楊惠宇+張惠峰

摘 要：建立了采用Oasia PRiME HLB固相萃取柱凈化-超高效液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）快速測(cè)定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留的方法。樣品加入同位素內(nèi)標(biāo)，超聲衍生化后用乙酸乙酯超聲提取，經(jīng)Oasia PRiME HLB固相萃取柱一次性凈化后上機(jī)檢測(cè)，電噴霧-正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，內(nèi)標(biāo)法定量。該方法將測(cè)試時(shí)間縮短至4小時(shí)。結(jié)果顯示，4種硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)限為0.01 μg/kg，定量限為0.03 μg/kg，在0.05～10 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，4種硝基呋喃類代謝物相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，5個(gè)添加濃度水平的平均回收率為88.5%～115.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8，說明該方法快速、準(zhǔn)確并且重復(fù)性好。

關(guān)鍵詞：硝基呋喃類代謝物；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；水產(chǎn)品；超聲衍生化

近年來，藥物殘留已成為影響中國(guó)水產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素，而硝基呋喃類藥物因其價(jià)格便宜、抗菌效果好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1-2]，同樣也是檢出率最高的違禁藥物之一[3-4]，因此，為確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全和漁業(yè)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展，建立準(zhǔn)確可靠、靈敏度高的硝基呋喃類藥物及其代謝物的定量定性方法具有深遠(yuǎn)意義。由于硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)可迅速代謝，通過測(cè)定母體化合物的含量是不合適的，因此在水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中主要檢測(cè)硝基呋喃類代謝物[5]。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的檢測(cè)方法除質(zhì)譜分析法還有免疫分析法、光譜分析等[6-7]。硝基呋喃類代謝物一般經(jīng)衍生化后，采用液液萃取、固相萃取、凝膠滲透色譜、免疫親和色譜、超臨界流體萃取、分子印跡、平行蒸發(fā)等方法提取凈化后，用液相色譜法或質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)[8-10]。此外，還有一些新興的方法應(yīng)用于水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)，如原子吸收法[11]、流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)（FI-CL）[12]、液相色譜電化學(xué)檢測(cè)器（LC-ECD）[13]，太赫茲時(shí)域光譜（THz-TDS）[14]等，但是使用最為普遍的是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法[15-18]。筆者首次在樣品前處理過程中采用超聲衍生化結(jié)合Oasia PRiME HLB固相萃取凈化的方法，并利用超高效液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)快速測(cè)定水產(chǎn)品中4種硝基呋喃類代謝物殘留量。檢測(cè)過程僅需4 h，為水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物的檢測(cè)提供快速、準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜Xevo TQS（UPLC-MS/MS）：美國(guó)WATERS公司；BSD-250型震蕩培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TTL-DCI型氮吹儀：北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；TE212-L電子天平：德國(guó)Sartorius公司；Research plus移液器：德國(guó)Eppendorf公司； KQ-800KDE型高功率數(shù)控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；漩渦振蕩器：德國(guó)IKA公司，Oasia PRiME HLB固相萃取柱，（WATERS公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 試劑

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）、甲酸、乙酸銨、正己烷：Fisher Chemicals公司；鹽酸：北京化工廠；2-硝基苯甲醛（2-NBA 衍生化試劑）：ACROS公司；磷酸氫二鉀和二甲亞砜均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

呋喃唑酮代謝物 3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidone AOZ，純度99.3±0.3%，Dr Ehrenstorfer公司）、呋喃西林代謝物氨基脲（semicarbazide SEM，純度99.5%）、呋喃妥因代謝物1-氨基-2-內(nèi)酰脲（1-aminohydantoin AHD，純度99.3%）和呋喃它酮代謝物5-甲基嗎啉-3-2-唑烷基酮（5-morpholinomethy-3-amino-2-oxazolidone AMOZ，99.6%）。氘、碳-13氮-15標(biāo)記的硝基呋喃類代謝物同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（AOZ-D4、SEM-HCl-13C-15N2、AHD-13C3、AMOZ-D5，純度分別為98.7±0.3%、98.5±0.5%、98.7±0.3%、99.5±0.3%），購(gòu)自WITEGA公司。

硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存期為180 d，硝基呋喃類代謝物同位素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成濃度為100 μg/mL的同位素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存期180 d。使用時(shí)用純水將標(biāo)準(zhǔn)品和同位素混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成濃度為10 ng/mL和 100 ng/mL的工作溶液。保存條件：呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物為常溫保存，其它幾種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為4 ℃條件下保存。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm 1.7 μm）；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：A為2 mmol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫程序如表1。

1.4.2 質(zhì)譜條件 ESI正離子化模式；儀器型號(hào)：Waters Xevo TQS；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）；錐孔電壓：40 V； 毛細(xì)管電壓：0.9 kV； 脫溶劑氣溫度：500 ℃

1.4.3 樣品前處理方法 水產(chǎn)品取可食部分，經(jīng)勻漿制肉糜。稱取約2 g樣品（精確到0.001 g）于50 mL離心管中，加入50 μL同位素混合內(nèi)標(biāo)工作液（100 ng/mL），渦旋震蕩30 s，再加入5 mL 水、1 mL鹽酸溶液（4 mol/L）和300 μL的二硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），渦旋震蕩30 s，置于超聲清洗儀中超聲2 h（溫度控制在35～60 ℃之間）。取出樣品，冷卻至室溫，加入磷酸氫二鉀溶液調(diào)pH值至7.4（±0.2），加入4 mL乙酸乙酯漩渦震蕩60 s，4 000 r/min離心5 min，重復(fù)提取一次，合并上清液直接過Prime HLB固相萃取小柱，收集濾液至10 mL離心管中，40 ℃下水浴氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1 mL甲醇溶液（20%），漩渦震蕩混合2 min，過0.22 μm濾膜，待上機(jī)檢測(cè)。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

本方法選擇了ACQUITY UPLC BEH C18柱，該色譜柱在保證良好分離效果的基礎(chǔ)上，縮短了一半的分離時(shí)間。比較了以乙腈-水和甲醇-水溶液作為流動(dòng)相，對(duì)于硝基呋喃類代謝物的色譜分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-水作為流動(dòng)相更有利于目標(biāo)物的分離，能夠得到更好的線性關(guān)系，并能獲得較低的檢出限，提高了分析的靈敏度。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)選定硝基呋喃類代謝物相應(yīng)的定量、定性子離子，并結(jié)合儀器的實(shí)際情況，分別對(duì)錐孔電壓、碰撞能量和選擇離子等進(jìn)行充分的優(yōu)化，優(yōu)化條件如表2。

2.3 前處理方法的選擇

水解和衍生化條件：按照上述方法在35～60 ℃水浴中超聲，結(jié)果表明水浴溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果沒有顯著影響，衍生時(shí)間為120 min時(shí)可使實(shí)際樣品中與蛋白結(jié)合的硝基呋喃類代謝物水解較充分，并使衍生化反應(yīng)順利進(jìn)行。

水產(chǎn)品樣品中含有大量磷脂、脂肪等親脂性雜質(zhì)，干擾了目標(biāo)化合物的分析，同時(shí)降低色譜柱的使用壽命，易污染質(zhì)譜，并嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性。本方法采用乙酸乙酯提取液直接通過Oasia PRiME HLB固相萃取柱，將干擾物質(zhì)吸附于固相萃取柱中。該SPE柱對(duì)磷脂、脂肪等親脂性雜質(zhì)凈化效果較好，并且對(duì)目標(biāo)化合物無吸附作用。經(jīng)凈化后的樣品氮吹干后直接定容，不需正己烷去脂、離心等操作。相較一般的固相萃取省去了溶劑轉(zhuǎn)換過程，縮短了檢測(cè)時(shí)間。

2.4 儀器線性范圍和檢出限、定量限的測(cè)定

在系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入50 μL同位素混合內(nèi)標(biāo)，按上述實(shí)驗(yàn)步驟操作，以硝基呋喃代謝物濃度為橫坐標(biāo)，以各特征離子質(zhì)量色譜峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比為總坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表3。結(jié)果表明線性范圍為0.05～10 μg/kg，且相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上。以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限，以10倍信噪比確定方法的定量限，經(jīng)確證得出結(jié)果見表3。計(jì)算信噪比相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為AOZ 2.38%、AMOZ 3.06%、SCA 2.83%、AHD 2.89%，均在允許范圍內(nèi)。

2.5 方法的精密度和回收率

取不含硝基呋喃類藥物的樣品，準(zhǔn)確稱取2.00 g，分別做4種硝基呋喃類代謝物的5個(gè)添加水平，濃度從0.025～2 μg/kg，每個(gè)做3份平行，按照樣品的操作過程進(jìn)行提取、凈化和測(cè)定，每個(gè)添加水平在相同條件下做6個(gè)平行樣品，用標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)樣品，計(jì)算每個(gè)樣品的濃度，計(jì)算加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）如表4：

2.6 樣品分析

按照本文方法對(duì)2017年農(nóng)業(yè)部考核樣品進(jìn)行檢測(cè)，回收率在70%～120%之間，檢測(cè)結(jié)果合格，說明該方法能夠達(dá)到檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的要求。

3 結(jié)論

本工作建立了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的快速檢測(cè)方法，該方法與傳統(tǒng)方法比較，操作簡(jiǎn)單快速，有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，靈敏度高、穩(wěn)定性好，結(jié)果重現(xiàn)性好，可廣泛用于大批量水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的高效快速檢測(cè)。

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