王瑩威 劉 蕾 張 瑤 魏明慧

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150036；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

益氣降濁顆粒對冠心?。ㄌ禎嵫鲂停┘彝醚?、miR-21及TGFβRⅡ表達(dá)的影響*

王瑩威1△劉 蕾2張 瑤2魏明慧3

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150036；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

目的觀察益氣降濁顆粒對冠心?。ㄌ禎嵫鲂停┘彝醚軆?nèi)microRNA-21（miR-21）和TGFβRⅡmRNA表達(dá)水平的影響。方法本實(shí)驗(yàn)采用冠心病（痰濁血瘀型）家兔模型作為研究對象，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)觀察miR-21和TGFβRⅡ mRNA在家兔主動脈的表達(dá)情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)中空白組、中藥組、模型組中TGFβRⅡ的表達(dá)與miR-21具有相關(guān)性（r=-0.564，P＜0.05），而中藥干預(yù)下的動脈硬化模型家兔TGFβRⅡ的表達(dá)水平較模型組顯著降低，同時(shí)可使血脂TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高（P<0.05）。結(jié)論益氣降濁顆?？梢燥@著降低血管中miR-21和TGFβRⅡ的表達(dá)，益氣降濁顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)miR-21和TGFβRⅡ的表達(dá)發(fā)揮其穩(wěn)定斑塊的作用。

冠心病 益氣降濁顆粒 miR-21 TGFβRⅡ

冠心?。–HD）是心血管疾病中極為常見一類炎性病變，冠狀動脈的粥樣硬化是其特征之一，嚴(yán)重威脅到人類的生命、健康、以及生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA（miRNAs）是一類非編碼的單鏈RNA，其中miR-21與心血管疾病關(guān)系密切，而TGFβRⅡ同時(shí)作為其靶基因，深受學(xué)者廣泛關(guān)注。多項(xiàng)研究證實(shí)，miR-21和TGFβRⅡ的表達(dá)與炎癥反應(yīng)［1］及心血管疾?。?-3］方面存在一定的相關(guān)性，而炎癥與動脈斑塊的穩(wěn)定與否密切相關(guān)。近代研究中藥干預(yù)下對冠心病的治療取得一定的療效，前期的臨床研究中，益氣降濁湯在臨床上對于冠心病的治療已取得成效［4］。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飼料飲食喂養(yǎng)，構(gòu)建冠心病痰濁血瘀型家兔，觀察血管中血脂、miR-21及TFGβRⅡ的變化情況，意在探究益氣降濁顆粒對冠心?。ㄌ禎嵫鲂停┘彝醚苤衜iR-21及TFGβRⅡ的影響，通過抑制miR-21及TFGβRⅡ的表達(dá)，明確中藥制劑對冠心病的療效，進(jìn)一步探索益氣降濁顆粒是否有穩(wěn)定斑塊的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 常規(guī)喂養(yǎng)2周的4～5月齡健康新西蘭大白兔30只，雄性，清潔級，體質(zhì)量3.0～3.8 kg，平均（3.27±1.35）kg，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。 動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（2015）-0026。

1.2 試藥儀器 益氣降濁顆粒由黃芪、苦參、當(dāng)歸、莪術(shù)、川芎藥物組成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制備。miR-21和TGFβRⅡ的引物，來自上海生物工程有限公司；兔免疫組化試劑盒，（批號030403），來自北京博奧森公司；膽固醇（TC）、甘油三酯（TG），低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C） 測定試劑盒 （批號分別為111221，114751，110421，113753），由中北北控生物科技股份有限公司提供。

1.3 分組與給藥 將30只兔分為兩組，一組10只喂養(yǎng)普通飼料為空白組作對照；另一組20只持續(xù)喂養(yǎng)8周高脂飼料 （配方：膽固醇1%，蛋黃粉15%，豬油15%，基礎(chǔ)飼料79%），構(gòu)建冠心病痰濁血瘀模型。造模過程中，1只兔死于感染。造模成功后，將19只兔隨機(jī)分為模型組9只、中藥組10只。中藥組以益氣降濁顆粒溶于150 mL生理鹽水灌胃2周，同時(shí)模型組以等容積的生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后氣體栓塞法處死動物。給藥過程中，1只兔（中藥組）意外猝死。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 血漿中血脂指標(biāo)（TC，TG，LDLC，HDL-C），從實(shí)驗(yàn)開始進(jìn)行檢測，第8周再測一次，發(fā)現(xiàn)模型組相關(guān)血脂水平平均達(dá)到正常組的6～10倍，預(yù)測造模成功，實(shí)驗(yàn)第10周，對3組兔頸動脈插管進(jìn)行取血，觀察血脂、miR-21及TGFβRⅡ的表達(dá)。取血成功后，繼續(xù)抽血待兔血液抽盡，剖腹，取出定位并分離主動脈弓，取主動脈弓3、4、5段行miR-21及TGFβRⅡ的熒光定量PCR檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用成組 t檢驗(yàn)，PCR 數(shù)據(jù)以Pearson法進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 空白組與模型組第8周血脂水平比較 見表1。與空白組比較，模型組TC、TG、LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低 （P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示造模成功。

表1 空白組與模型組第8周血脂水平比較（mEq/L，±s）

表1 空白組與模型組第8周血脂水平比較（mEq/L，±s）

與空白組比較，△P<0.05。

組別 n TC TG HDL-C LDL-C空白組 10 2.57±2.15 0.67±0.41 1.75±0.49 1.62±1.21模型組 19 30.17±6.31△ 1.73±1.15△ 0.71±0.61△ 18.65±5.08△

2.2 各組治療2周后血脂變化及miR-21、TGFβRⅡ表達(dá)水平比較 見表2。與空白組比較，模型組TC、TG、LDL-C的指標(biāo)明顯升高，HDL-C明顯降低 （P＜0.05）；與模型組比較，中藥組 TC、TG、LDL-C 水平明顯降低，HDL-C 水平明顯升高（P＜0.05）。

表2 各組治療2周后血脂變化及miR-21、TGFβRⅡ表達(dá)水平比較（±s）

與空白組比較，△P＜0.05；與中藥組比較，▲P＜0.05。

組 別 n TC（mEq/L） TG（mEq/L） HDL-C（mEq/L）LDL-C（mEq/L）miR-21 TGFβRⅡ空白組 10中藥組 9 2.79±1.96 0.87±0.62 1.93±0.54 22.16±5.24 1.47±1.26 1.08±0.69 1.49±1.37 15.36±5.74 20.15±10.52 0.08±0.05 51.21±15.48 0.13±0.04模型組 9 32.59±8.58 1.93±1.31 0.57±0.59 27.28±8.45 80.42±32.21 0.20±0.08

2.3 各組miR-21及TGFβRⅡ的表達(dá)水平比較 見表2。與空白組比較，模型組miR-21、TGFβRⅡ的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組miR-21、TGFβRⅡ的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。 miR-21和TGFβRⅡ的相關(guān)性研究：行Pearson相關(guān)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為r=-0.564，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

冠心病在中醫(yī)范疇屬“胸痹”，屬于本虛標(biāo)實(shí)之證，主要病機(jī)為心脈瘀阻，其痰濁血瘀證型逐漸占領(lǐng)冠心病致病因素的主導(dǎo)，成為臨床重要證型之一［5-6］。近年越來越多的中藥制劑對動脈粥樣硬化的療效顯著［7-9］。筆者曾運(yùn)用益氣降濁湯改善冠心病的心肌缺血癥狀［10］，尤其是痰瘀互結(jié)的胸痹心痛取得較好療效。益氣降濁顆粒由益氣降濁湯變換劑型而來。此顆粒制作簡單，易于服用，價(jià)格低廉。益氣降濁顆粒由黃芪、苦參、當(dāng)歸、莪術(shù)、川芎組成，其中黃芪補(bǔ)脾益氣為君，氣行則營衛(wèi)和，莪術(shù)破血行氣，苦參清利痰濕，川芎辛散溫通，燥濕行氣，與苦參相合，活血祛瘀止痛共為臣藥，再佐以當(dāng)歸養(yǎng)血活血，亦有防莪術(shù)破血伐氣之力太過之功效。諸藥配伍，使痰飲化，瘀血散，脈道暢，胸陽展，從而能夠明顯改善冠心病 （痰濁血瘀型）所引起的心臟不適癥狀?，F(xiàn)代藥理研究顯示，黃芪具有抗氧化作用，抑制炎癥反應(yīng)［11］；苦參能夠明顯改善高脂血癥的水平［12］；川芎具有抑制炎癥反應(yīng)，改善脂質(zhì)代謝，穩(wěn)定斑塊等作用［13］；莪術(shù)具有抗炎抗氧化、抗動脈硬化的作用［14］。

多項(xiàng)研究顯示，冠心病的發(fā)病機(jī)制為動脈粥樣硬化，動脈粥樣硬化與 miR-21、TGFβRⅡ息息相關(guān)［15-16］，miR-21具有調(diào)控基因的表達(dá)，改善動脈的粥樣硬化，而miR-21和TGFβRⅡ同時(shí)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡等變化過程，與心血管疾病的演變密切相關(guān)［17］，在炎癥和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)等方面也被認(rèn)為發(fā)揮了重要作用［18］，同時(shí)冠心病又是一種炎癥病變，在其演變過程中，miR-21和TGFβRⅡ分子水平出現(xiàn)了異常的升高。相關(guān)資料顯示，通過抑制miR-21和TGFβRⅡ的表達(dá)，可糾正炎性病變，調(diào)控心肌細(xì)胞，從而改善冠心病冠脈的病變程度［19］。經(jīng)調(diào)查得知，miRNA與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但在中醫(yī)證候類型上卻少有研究［20］。本實(shí)驗(yàn)從冠心?。ㄌ禎嵫鲂停┘彝媚Ｐ椭郑⑵浣朴谂R床冠心病的病理學(xué)改變。研究表明，miR-21和TGFβRⅡ參與了動脈粥樣硬化的過程，在炎性細(xì)胞、心肌細(xì)胞中存在不同程度的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，中藥組與模型組比較，miR-21和TGFβRⅡ表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），從而證明益氣降濁顆粒能顯著降低兔血漿中miR-21、TGFβRⅡ的水平。

因此，益氣降濁顆粒對于冠心病家兔血管中miR-21和TGFβRⅡ表達(dá)有顯著的降低作用，尤其是對痰濁血瘀型冠狀動脈病變有明顯的療效。同時(shí)益氣降濁顆粒能夠改善冠心病斑塊中的脂質(zhì)水平，調(diào)控炎癥反應(yīng)過程，進(jìn)而對穩(wěn)定斑塊有一定的作用。然而當(dāng)代對血管中miR-21和TGFβRⅡ的表達(dá)抑制，采用中醫(yī)藥治療方案卻少有報(bào)道，這很有可能成為未來臨床治療冠心病的又一研究方向。

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Effect of Yiqi Jiangzhuo Granule on Expression of miR-21 and TGFβRⅡ in Coronary Heart Disease Rabbits with Phlegm and Blood Stasis Type

WANG Yingwei，LIU Lei，ZHANG Yao，et al. The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150040，China.

Objective：To investigate the effect of Yiqi Jiangzhuo Granule on the expression of microRNA-21（miR-21） and TGFβRⅡ mRNA in coronary heart disease rabbits with phlegm and blood stasis type.Methods：The rabbit model of coronary heart disease with phlegm and blood stasis was selected as the study objects.The expression of miR-21 and TGFβRⅡ mRNA in the blood vessels was observed by fluorescence quantitative PCR.Results：The expression of TGFβRⅡ was significantly correlated with miR-21 in the blank group，Chinese medicine group and the model group （r=-0.564P＜0.05），and the expression of TGFβRⅡ in the atherosclerosis model group reduced more significantly than that in the model group.The levels of TC，TG and LDL-C were decreased and HDL-C was increased （P<0.05）.Conclusion：Yiqi Jiangzhuo Granule can significantly reduce the expression of miR-21 and TGFβRⅡ in the blood vessel，and Yiqi Jiangzhuo Granule may play its role as a stable plaque by regulating the expression of miR-21 and TGFβRⅡ.

CHD；Yiqi Jiangzhuo Granule；miR-21；TGFβRⅡ

R285.5

A

1004-745X（2017）11-1919-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.011

黑龍江省自然科學(xué)基金（H201460）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目

△通信作者（電子郵箱：13836113901@163.com）

2017-08-09）