段 靖，尹瓊玉，李燕思，王亞威，魯 毅

自擬當(dāng)歸活血丸再度提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的成分檢測(cè)研究

段 靖，尹瓊玉，李燕思，王亞威，魯 毅＊

當(dāng)歸活血丸；薄層色譜法；高效液相色譜法；阿魏酸

當(dāng)歸活血丸為筆者所在醫(yī)院自制制劑，由葛根、當(dāng)歸、川芎、熟地黃等19味中藥材組成，其功能主治為益腎活血，解毒康精；用于抗精子抗體陽(yáng)性的治療。在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，筆者僅對(duì)葛根、熟地黃兩味藥材進(jìn)行TLC鑒別。當(dāng)歸和川芎均為方中主要藥味，兩者都含有阿魏酸。阿魏酸具有抗血小板凝集和血栓、抗菌消炎、增加免疫功能及增強(qiáng)人體精子活力和自由度等作用。因此此實(shí)驗(yàn)選擇阿魏酸作為本品含量測(cè)定的指標(biāo)成分，采用HPLC法建立含量測(cè)定方法，并采用TLC法對(duì)方中葛根、當(dāng)歸、川芎進(jìn)行定性鑒別，為全面有效控制該制劑質(zhì)量提供參考和依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）、FA-2004N電子天平 （上海精科）、CPA225D電子天平（賽多利斯）。

1.2 試藥 葛根對(duì)照藥材（批號(hào)：121175-201208）；當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)：120927-201315）；川芎對(duì)照藥材（批號(hào)：120918-201204）；阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-201313），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；當(dāng)歸活血丸（每袋200 g，解放軍第454醫(yī)院）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 葛根的TLC鑒別［1-4］取本品10 g，研碎，加甲醇 30 ml，靜置 2 h，濾過(guò)，殘?jiān)偌蛹状?20 ml，靜置2 h，濾過(guò)，將兩次濾液合并，濃縮至5 ml，作為供試品溶液。同法制成缺葛根的陰性樣品溶液。另取葛根對(duì)照藥材1 g，加甲醇20 ml，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則 0502）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各 10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（7∶2.5∶0.25）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 葛根的薄層色譜鑒別圖

2.1.2 當(dāng)歸、川芎的 TLC鑒別［5-8］取本品 8 g，研碎，加乙醚 50 ml，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? ml使溶解，作為供試品溶液。同法制成缺當(dāng)歸、川芎的雙陰性樣品溶液。另取當(dāng)歸、川芎對(duì)照藥材各1 g，加乙醚20 ml，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則 0502）試驗(yàn)，吸取上述 3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 川芎、當(dāng)歸的薄層色譜鑒別圖

2.2 阿魏酸的含量測(cè)定［9-11］

2.2.1 色譜條件 色譜柱為：InertSustain C18（4.6×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（15∶85），流速為1.0 ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2.2 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液的制備。取阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1 ml含阿魏酸16.8 μg的溶液，即得。（2）供試品溶液的制備。取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約10.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液 50 ml，密封，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率 40 kHz）60 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。（3）陰性對(duì)照溶液的制備。按當(dāng)歸活血丸處方比例，取不加當(dāng)歸和川芎藥材的陰性制劑，同供試品溶液制法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 按以上色譜條件分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液10 μl進(jìn)樣，陰性對(duì)照色譜中，在阿魏酸相應(yīng)的出峰時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn)。對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 當(dāng)歸活血丸HPLC

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取已配制好的對(duì)照品溶液 16、18、20、22、24 μl，分別注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=46.29X-9.405，r=1.000；結(jié)果表明阿魏酸在0.269～0.403 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)照品溶液峰面積的RSD為0.1%，結(jié)果表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、8、16、24、48 h 進(jìn)樣 10 μl，按上述條件測(cè)定峰面積，以考察其穩(wěn)定性，RSD為0.2%，表明供試品溶液至少在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一供試品，按2.3.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，依次測(cè)定，計(jì)算得阿魏酸含量，RSD為1.7%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的當(dāng)歸活血丸供試品（0.16 mg/g）5.0 g，6 份，分別精密加入16.8 μg/ml的對(duì)照品溶液50 ml，依法檢測(cè)，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.9 供試品含量測(cè)定 按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備10批供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算得 阿 魏 酸 含 量 分 別 為 0.160、0.167、0.173、0.162、0.155、0.164、0.160、0.168、0.162、0.163 mg/g， 最 低0.155 mg/g，以最低測(cè)定值的80%為限，故擬當(dāng)歸活血丸含阿魏酸不得低于0.124 mg/g。

3 討論

當(dāng)歸活血丸處方中藥味較多，成分復(fù)雜，因此給藥味的薄層鑒別帶來(lái)很大困難。通過(guò)參考大量的文獻(xiàn)和多年的摸索試驗(yàn)，以及對(duì)樣品前處理的層層篩選，得出了薄層效果較好的葛根、當(dāng)歸和川芎。由于當(dāng)歸和川芎中均含有蒿苯內(nèi)酯，分開(kāi)點(diǎn)樣陰性有干擾，故將當(dāng)歸和川芎合并鑒別，而對(duì)于當(dāng)歸和川芎使用雙陰性對(duì)照進(jìn)行鑒別的方法在藥典早有收載［12］。

表1 當(dāng)歸活血丸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

供試品提取方法的選擇，以80%甲醇為提取溶劑，提取方法采用超聲提取30、60、90 min。測(cè)定方法相同，超聲提取60、90 min時(shí)，提取較完全，因此選用80%甲醇作為提取溶劑、超聲提取60 min。

流動(dòng)相的選擇［13］，選用乙腈-0.1%磷酸（21.5∶88.5）、流速1 ml/min作為流動(dòng)相，分離效果較差，因此降低乙腈比例，選擇乙腈-0.2%磷酸（15∶85）作為本方法流動(dòng)相。阿魏酸與其他組分可完全分離，達(dá)到較好的效果。

該實(shí)驗(yàn)中，TLC法可鑒別出當(dāng)歸活血丸中的葛根、當(dāng)歸和川芎，方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，可作為當(dāng)歸活血丸的定性鑒別方法；采用HPLC法測(cè)定當(dāng)歸活血丸中阿魏酸的含量，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠，且重現(xiàn)性好，可用于當(dāng)歸活血丸的含量測(cè)定和質(zhì)量控制。

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R286.0

B

10.14172/j.issn1671-4008.2017.09.021

210002江蘇南京，解放軍454醫(yī)院藥學(xué)部（段靖，尹瓊玉，李燕思，王亞威，魯毅）

魯毅，Email：luyican321@163.com

［2017－01－23 收稿，2017－02－21 修回］ ［本文編輯：劉立平］