李曉敏，蔡國(guó)林，李兵，尹花，陸健*

1(啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266100) 2(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

阿魏酸酯酶對(duì)麥汁過(guò)濾性能的影響

李曉敏1,2，蔡國(guó)林2，李兵2，尹花1，陸健2*

1(啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266100) 2(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

研究比較了過(guò)濾性能良好的Scope大麥麥芽與存在過(guò)濾問(wèn)題的單二麥芽的水溶性蛋白質(zhì)組差異，發(fā)現(xiàn)參與阿拉伯木聚糖降解的阿拉伯木聚糖呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶存在較大差異，對(duì)水溶性阿拉伯木聚糖成分分析發(fā)現(xiàn)，單二麥芽中具有較高含量的阿魏酸，推測(cè)阿魏酸酯酶缺失是單二麥芽過(guò)濾性能缺陷的原因之一，通過(guò)添加純化的阿魏酸酯酶，可有效提高麥汁的過(guò)濾速度，降低麥汁濁度和黏度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸酯酶可有效去除阿拉伯木聚糖側(cè)鏈上的阿魏酸，從而使得其氧化交聯(lián)減弱，多聚阿拉伯木聚糖含量降低。

麥芽；麥汁；過(guò)濾性能；水溶性阿拉伯木聚糖；阿魏酸酯酶

江蘇是我國(guó)啤酒大麥的重要產(chǎn)區(qū)之一，但是由于品種及生產(chǎn)技術(shù)等原因，與進(jìn)口啤酒大麥相比，部分江蘇啤酒大麥制成的麥芽，品質(zhì)不穩(wěn)定，且存在過(guò)濾困難的質(zhì)量缺陷，嚴(yán)重影響了其在啤酒釀造中的大規(guī)模應(yīng)用。過(guò)濾性能是麥芽品質(zhì)的重要指標(biāo)，對(duì)啤酒生產(chǎn)效率、酵母發(fā)酵性能、成品啤酒非生物穩(wěn)定性等都有重要影響[1]。在糖化過(guò)程中，由于大分子物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、半纖維素等相關(guān)水解酶類(lèi)的缺乏，或其抑制因子的存在，使其不完全降解并相互作用、結(jié)合，充斥在麥糟中阻礙過(guò)濾，造成麥汁過(guò)濾速度慢、過(guò)濾性能差[2]。

以前的研究認(rèn)為β-葡聚糖是影響麥芽過(guò)濾性能的主要因素[3-4]，而李胤通過(guò)系列研究發(fā)現(xiàn)，阿拉伯木聚糖(arabinoxylan, AX)也是影響大麥麥芽過(guò)濾性能的重要的非淀粉多糖，并提出了多聚阿拉伯木聚糖(poly-arabinoxylan, PAX)的概念[5]。周婷等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，水溶性阿拉伯木聚糖(water extractable arabinoxylan, WEAX)側(cè)鏈上的阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)性質(zhì)比較活躍，由其介導(dǎo)的氧化交聯(lián)與大麥麥芽過(guò)濾性能緊密相關(guān)，是AX導(dǎo)致麥芽過(guò)濾性能差的重要原因之一[6]。

本項(xiàng)目以過(guò)濾性能差異的進(jìn)口啤酒大麥麥芽Scope和江蘇啤酒大麥麥芽單二為研究對(duì)象，采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)和多糖成分分析等技術(shù)，初步確定導(dǎo)致過(guò)濾性能差異的降解酶系，通過(guò)添加實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并研究其初步作用機(jī)制，以期為單二大麥乃至其他品種的改良指明方向，為提高江蘇啤酒麥芽質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用進(jìn)口啤酒大麥麥芽Scope由青島啤酒股份有限公司饋贈(zèng)，江蘇啤酒大麥麥芽單二由江蘇農(nóng)墾麥芽有限公司饋贈(zèng)。RC-DC蛋白定量試劑盒購(gòu)自Bio-rad公司；Whatman 4號(hào)濾紙購(gòu)自Whatman PLC公司；辣根過(guò)氧化物酶POD購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；愈創(chuàng)木酚購(gòu)自Sigma公司；牛血清白蛋白、牛血紅蛋白、酪氨酸、三氯乙酸等分析純?cè)噭?，均?gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；純化的阿魏酸酯酶，由本實(shí)驗(yàn)室前期研究制備[7]。

1.2儀器與設(shè)備

雙向凝膠電泳系統(tǒng)，GE公司； UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；麥芽標(biāo)準(zhǔn)粉碎機(jī)，北京德之杰啤酒技術(shù)有限責(zé)任公司；自動(dòng)糖化器，西安輕機(jī)所光電公司；WGZ-2-PJ濁度計(jì)，上海昕瑞儀器儀表有限公司；Haake落球式黏度計(jì)，Thermo公司。

1.3麥芽比較蛋白質(zhì)組分析

參照金昭的方法[1]。分別提取Scope及單二麥芽的水溶性蛋白，并通過(guò)雙向電泳分離，PDQuest圖像分析，最后利用質(zhì)譜鑒定差異蛋白點(diǎn)。

1.4WEAX提取及主要成分分析

參照周婷的方法。分別提取Scope和單二麥芽中的WEAX[6]，采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[8]，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[9]，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)(HPAEC-PAD)分析單糖組成[10]，采用HPLC方法測(cè)定其FA[11]。

1.5協(xié)定糖化及指標(biāo)測(cè)定

協(xié)定糖化工藝和過(guò)濾性能的測(cè)定主要參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《啤酒麥芽》[12]。在單二麥芽糖化起始階段添加不同濃度的BPZ7(0、200、400 U/g麥芽)、POD(0、200、400、600 mg/g麥芽)及二者混合物，糖化結(jié)束后，測(cè)定麥芽過(guò)濾性能及相關(guān)指標(biāo)。

協(xié)定糖化麥汁測(cè)定的指標(biāo)主要包括：過(guò)濾速度、濁度和黏度，參考輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《啤酒麥芽》[12]，過(guò)濾速度以起始100 mL回流之后30 min內(nèi)過(guò)濾出的麥汁體積計(jì)算；濁度采用EBC濁度儀測(cè)定；黏度采用Haake落球式黏度儀測(cè)定。

1.6阿魏酸酯酶的酶活測(cè)定

參照李兵的方法。以阿魏酸甲酯為底物，配置標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)體系，50 ℃反應(yīng)10 min后加入冰乙酸終止，并利用高效液相色譜法測(cè)定重組阿魏酸酯酶所產(chǎn)生的FA的含量，該反應(yīng)條件下，每分鐘降解阿魏酸甲酯生成1 μmol FA所需的阿魏酸酯酶的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的水解酶差異

對(duì)過(guò)濾速度差異明顯的Scope和單二麥芽分別提取水溶蛋白，并進(jìn)行雙向電泳，得到雙向電泳圖譜。經(jīng)PDQuest 8.0 軟件分析，對(duì)僅存在于Scope麥芽圖譜中的蛋白點(diǎn)，以及其含量高于單二麥芽圖譜中的蛋白點(diǎn)進(jìn)行了膠內(nèi)酶解、質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，發(fā)現(xiàn)有14個(gè)差異的水解酶類(lèi)(表1)。其中，阿拉伯呋喃糖苷酶(點(diǎn)1, 2, 3)和阿魏酸酯酶(點(diǎn)17)這兩種阿拉伯木聚糖降解酶是兩種過(guò)濾性能差異明顯麥芽的主要差異蛋白。高飛在比較過(guò)濾性能差異的Metcalfe和單二麥芽時(shí)也發(fā)現(xiàn)，阿拉伯呋喃糖苷酶是其中定量差異較顯著的水解酶[13]。這些研究表明，單二麥芽過(guò)濾速度較慢可能和阿拉伯木聚糖的降解有關(guān)。

表1 Scope麥芽中含量高于單二麥芽中的水解酶類(lèi)

2.2麥芽中WEAX的主要成分分析

將過(guò)濾性能差異明顯的進(jìn)口優(yōu)質(zhì)啤酒大麥麥芽Scope和單二分別提取 WEAX，對(duì)提取的WEAX進(jìn)行化學(xué)成分分析，結(jié)果如表2所示。

表2 大麥麥芽中WEAX的主要成分分析

從表2可知，Scope和單二麥芽提取的WEAX中，總糖含量達(dá)到91%以上，其中阿拉伯糖和木糖的比例達(dá)到了88.0%，僅含有少量的葡萄糖，可能來(lái)源于未分離的水溶性β-葡聚糖和糊精。A/X(阿拉伯糖和木糖的比值)是評(píng)價(jià)AX結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的一個(gè)重要指標(biāo)[14]，也是影響WEAX功能的重要因素。由表2可以看出Scope和單二的A/X分別為0.62和0.69，說(shuō)明單二麥芽的WEAX具有更多的側(cè)鏈分支。FA是WEAX分子間交聯(lián)的橋梁，對(duì)交聯(lián)反應(yīng)起到重要的作用[11]，單二麥芽的WEAX的FA含量也明顯高于Scope麥芽的WEAX。結(jié)合單二麥芽和Scope麥芽水解酶差異最顯著的是阿魏酸酯酶，推測(cè)單二麥芽阿魏酸酯酶缺陷導(dǎo)致過(guò)濾速度較慢。

2.3麥芽中WEAX對(duì)過(guò)濾性能的影響

將提取的大麥麥芽WEAX分為兩部分進(jìn)行協(xié)定糖化麥汁添加實(shí)驗(yàn)，一部分通過(guò)添加H2O2/POD體系處理使WEAX氧化交聯(lián)，另一部分通過(guò)阿魏酸酯酶處理后超濾透析去除游離阿魏酸(WEAX-FA)，將兩種水溶性阿拉伯木聚糖在麥芽糖化結(jié)束后分別添加到麥汁中，分別添加3組(每組添加量為50 mg、100 mg和150 mg)，在麥汁過(guò)濾結(jié)束后測(cè)定麥汁的過(guò)濾速度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 添加WEAX對(duì)過(guò)濾速度的影響Fig.1 Effect of added WEAX on filtration rate of wort

由圖1可知，隨著WEAX添加量的增大，麥汁的過(guò)濾速度逐漸減慢，當(dāng)添加量為150 mg時(shí)麥汁的過(guò)濾速度降低了30.7%，而添加去除阿魏酸的WEAX，隨著添加量的增大，麥汁過(guò)濾速度也呈減慢趨勢(shì)，但過(guò)濾速度減慢趨勢(shì)明顯低于WEAX組，在WEAX-FA添加量為150 mg時(shí)麥汁過(guò)濾速度僅降低約5.7%。前期的研究發(fā)現(xiàn)，AX可以通過(guò)氧化交聯(lián)，影響過(guò)濾速度，通過(guò)對(duì)WEAX進(jìn)行阿魏酸酯酶預(yù)處理，可以有效降低其氧化交聯(lián)產(chǎn)物對(duì)過(guò)濾速度的影響，表明阿魏酸酯酶可以有效降解WEAX側(cè)鏈上的FA，從而抑制WEAX的氧化交聯(lián)。

2.4糖化初始階段阿魏酸酯酶的添加對(duì)大麥麥芽過(guò)濾性能的影響

為驗(yàn)證阿魏酸酯酶對(duì)麥芽過(guò)濾性能、濁度、黏度的影響，將純化的阿魏酸酯酶按一定量(每50 g麥芽添加阿魏酸酯酶0 U、0.104 U、0.416 U和1.040 U)加入到麥芽糖化的初始階段，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)FAE添加量為1.040 U時(shí)，麥汁的過(guò)濾速度提高了14.5%，黏度降低了6.9%，而麥汁濁度增加了28%。周婷研究認(rèn)為阿拉伯木聚糖側(cè)鏈上的阿魏酸氧化交聯(lián)使得麥芽過(guò)濾速度降低[6]，圖2的結(jié)果表明在糖化過(guò)程中添加FAE可能抑制水溶性阿拉伯木聚糖的氧化交聯(lián)，改善麥芽的過(guò)濾性能。

圖2 FAE對(duì)麥汁中麥芽過(guò)濾性能的影響Fig.2 Effect of FAE on the filterability of malt

2.5阿魏酸酯酶對(duì)過(guò)濾速度影響的機(jī)制研究

為驗(yàn)證阿魏酸酯酶是否通過(guò)水解阿拉伯木聚糖側(cè)鏈上的阿魏酸，阻礙阿拉伯木聚糖的氧化交聯(lián)，從而提高過(guò)濾速度，比較了不同阿魏酸酯酶添加量對(duì)麥汁中阿魏酸含量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 FAE添加量對(duì)麥汁中阿魏酸的影響Fig.3 Effect of FAE addition on the content of FA in wort

從圖3可知，隨著阿魏酸酯酶添加量的增加，麥汁中阿魏酸含量逐漸增高，當(dāng)添加量增加到1.04 U時(shí)，麥汁中阿魏酸含量基本不再變化，說(shuō)明阿魏酸酯酶可有效水解大麥麥芽中阿拉伯木聚糖側(cè)鏈上的結(jié)合態(tài)阿魏酸，使麥汁中的游離阿魏酸含量比對(duì)照提高了近8倍。

阿魏酸酯酶的添加對(duì)阿拉伯木聚糖降解的影響結(jié)果如表3所示。在協(xié)定糖化初期，隨著阿魏酸酯酶添加量的增大，麥汁中游離FA的含量逐漸增大，協(xié)定麥汁中AX含量逐漸增高而PAX含量逐漸減小，說(shuō)明阿魏酸酯酶可有效去除AX側(cè)鏈上的阿魏酸，從而使得AX的氧化交聯(lián)減弱，AX在阿拉伯木聚糖內(nèi)切酶的作用下，形成中小分子的AX，從而使得PAX含量降低。周婷的研究發(fā)現(xiàn)，麥汁過(guò)濾性能和PAX之間呈高度正相關(guān)，PAX含量降低，過(guò)濾速度提高[6]。

3 結(jié)論

本研究以Scope和單二麥芽為研究對(duì)象，利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)在Scope麥芽中與含量更高的阿拉伯木聚糖相關(guān)的水解酶類(lèi)，如阿拉伯呋喃糖苷水解酶和阿魏酸酯酶，而單二麥芽水溶性木聚糖中含有較高含量的阿魏酸，說(shuō)明缺少阿魏酸酯酶可能是單二麥芽過(guò)濾性能缺陷的主要原因之一，在單二麥芽糖化階段添加純化的重組阿魏酸酯酶，可有效減少去除阿拉伯木聚糖側(cè)鏈上的阿魏酸，減少其氧化交聯(lián)，從而降低多聚阿拉伯木聚糖的含量，使得麥汁過(guò)濾速度大幅提高，麥汁濁度和黏度相應(yīng)降低。

表3 FAE添加對(duì)麥汁中阿拉伯木聚糖降解的影響

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Theinfluenceofferuloylesteraseonfilterabilityofwort

LI Xiao-min1,2, CAI Guo-lin2, LI Bing2, YIN Hua2, LU Jian2*

1(State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer, Qingdao 266100, China) 2(National Engineering Laboratory of Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Filterability is one of the most important quality traits of malt. It is of great practical significance to resolve the problem of filterability defects of Chinese malt. The present study compared that proteomes of Scope and Dan’er malts that with distinct filterability. It was found that arabinoxylan arabinofuranohydrolase and feruloyl esterase involved in the degradation of arabinoxylan were the most different enzymes. In addition, the components analysis of WEAX from Scope and Dan’er malt revealed that WEAX from Dan’er malt contained more ferulic acid. Therefore, we proposed that lack or short of feruloyl esterase in Dan’er malt contributed majorly to its filterability defect. By adding purified recombinant feruloyl esterase in the mashing process using Dan’er malt, the filtration rate of wort was significantly raised, accompanied by the decreased turbidity and viscosity of wort. The feruloyl esterase could remove the ferulic acid in the chain of arabinoxylan effectively and therefore inhibit the formation of ferulic acid dipolymer, which led to decreased content of poly-arabinoxylan.

malt; wort; filterability; WEAX; feruloyl esterase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014971

副教授(陸健教授為通訊作者)。

國(guó)家863計(jì)劃(2013AA102109)；啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助課題(K2014001)；青島創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新領(lǐng)軍人才計(jì)劃項(xiàng)目(13-cx-15)

2017-06-24，改回日期：2017-07-37