潘訓(xùn)彬+張秀霞+冼健安

摘 要：氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的常見(jiàn)毒性污染物之一，為探討氨氮對(duì)紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）血細(xì)胞的細(xì)胞毒性機(jī)制，研究了氨氮脅迫作用下紅螯螯蝦血細(xì)胞凋亡狀態(tài)的變化。以17.6 mg/L氨氮對(duì)紅螯螯蝦幼蝦進(jìn)行急性脅迫，于脅迫后的0、48、72和96 h取血淋巴，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定血細(xì)胞總數(shù)（THC）、胞內(nèi)游離Ca2+含量、線粒體膜電位（MMP）和血細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，紅螯螯蝦的THC在脅迫的72 h開(kāi)始有顯著的下降，在96 h時(shí)達(dá)到最低值；血細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+含量在48 h開(kāi)始有顯著的升高，在96 h達(dá)到最高值；血細(xì)胞MMP在72 h開(kāi)始有顯著的下降，在96 h達(dá)到最低值；血細(xì)胞凋亡率在72 h開(kāi)始有顯著的升高，在96 h時(shí)達(dá)到最高值，為9.39%。這些結(jié)果表明，胞內(nèi)游離Ca2+含量是對(duì)氨氮脅迫最為敏感的指標(biāo)；氨氮急性脅迫誘導(dǎo)紅螯螯蝦血細(xì)胞發(fā)生了Ca2+參與調(diào)節(jié)、線粒體通路相關(guān)的細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致了THC的下降。

關(guān)鍵詞：氨氮；紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）；血細(xì)胞；凋亡；流式細(xì)胞術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)：X503.225文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，水體氨氮主要來(lái)源于水產(chǎn)動(dòng)物的氮代謝排泄物以及糞便和殘餌的氨化作用[1]。眾多研究表明，氨氮對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有較強(qiáng)的毒性[2-4]。隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)，氨氮容易不斷地積累于水環(huán)境中，從而對(duì)養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)生脅迫毒害作用。目前，氨氮對(duì)紅螯螯蝦毒性影響的研究仍甚少，主要集中在半致死濃度以及氨氮對(duì)生理生化的影響上[5-6]。蝦類(lèi)等甲殼動(dòng)物依賴(lài)先天性免疫進(jìn)行免疫防御，其中血細(xì)胞在細(xì)胞免疫和體液免疫過(guò)程中具發(fā)揮十分重要的作用。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究氨氮對(duì)紅螯螯蝦血細(xì)胞凋亡的影響，探討氨氮對(duì)紅螯螯蝦血細(xì)胞的細(xì)胞毒性以及氨氮的免疫抑制作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步研究如何提高紅螯螯蝦的抗氨氮脅迫能力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）購(gòu)自海南省瓊海市某養(yǎng)殖場(chǎng)，平均體重為（15.16±2.69）g，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下進(jìn)行馴養(yǎng)，水體環(huán)境條件為：pH 7.9～8.0，溫度24±2℃，一直保持曝氣。馴養(yǎng)一周后，選取健康無(wú)病患、附肢完整、處于蛻皮間期且反應(yīng)靈敏的螯蝦進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 氨氮脅迫

本研究組之前的試驗(yàn)結(jié)果顯示，氨氮對(duì)紅螯螯蝦幼蝦的安全濃度為8.8 mg/L，根據(jù)這一結(jié)果以及實(shí)際養(yǎng)殖水體情況，本試驗(yàn)設(shè)定的氨氮脅迫濃度為17.6 mg/L，以NH4Cl作為氨氮的來(lái)源進(jìn)行配制，不添加組作為對(duì)照組。試驗(yàn)在塑料儲(chǔ)物箱中進(jìn)行，每箱放置30 L水和幼蝦12尾，每組設(shè)置3個(gè)平行。試驗(yàn)期間不投喂，保持曝氣。為保證水體的氨氮濃度穩(wěn)定，預(yù)先配制17.6 mg/L氨氮的水，每24 h換水一次。于試驗(yàn)的0，48，72和96 h取樣測(cè)定。

1.3 血細(xì)胞懸液的制備

用2.5 mL一次性注射器吸取400 μl預(yù)冷的抗凝劑（葡萄糖20.5 g/L，檸檬酸鈉8 g/L，氯化鈉4.2 g/L，pH 7.5），然后從蝦的圍心腔抽取等量的血淋巴。取稀釋血淋巴200 μL，直接用于血細(xì)胞總數(shù)（THC）的測(cè)定，余下的稀釋血淋巴用預(yù)冷的抗凝劑進(jìn)一步稀釋?zhuān){(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)/mL，制得血細(xì)胞懸液，用于其它流式細(xì)胞術(shù)指標(biāo)的測(cè)定。每尾蝦的血淋巴作為一個(gè)單獨(dú)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 血細(xì)胞總數(shù)（Total haemocyte count，THC）

商品試劑SYBR GreenI（Sigma）的DMSO（二甲基亞砜）溶液的濃度為10 000×，以DMSO稀釋為1 000×的工作液。分別取稀釋血淋巴200 μL，加入2 μL SYBR GreenI工作液，使終濃度為10×，室溫避光孵育60 min，經(jīng) 200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACSCalibur）檢測(cè)，每個(gè)樣品上樣1 min。以第一熒光通道（FL1）獲取SYBR GreenI的綠色熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度大小劃分細(xì)胞碎片區(qū)域與完整細(xì)胞區(qū)域（完整細(xì)胞因包含完整的核酸，結(jié)合SYBR GreenI后發(fā)出強(qiáng)的綠色熒光，非細(xì)胞顆?；蚣?xì)胞碎片沒(méi)有核酸或核酸量少，SYBR GreenI結(jié)合量少，因而熒光強(qiáng)度弱），分析并記錄完整細(xì)胞的個(gè)數(shù)，每個(gè)樣品讀取3次。根據(jù)公式計(jì)算THC[7]。

1.5 胞內(nèi)游離Ca2+含量

分別取血細(xì)胞懸液200 μL，加入終濃度為10 μmol/L的Fluo-3/AM（Sigma），室溫避光孵育60 min，經(jīng) 200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以FL1獲取Fluo-3的綠色熒光強(qiáng)度，以FL1為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)作單參數(shù)直方圖，細(xì)胞的Fluo-3平均熒光強(qiáng)度與胞內(nèi)游離Ca2+含量成正比。

1.6 線粒體膜電位（MMP）

分別取血細(xì)胞懸液200 μL，加入終濃度為2 mmol/L的DIOC6（Sigma），室溫避光孵育10 min，經(jīng) 200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以FL1獲取DIOC6的綠色熒光強(qiáng)度，以FL1為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)作單參數(shù)直方圖，每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)，細(xì)胞的DIOC6平均熒光強(qiáng)度與MMP成正比。

1.7 血細(xì)胞凋亡率

以Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（Invitrogen）測(cè)定血細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟稍作調(diào)整來(lái)進(jìn)行。取血細(xì)胞懸液600 μL，以800g，4℃離心10min，棄上清后，細(xì)胞沉淀重懸于1 x Annexin V結(jié)合緩沖液中，使細(xì)胞濃度約為3 × 106 個(gè)/mL，每100 μL血細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI工作液，避光染色15 min后加入400 μL 1 x Annexin V結(jié)合緩沖液，200目篩網(wǎng)過(guò)濾后立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以FL1獲取FITC的綠色熒光強(qiáng)度，以FL2獲取PI的橙紅色熒光強(qiáng)度，以FL1為橫坐標(biāo)、FL2為縱坐標(biāo)作雙參數(shù)散點(diǎn)圖，用十字門(mén)劃分各類(lèi)細(xì)胞的區(qū)域（右下象限為前期凋亡細(xì)胞，右上象限為后期凋亡和死亡細(xì)胞，凋亡率為右下象限和右上象限的細(xì)胞所占的比例），每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)，分析凋亡細(xì)胞所占的比例。endprint

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果顯示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 18.0進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05確認(rèn)為差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞總數(shù)

如圖1所示，對(duì)照組螯蝦的THC為7.91×106～8.72×106個(gè)/mL。氨氮脅迫48 h時(shí)，螯蝦THC沒(méi)有顯著變化（P>0.05）；脅迫72 h時(shí)，與對(duì)照組相比，脅迫組螯蝦的THC開(kāi)始顯著下降（P<0.05），在96 h時(shí)達(dá)到最低值，為3.46×106個(gè)/mL；在脅迫120 h時(shí)，THC有所恢復(fù)，但仍顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

2.2 胞內(nèi)游離Ca2+含量

如圖2所示，與對(duì)照組相比，脅迫組螯蝦血細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+含量在48 h開(kāi)始有顯著的上升（P<0.05）；在96 h時(shí)達(dá)到了最高值，為對(duì)照組的2.82倍；在120 h有一定的下降，但仍顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

2.3 線粒體膜電位

如圖3所示，與對(duì)照組相比，脅迫組螯蝦血細(xì)胞MMP在72 h開(kāi)始有顯著的下降（P<0.05）；在96 h時(shí)達(dá)到最低值，為對(duì)照組的48.9%；在120 h有一定的恢復(fù)，但仍顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

2.4 血細(xì)胞凋亡率

如圖4所示，對(duì)照組螯蝦的血細(xì)胞凋亡率為2.46%～2.86%。與對(duì)照組相比，脅迫組螯蝦的血細(xì)胞凋亡率在72 h時(shí)開(kāi)始有顯著的提高（P<0.05）；在96 h達(dá)到最高值，為9.39%；在120 h下降為7.01%，但仍顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

3 討論

血細(xì)胞在蝦類(lèi)等甲殼動(dòng)物的免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，因此THC常作為體現(xiàn)蝦類(lèi)免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)。各種環(huán)境因子的脅迫作用均會(huì)導(dǎo)致蝦類(lèi)THC的顯著下降，從而對(duì)蝦類(lèi)的免疫功能產(chǎn)生了抑制作用[8-9]。還有研究認(rèn)為，THC下降到一定的閾值時(shí)會(huì)導(dǎo)致蝦類(lèi)的死亡[10]。因此，環(huán)境脅迫對(duì)THC的影響不容忽視。本研究前期的研究結(jié)果顯示，紅螯螯蝦的氨氮耐受能力較強(qiáng)，其幼蝦的氨氮安全濃度為8.8 mg/L，為使脅迫作用明顯，本試驗(yàn)設(shè)置了2倍的安全濃度作為脅迫濃度。以往的研究顯示，氨氮脅迫會(huì)導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）[11]、日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）[12]、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）[13]、日本沼蝦（M.nipponense）[14]、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）[15]等蝦類(lèi)的THC的下降。本研究結(jié)果也顯示，氨氮脅迫導(dǎo)致了紅螯螯蝦THC的顯著下降。也有研究得出了相反的結(jié)論，其研究結(jié)果顯示氨氮脅迫對(duì)羅氏沼蝦的THC沒(méi)有顯著影響[16]，但比較可發(fā)現(xiàn)，這一相反結(jié)果可能與該研究所設(shè)置的氨氮濃度以及取樣時(shí)間有關(guān)。該研究設(shè)置的氨氮濃度較低，為0.55～3.18 mg/L，可能對(duì)血細(xì)胞沒(méi)有產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性作用；該研究的取樣時(shí)間點(diǎn)僅為脅迫的第7天，取樣時(shí)間點(diǎn)太少，可能導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)了顯著影響的時(shí)期，本研究結(jié)果顯示，在脅迫48 h時(shí)THC沒(méi)有顯著變化，72 h時(shí)THC才開(kāi)始顯著下降，96 h時(shí)達(dá)到了最低值，而120 h時(shí)有一定的恢復(fù)，這些結(jié)果表明氨氮對(duì)THC的影響與脅迫時(shí)間有密切的關(guān)系。

亞硝酸鹽、重金屬等脅迫作用的研究報(bào)道顯示，血細(xì)胞數(shù)量的減少與血細(xì)胞被誘導(dǎo)發(fā)生凋亡有關(guān)[8-9]。高濃度氨氮脅迫會(huì)誘導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）血細(xì)胞中凋亡蛋白Caspase的表達(dá)量的顯著升高[17]。本研究結(jié)果顯示，氨氮脅迫72 h開(kāi)始，紅螯螯蝦血細(xì)胞凋亡率有顯著的升高，在120 h時(shí)，凋亡率有所下降，這些結(jié)果與THC的結(jié)果吻合，表明氨氮脅迫誘導(dǎo)了血細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致THC的下降。胞內(nèi)游離Ca2+含量的升高以及MMP的下降是細(xì)胞凋亡的兩個(gè)典型事件。在細(xì)胞凋亡的前期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等Ca2+庫(kù)受到損傷，其儲(chǔ)存的Ca2+被大量釋放到細(xì)胞質(zhì)中，造成胞質(zhì)內(nèi)的游離Ca2+含量的迅速升高，游離Ca2+含量會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)其它凋亡事情的發(fā)生[18]。本研究結(jié)果顯示，氨氮脅迫48 h開(kāi)始，血細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+含量已出現(xiàn)顯著的升高，此時(shí)THC、凋亡率和MMP仍未發(fā)生顯著的變化，表明胞內(nèi)游離Ca2+含量是對(duì)氨氮脅迫最為敏感的指標(biāo)，同時(shí)也表明氨氮所誘導(dǎo)的血細(xì)胞凋亡是一個(gè)Ca2+參與調(diào)節(jié)的凋亡過(guò)程。由于質(zhì)子泵存在于線粒體內(nèi)膜，可將線粒體基質(zhì)中的質(zhì)子泵入膜間隙，線粒體內(nèi)膜兩側(cè)形成的跨膜電位則MMP。正常的MMP是線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP所必需的。細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體膜的通透性發(fā)生改變，造成了MMP的下降，一些凋亡因子被釋放到胞質(zhì)中，誘導(dǎo)其它凋亡事件的進(jìn)一步發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示，氨氮脅迫可造成紅螯螯蝦血細(xì)胞MMP的顯著下降，這一結(jié)果與凋亡率的結(jié)果吻合，表明氨氮所誘導(dǎo)的血細(xì)胞凋亡是線粒體通路相關(guān)的細(xì)胞凋亡。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，氨氮脅迫作用對(duì)紅螯螯蝦血細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用，氨氮誘導(dǎo)血細(xì)胞發(fā)生了Ca2+參與調(diào)節(jié)、線粒體通路相關(guān)的凋亡，從而導(dǎo)致THC的下降。THC的下降可能引起螯蝦免疫力的下降，使螯蝦更容易受到病原體的感染，因此在養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)注意加強(qiáng)對(duì)水體氨氮含量的控制，在氨氮積累較為嚴(yán)重的養(yǎng)殖后期，更應(yīng)注意預(yù)防疾病的爆發(fā)。

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