彭立 張興梅

（南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，廣州 5 1 0 5 1 5）

核酸適配子結(jié)合無機納米材料在腫瘤研究中的應(yīng)用

彭立 張興梅

（南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，廣州 5 1 0 5 1 5）

在倡導(dǎo)精準(zhǔn)醫(yī)療的今日，在基本掌握與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的靶點的機理后，如何實現(xiàn)腫瘤靶向治療，盡量消減由治療帶來的不良反應(yīng)顯得尤為關(guān)鍵。核酸適配子是能與靶標(biāo)以高親和力、高特異性結(jié)合的寡核苷酸；無機納米材料是納米材料作為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域診療制劑中重要的組成部分；利用核酸適配子與靶標(biāo)結(jié)合的特性將其與無機納米材料結(jié)合后，可將靶向結(jié)合、生物成像及藥物遞送等特點集于一體，綜合應(yīng)用于腫瘤研究，同時有力于促進核酸納米技術(shù)的發(fā)展。綜述了近年不同無機納米材料結(jié)合核酸適配子在腫瘤研究領(lǐng)域中的研究進展，以及對無機納米材料在醫(yī)學(xué)應(yīng)用的安全性思考，以期早日實現(xiàn)新型靶向腫瘤治療策略的開發(fā)。

核酸適配子；納米材料；腫瘤

眾所周知，腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的第一殺手，重要原因是腫瘤早期診斷的不足和腫瘤治療藥物不能準(zhǔn)確到達治療部位。隨著腫瘤的治療手段由細胞攻擊模式向靶向性治療模式轉(zhuǎn)變，靶向藥物目前在乳腺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等癌癥治療中得到臨床應(yīng)用。大部分靶向分子藥物的發(fā)現(xiàn)得益于人們對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的深入研究，這也推動了高靶向性的遞藥系統(tǒng)的出現(xiàn)，基于納米材料的遞藥系統(tǒng)也越來越多地應(yīng)用于腫瘤治療中［1-4］。

納米材料，即指微粒尺寸為納米級（10-9m）的超細材料，通常介于1-100 nm之間。因其具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)，公認為是21 世紀(jì)最有前途的研究領(lǐng)域［5-6］。由納米材料制成的遞藥系統(tǒng)有著突出的優(yōu)點，它不僅可以使藥物納米化，還可以隨環(huán)境的變化或刺激產(chǎn)生響應(yīng)而發(fā)生性能或結(jié)構(gòu)的變化，繼而順利通過體內(nèi)的屏障最終實現(xiàn)靶向給藥，提高療效，減少因生物分布太廣所帶來的不良反應(yīng)。人們對納米材料相關(guān)的遞藥系統(tǒng)研究廣泛，主要是因其能特異地和腫瘤細胞的配體結(jié)合，并在配體的引導(dǎo)下靶向殺死腫瘤細胞從而達到治療的目的，現(xiàn)階段研究較多的配體有核酸適配子、葉酸和脂質(zhì)體等。

核酸適配子（Aptamer），是用指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選而來的寡核苷酸，能特異性結(jié)合靶標(biāo)的雙鏈DNA或單鏈RNA分子。核酸適配子的靶標(biāo)非常廣泛，可以是小分子、蛋白質(zhì)、細胞乃至組織等，相較于抗體，核酸適配子有許多優(yōu)點，如分子量小，免疫反應(yīng)小，因其可折疊成獨特的二級或三級結(jié)構(gòu)從而對靶標(biāo)有非常高的親和性和特異性，易于化學(xué)合成且重復(fù)性好，性質(zhì)穩(wěn)定，易于修飾使其可以和多種功能分子結(jié)合發(fā)揮最優(yōu)生物學(xué)效應(yīng)。本文主要結(jié)合無機納米材料，闡述核酸適配子結(jié)合無機納米材料在腫瘤研究中的應(yīng)用。

1 核酸適配子結(jié)合貴金屬納米材料

無機納米材料，根據(jù)來源不同主要分為金屬類材料和非金屬類材料。金屬類材料主要包括貴金屬納米材料、磁性鐵、層狀雙金屬納米材料等；非金屬類材料主要包含碳納米材料和介孔二氧化硅等。金屬納米材料是對納米材料基本物理化學(xué)性質(zhì)研究的理想模型，其獨特的光、熱、電、磁及催化性能等方面優(yōu)越的性質(zhì)使其在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中扮演著越來越重要的角色。

貴金屬納米材料作為納米材料中的重要組成部分，主要包括金、銀、鉑、釕等8種元素。由于其將貴金屬獨特的性能與納米材料獨有的特點有機結(jié)臺起來，使其在化學(xué)催化、生物傳感和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，得到了越來越廣泛的重視。

金納米微粒作為貴金屬納米材料研究最為廣泛，主要有球形金納米粒、空球狀、棒狀、管狀、線狀、及核-殼結(jié)構(gòu)復(fù)合納米等多種存在形式［7］，銀納米材料主要有顆粒狀、絲狀及復(fù)合材料，如金銀復(fù)合納米粒子。較大的金納米粒由于其散射橫截面較大，由納米粒子表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）引起的光散射增強，在暗場下可檢測到散射光，由此可用于生物成像；而小的金納米粒則多用于制備遞藥系統(tǒng)，結(jié)合配體將藥物遞送至癌細胞，并在癌細胞內(nèi)自組裝成大的粒子簇，導(dǎo)致 SPR 吸收帶由可見光區(qū)紅移到700-1 000 nm的近紅外區(qū)。由于正常人體細胞僅對可見光區(qū)（350-700 nm）和紅外光區(qū)（＞1 000 nm）有良好吸收，可利用金納米粒子的該特性在650-900 nm的近紅外區(qū)給予激光照射，從而對腫瘤組織進行光熱療法。

Kim等［8］將靶向前列腺特異性抗原的RNA適配子結(jié)合在金納米球上，成功實現(xiàn)靶向 LNCaP前列腺內(nèi)皮細胞且CT成像強度高于對照組4倍；接著他們利用與RNA適配子互補序列中連續(xù)的GC堿基對將阿霉素裝載于雙鏈內(nèi)，發(fā)現(xiàn)阿霉素-適配子-金納米球組成的遞藥系統(tǒng)特異性好且能殺傷靶細胞；Chen等［9］則是將cRGD、DNA適配子AS1411和金納米球組裝成主要的復(fù)合納米材料，攜帶近紅外區(qū)的熒光染料MPA后可直接顯示腫瘤原發(fā)的位置，利于成像。當(dāng)他們將MPA換為阿霉素后發(fā)現(xiàn)可有效導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生凋亡。近幾年對于金納米和適配子結(jié)合的研究領(lǐng)域，不僅有生物成像、遞藥系統(tǒng)，還有對于腫瘤標(biāo)志物超敏檢出的方法學(xué)上的創(chuàng)新。Miao等［10］將金納米與DNA通過二硫鍵結(jié)合后，利用適配子Sgc8與酪氨酸激酶-7（Tyrosine kinase -7，PTK-7）結(jié)合前后DNA結(jié)構(gòu)的變化從而可超敏檢出細胞碎片中的 PTK-7，對腫瘤初篩有重要意義。

基于前期研究表明，金納米棒在腫瘤光熱治療和生物成像較金納米球更有優(yōu)勢［11］，但是由于金納米棒在制備過程中需要使用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB），而據(jù)報道，CTAB對多種細胞均存在毒性［12-14］，可與細胞膜發(fā)生靜電作用、甚至可導(dǎo)致細胞死亡［15］。為解決這個問題，Yasun等［16］在金納米棒表面用牛血清白蛋白包裹，在結(jié)合適配子Sgc8靶向作用于CCRF-CEM細胞進行光熱治療同時將細胞膜上的非特異性位點封閉，可明顯減少由CTAB帶來的毒性作用。

在對于銀納米材料的研究中，人們多是選取金-銀復(fù)合納米材料結(jié)合特定的適配子用于腫瘤治療，如對急性淋巴白血病選擇性地光熱治療不造成周圍組織細胞損傷［17］；通過組裝適配子作為靶向探針將金-銀-金納米材料指引至所需治療的部位，在指引成像的基礎(chǔ)上對腫瘤進行治療［18］。生物成像、光熱治療是納米材料結(jié)合適配子常用的研究領(lǐng)域，Qiu等［19］的研究則拓寬了該領(lǐng)域，P-糖蛋白過表達的腫瘤細胞是多重耐藥的機制之一，他們通過設(shè)計靶向腫瘤細胞膜的適配子，同時繞過P-糖蛋白進入細胞內(nèi)后在激光的照射下可以將裝載在金-銀納米棒內(nèi)的阿霉素釋放，繼而進入細胞核內(nèi)發(fā)揮作用，將光熱治療、靶向遞藥治療有機結(jié)合從而顯著提高了對腫瘤細胞的殺傷力并能有效避免多重耐藥的產(chǎn)生。

2 核酸適配子結(jié)合磁性納米材料

磁性納米材料由于其在納米尺度上的特殊的磁學(xué)性質(zhì)，即磁性納米粒子的粒徑小于其超順磁性的臨界值時可顯現(xiàn)出超順磁性，以及磁性納米材料有良好的磁導(dǎo)向性、生物相容性、生物可降解性及可用表面官能團加以修飾等特點［20］，使得磁性納米材料的研究領(lǐng)域逐步向生物醫(yī)學(xué)方向靠近，如磁共振成像系統(tǒng)、磁熱療及生物檢測等方向。日前，提高對腫瘤細胞的檢測限是早期發(fā)現(xiàn)、診斷腫瘤的重要手段。利用磁性納米微粒的磁導(dǎo)向性能，Khoshfetrat等［21］將Fe3O4磁性納米材料覆蓋在金納米顆粒上，通過雙硫鍵共價結(jié)合靶向白血病細胞的適配子Sgc8c，在外加磁場下篩選出與靶細胞結(jié)合的檢測復(fù)合體，借助在適配子的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中嵌入溴化乙錠對靶細胞進行實時定量，經(jīng)實驗證實可將檢測限度提高到 10-106個細胞/mL。Bamrungsap等［22］基于磁性納米材料超順磁性發(fā)展的磁性弛豫開關(guān)技術(shù)，在靶向腫瘤細胞后不僅能靈敏檢出靶細胞還可準(zhǔn)確區(qū)分腫瘤細胞和正常細胞；Sun等［23］將金納米顆粒包裹在Fe3O4磁珠上，利用反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫在辣根過氧化物酶催化反應(yīng)下放大信號從而提高了對肝癌細胞的檢出率。腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)有賴于腫瘤標(biāo)志物的檢測和影像學(xué)的初篩，核磁共振成像是其中一種方法。磁性納米材料結(jié)合適配子可作為成像的造影劑用于核磁共振成像，輔助診斷胰腺癌［24］和肝癌［25］；Li等［26］設(shè)計的磁性納米分子探針發(fā)現(xiàn)，通過適配子AS1411可以靶向多種癌細胞如乳腺癌細胞、腎臟上皮癌細胞、結(jié)腸癌細胞等并利用這些癌細胞內(nèi)的過表達的谷胱甘肽激活核磁共振的成像。

3 核酸適配子結(jié)合非金屬類無機納米材料

3.1 核酸適配子結(jié)合碳納米材料

碳納米材料是無機納米材料重要的組成部分，有富勒烯、碳納米管、石墨烯及三維的石墨和金剛鉆等各個維度的材料。富勒烯是一種由碳原子形成的一系列籠形分子的總稱C60。碳納米管是一種由碳原子sp2雜化形成的石墨烯片層形成的無縫、中空的管體［27］，根據(jù)管壁層數(shù)的不同，可大致分為單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotube，SWNT）、雙壁碳納米管及多壁碳納米管。石墨烯則是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成的六角形呈蜂巢晶格的平面薄膜，僅有一個碳原子厚度［28］。碳納米管因具有獨特的機械性、良好的電導(dǎo)率和熱導(dǎo)率及其表面可修飾性強等優(yōu)點使其成為非金屬無機納米材料中熱門的研究對象［29］?；谔技{米管良好的拉力和彈力性能，Taghavi等［30］將適配子MUC1-5TR結(jié)合到經(jīng)聚乙二醇和聚乙烯亞胺修飾的SWNT上并裝載BclxL shRNA，成功且高效地將ShRNA轉(zhuǎn)染進靶細胞即MCF7乳腺癌細胞并引發(fā)其凋亡；同樣是針對乳腺癌細胞，Mohammadi等［31］則是將 RNA 適配子結(jié)合到 SWNT上靶向EpCAM（Epithelial cell adhesion molecule）成功下調(diào) BCL9l（B-cell CLL/lymphoma 9 like）蛋白水平引發(fā)癌細胞的凋亡。適配子結(jié)合碳納米材料不僅用于遞藥系統(tǒng)的研究，在腫瘤標(biāo)志物的檢測中也越來越受到重視。Amouzadeh Tabrizi等［32］將針對血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor 165，VEGF165） 的 DNA適 配 子 結(jié)合在介孔碳-金納米復(fù)合材料上，通過適配子和VEGF165反應(yīng)對界面產(chǎn)生的影響即可高效檢測出VEGF165的含量從而鑒別診斷出肺癌；對碳納米材料的研究不僅在于檢測腫瘤標(biāo)志物，還可以利用雙鏈帶熒光基團的DNA適配子錨定在還原型石墨烯納米片上，從而超敏檢出γ-干擾素［33］。

3.2 核酸適配子結(jié)合介孔二氧化硅

介孔二氧化硅（Mesoporous silica nanoparticles，MSN）納米顆粒，是一類在2-50 nm范圍內(nèi)可連續(xù)調(diào)節(jié)介孔孔徑的納米材料，有著孔道規(guī)則、骨架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、內(nèi)外表面易于修飾及生理毒性低等特點，MSN具有巨大的比表面積（＞900 m2/g）和比孔容（＞0.9 cm3/g），可以在孔道內(nèi)負載藥物，并對藥物起到緩釋的作用，提高藥效的持久性［34］。Xie等［35］利用已報道的可特異性結(jié)合EpCAM的DNA適配子共價結(jié)合羧基化修飾的介孔二氧化硅納米材料，并在其介孔內(nèi)裝載阿霉素，靶向EpCAM陽性的SW620結(jié)直腸癌細胞，通過SW620細胞和Romas淋巴瘤細胞的研究證實，在pH5.5時阿霉素的釋放率明顯高于pH7.4的釋放率；由DNA適配子-阿霉素-介孔二氧化硅形成的新型遞藥系統(tǒng)可降低EpCAM的表達、抑制腫瘤細胞的增殖同時可促進腫瘤細胞的晚期凋亡和壞死。同樣是用介孔二氧化硅裝載阿霉素，Tang等［36］將帶負電荷的氧化石墨烯納米薄片包裹在介孔二氧化硅表面，并通過非共價鍵結(jié)合帶有Cy5.5熒光基團標(biāo)記的AS1411的DNA適配子靶向核仁蛋白陽性的MCF-7乳腺癌細胞，在激光的作用下實現(xiàn)阿霉素釋放的“開關(guān)”控制。在其研究中表明，經(jīng)AS1411直接特異性靶向MCF-7細胞后，憑借Cy5.5產(chǎn)生的熒光作為實時觀測指標(biāo)，繼而在激光照射下，可實現(xiàn)阿霉素的靶向“開關(guān)”釋放，且該光響應(yīng)型藥物遞藥系統(tǒng)對腫瘤細胞的治療效果比單一的阿霉素化療或光熱治療均要顯著。

4 無機納米材料及核酸適配子在腫瘤診斷與治療中的安全性

無機納米材料基于獨特的物理化學(xué)性能使其在遞藥系統(tǒng)和生物成像等研究領(lǐng)域有良好的前景，但相較于同種元素的大分子材料，納米級的尺寸大小的材料可能對人體有較高的毒性。此外，無機納米材料的制備過程所使用的材料是否足夠綠色化學(xué)、修飾及裝載藥物過程是否能做到盡量少用低毒無毒的試劑需要考量；一定濃度的核酸適配子進入到細胞組織內(nèi)是否會出現(xiàn)非特異性核酸免疫反應(yīng)同樣需要思考。表1中列舉了常用的無機納米材料對人體健康可能存在的副作用。金屬類納米材料主要的毒性作用在于產(chǎn)生活性氧、急性細胞毒作用及DNA損傷，如金納米［38］、銀納米顆粒［39］，這些共同促進細胞啟動程序性凋亡。據(jù)報道，未經(jīng)表面修飾的二氧化鈦納米顆粒對A594肺腺癌細胞有明顯的基因和細胞毒性，經(jīng)檸檬酸鹽或二氧化硅修飾也不能降低其毒性［40］。但有報道稱長期低劑量使用鈷納米顆粒有致癌風(fēng)險［41］。也據(jù)報道，金納米結(jié)合適配子AS1411作用于多個腫瘤細胞系，在老鼠體內(nèi)最大耐受劑量下仍未造成急性毒性，也未引起病理學(xué)改變［42］。這可能與金納米結(jié)合適配子提高了遞藥系統(tǒng)的靶向性后避免了非特異性結(jié)合從而降低了其毒性作用。非金屬類納米材料也存在一定的毒性，單分散的二氧化硅納米材料會引起細胞周期阻滯帶來基因毒性［43］此外，高劑量的抗腫瘤藥物的注入到患有腹腔腫瘤的病人中導(dǎo)致局部毒性和藥物分子的快速吸收進入血液循環(huán)從而導(dǎo)致系統(tǒng)性毒性［44］。但金屬納米材料的基因毒性為腫瘤細胞的放療增敏作用提供了新思路，據(jù) Lenka ?tefan?íková 等［45］報道，粒徑僅有3 nm的釓納米顆?？商岣吣X膠質(zhì)瘤的放射治療效應(yīng)。目前，不同實驗室在研究納米材料的毒性時因?qū)嶒炘O(shè)計條件、選取的研究對象、納米材料的暴露條件等不同而缺乏可比性；另一方面，現(xiàn)有的對納米材料的毒性研究主要是體外研究，基于人體是復(fù)雜的生物系統(tǒng)，核酸適配子-無機納米材料進入人體后生物分布、對機體新陳代謝的影響、機體對納米復(fù)合材料的排泄，甚至在進行光熱治療過程中是否會對DNA造成損傷等方面都需要研究。建立通用、標(biāo)準(zhǔn)的實驗評價體系是研究納米毒理學(xué)的基礎(chǔ)；增加對納米材料的多水平、多對象的在體毒理研究可以消減公眾對納米材料不安全的擔(dān)憂，促進納米醫(yī)學(xué)的成果轉(zhuǎn)化，更好地為臨床服務(wù)。

表1 常用無機納米材料對人體健康存在的潛在副作用［37］

5 結(jié)語

綜上所述，核酸適配子結(jié)合無機納米材料在腫瘤的研究中具有一定的共性，即適配子負責(zé)特異性結(jié)合腫瘤靶細胞，無機納米材料主要是發(fā)揮載體的作用或是進行生物成像、光熱治療，裝載的藥物如阿霉素則是為了更好地抑制腫瘤細胞的增殖，從而達到靶向綜合診治的效果。日前，已有科學(xué)家開展針對適配子的靶向作用基礎(chǔ)上進一步發(fā)揮其對靶標(biāo)的作用的研究，從而實現(xiàn)靶向治療，相信結(jié)合無機納米材料可以更好地為腫瘤靶向治療提供新思路。在納米醫(yī)學(xué)發(fā)展日新月異的同時能盡量減少由納米材料帶來的生物安全隱患是我們的期待。總體而言，越來越多針對不同水平靶標(biāo)（如小分子、蛋白和細胞等）的核酸適配子結(jié)合日益先進的納米技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)，特別是腫瘤研究領(lǐng)域，是將研究的效益最大化。與此同時，也需要更多的科學(xué)家對納米醫(yī)學(xué)做出更為深入的研究。

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Application of Aptamers Conjugated Inorganic Nanomaterial in Tumor Research

PENG Li ZHANG Xing-mei
（Department of Neurobiology，School of Basic Medical Science，Southern Medical University，Guangzhou 510515）

At nowadays in the promotion of precise medical treatment，how to achieve tumor targeted therapy and reduce the side-effects of radiotherapy is particularly critical after we understood the mechanism of the key molecular targets closely related to tumorigenesis. Aptamers are single-stranded DNA or RNA oligonucleotides which can bind with various targets at high affinity and specificity. Inorganic nanomaterial is an important part of nanomaterial as a medical diagnosis and treatment preparation. Taking the advantage of the properties of aptamers binding with their targets at high affinity，the system of their binding with inorganic nanomaterial can be applied in the tumor research in an integrated approach of targeted binding，biological imaging and drug delivery，concurrently which efficiently promotes the development of nucleic acid nanotechnology. In this review，we discuss the application of varied inorganic nanomaterial binding with the aptamers in tumor research and the safety of inorganic nanomaterial in medical applications，aiming at earlier achieving the development of new targeted therapy strategies to tumor.

aptamers；nanomaterial；tumor

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0301

2017-04-13

國家自然科學(xué)基金項目（81272509，81471388），廣東省自然科學(xué)基金項目（2014A030313351）

彭立，女，碩士，研究方向：適配子；E-mail：pl164954085@126.com

張興梅，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：適配子篩選及應(yīng)用；E-mail：zxmray@hotmail.com

（責(zé)任編輯 朱琳峰）