMI患者的不良預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值[11-12]。而TIMP-1是MMP-9的特異性抑制物,通過(guò)與MMP-9特異性結(jié)合,能夠抑制MMP-9的活性,減少M(fèi)MP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解[13],從而維持ECM的動(dòng)態(tài)平衡。本研究發(fā)現(xiàn),造模后實(shí)驗(yàn)組MMP-9 mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01);與模型組比較,心痛方組及雙抗組MMP-9 mRNA表達(dá)減少(P<0.01),TIMP-1 mRNA表達(dá)增加(P<0.01),提示大鼠心肌梗死后發(fā)生了MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA活性變化,心痛方組及雙抗組可降低MMP-9 mRNA表達(dá),增加TIMP-1 mRNA活性,從而調(diào)節(jié)MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的平衡。

        心肌梗死屬中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”“真心痛”等范疇,其可由寒邪內(nèi)侵、飲食不節(jié)、情緒失調(diào)、勞逸失節(jié)、年邁體虛等相互作用所致,病機(jī)總概括為“不榮而痛”與“不通而痛”共存,其中心絡(luò)不暢或不通為其病機(jī)之基礎(chǔ),氣血不榮為疼痛之理。其發(fā)病與痰瘀密切相關(guān),痰瘀互結(jié)證為其常見(jiàn)證候,也是急性心肌梗死發(fā)病的重要病理因素。心痛方根據(jù)疏肝化瘀豁痰法立方,由柴胡、瓜蔞、川芎、桃仁、蒲黃、白芥子、郁金、九香蟲(chóng)、甘草組成,主治痰瘀互結(jié)氣郁證胸痹心痛,化痰與祛瘀并舉,冀脈絡(luò)通暢,氣血安和,心痛之疾可瘥,因而臨床療效確切?,F(xiàn)代藥理研究亦表明,心痛方中多味中藥對(duì)于冠心病均有良好療效,如柴胡具有抗氧化、抗血小板凝集等諸多作用[14];川芎中酚酸類化合物具有抑制血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、清除自由基等藥理活性[15];桃仁石油醚提取物可能對(duì)心肌缺血損傷有改善作用,并對(duì)急性心肌梗死有較好的防治作用[16];九香蟲(chóng)具有明顯的抗凝血作用,其蟲(chóng)體水煎液體外可抑制家兔血小板聚集[17]。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn),心痛方能使AMI大鼠心肌組織MMP-9 mRNA表達(dá)減少,增加TIMP-1 mRNA的表達(dá),有效減少AMI大鼠心梗面積,使心肌損傷程度降低,提示心痛方對(duì)急性缺血缺氧后心肌具有明顯保護(hù)作用。心痛方治療AMI的作用機(jī)制之一可能是對(duì)MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA活性表達(dá)的有效調(diào)控,通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的平衡來(lái)實(shí)現(xiàn),但具體機(jī)制尚未明確,尚需進(jìn)一步研究。

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        Effect of Xintong Decoction on the Expression of MMP-9 mRNA and TIMP-1mRNA in Acute Myocar-dial Infarction Rats

        XIE Rongyuan,F(xiàn)AN Jinru,ZHOU Feiran,et al. Hunan University of Chinese Medicine,Hunan,Changsha 410208,China.

        Objective:To investigate the effect of Xintong Decoction on the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) mRNA,tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) mRNA and effects on myocardial morphology in acute myocardial infarction (AMI) rats,and to explore the therapeutic mechanism of Xintong Decoction on AMI.Methods:80 SD rats were randomly divided into sham operation group (A group),the model group(group B),Xintong Decoction group(group C),and Dual anti-platelet group (aspirin+clopidogrel,group D).AMI model was established by coronary artery ligation method.Rats were killed 7 days after intragastric administration.Expression of MMP-9 mRNA and TIMP-1 mRNA in myocardium were observed by RT-PCR,and morphological changes were observed by HE staining.Results:Xintong Decoction could reduce the expression of MMP-9 mRNA(P < 0.01),increase the expression of TIMP-1 mRNA(P<0.01),and decrease the ratio of MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA in AMI rats(P < 0.01).The degree of myocardial injury and the area of myocardial infarction were positively correlated with MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA ratio.Conclusion:Xintong Decoction has protective effects on AMI ischemic myocardium,and its mechanism may be related to increasing the expression of TIMP-1 mRNA,reducing the expression of MMP-9 mRNA and thus regulating the balance of MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA.

        Acute myocardial infarction;Xintong Decoction;MMP-9 mRNA;TIMP-1 mRNA

        R285.5

        A

        1004-745X(2017)11-1922-04

        10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.012

        湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(16A159)

        △通信作者(電子郵箱:fanjr218@sina.com)

        2017-08-10)

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