趙艷軍 馬立新 吳瑞芹 宋成軍 李炳慶

·論著·

側腦室注射瘦素對大鼠迷走復合體阿黑皮素原的影響

趙艷軍 馬立新 吳瑞芹 宋成軍 李炳慶

目的研究側腦室注射瘦素對大鼠迷走復合體阿黑皮素原的影響，探討瘦素是否同下丘腦弓狀核一樣也在迷走復合體對阿黑皮素原進行調(diào)節(jié)，從而發(fā)現(xiàn)瘦素在迷走復合體上發(fā)揮作用的可能路徑。方法SD大鼠36只，隨機分為試驗組和對照組，每組18只，試驗組根據(jù)注射后處死的時間(1、3、5 h)分成3個亞組，每組6只。大鼠側腦室留置不銹鋼導管1周，自由恢復及馴養(yǎng)，實驗動物在清醒狀態(tài)下于側腦室注射瘦素3.5 μg/μl，對照組注射3.5 μg/μl 0.9%氯化鈉溶液。蘇木精-伊紅染色定位迷走復合體，測定阿黑皮素原在該處的表達。結果中樞注射瘦素組大鼠側腦室注射瘦素后1、3、5 h采用免疫組化檢測迷走復合體上阿黑皮素原的表達陽性細胞計數(shù)、表達陽性細胞積分光密度與生理鹽水和對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)，中樞注射瘦素組1、3、5 h亞組組間迷走復合體上阿黑皮素原的表達陽性細胞計數(shù)、表達陽性細胞積分光密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。結論側腦室注射瘦素后不能引起迷走復合體上阿黑皮素原的增多。

瘦素；阿黑皮素原；迷走復合體；中樞注射；大鼠

1994年成功克隆出肥胖基因(瘦素基因)，同時發(fā)現(xiàn)其表達產(chǎn)物瘦素(leptin)。瘦素是蛋白質(zhì)類激素，由脂肪細胞產(chǎn)生,瘦素基因的組成：2個內(nèi)含子和3個外顯子，瘦素基因產(chǎn)物的分子量為16 kD,由167個氨基酸殘基組成，N-端的21個氨基酸殘基，以信號肽于單鏈蛋白分泌入血，隨后被切除而形成瘦素，由此功能性瘦素的分子結構有146個氨基酸的殘基。人類瘦素基因是位于第7號染色體的長臂，人類和小鼠瘦素基因的同源性為高度同源，氨基酸序列84%相同，這一結果為動物實驗的進一步研究提供基因基礎。瘦素由脂肪組織來合成的，它的分泌呈晝夜節(jié)律性，為脈沖式的分泌，尤以夜間分泌的水平最高，隨后迅速下降，約80%由腎臟代謝[1,2]。瘦素的主要作用部位是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，血清中的瘦素是通過血腦屏障，進入腦內(nèi)來發(fā)揮作用。胰島素、去甲腎上腺素、類固醇激素能促進瘦素的分泌，將類固醇激素作用于脂肪組織，能夠顯著地促進瘦素的分泌與合成，花生四烯酸和前列腺素E2同樣能促進瘦素的分泌。瘦素在中樞主要通過下丘腦，其中最重要的部位是位于基底部的弓狀核，弓狀核被認為是整合攝食的重要部位，因為弓狀核的眾多神經(jīng)元能生成增加進食量的信號，如強啡肽、β-內(nèi)啡肽、γ-氨基丁酸、谷氨酸等，同時也生成抑制進食信號，如前阿黑皮素、可卡因、安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄肽的[3]。我們于2016年1月至2017年6月通過側腦室注射瘦素對大鼠迷走復合體阿黑皮素原的影響，探討瘦素是否同下丘腦弓狀核一樣也在迷走復合體對阿黑皮素原進行調(diào)節(jié)，從而發(fā)現(xiàn)瘦素在迷走復合體上發(fā)揮作用的可能路徑。

1 材料與方法

1.1 材料 淮北正華生物儀器設備公司生產(chǎn)大鼠用腦立體定位儀，上海光正醫(yī)療儀器公司生產(chǎn)微計量注射器，大鼠腦室置管裝置，Peprotech公司瘦素，上海斯信生物科技有限公司瘦素受體，上海拜力生物科技有限公司阿黑皮素原，北京中山生物公司免疫組化二抗，蘇木素染液，3，3-二氨基苯聯(lián)胺，乙醇，多聚甲醛、鑷子、手術剪、包埋模具、恒溫箱、冰箱、光學顯微鏡、蓋玻片、載玻片、染色缸、超薄切片機、微量可調(diào)加樣器、Motic計算機圖像分析系統(tǒng)。

1.2 方法 SD大鼠購買于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證編號：1407012，按照“實驗動物質(zhì)量管理辦法”飼養(yǎng)實驗動物，雌雄各半，共36只，每籠飼育大鼠1只，實驗前1周給予大鼠側腦室置管，置管方法：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用腦立體定位儀將大鼠固定，依據(jù)大鼠腦圖，在十字縫旁開1.5 mm，后移0.8 mm，3.5 mm深度，在顱骨上打洞，直徑2 mm，留置不銹鋼導管，插入不銹鋼制導絲封閉導管。置管后大鼠恢復1周，每日對大鼠進行馴養(yǎng)，每次馴養(yǎng)時間不少于10 min。將大鼠隨機分為中樞注射瘦素組和生理鹽水對照組，每組18只。根據(jù)給藥的時間下分為3個亞組，中樞注射瘦素1 h組、中樞注射瘦素3 h組、中樞注射瘦素5 h組，每組6只。大鼠在禁食24 h以后，于無麻醉、清醒狀態(tài)下給藥，給藥前拔掉導絲，將注射針在大鼠稍微限制活動情況下插入留置的不銹鋼導管內(nèi)，緩慢持續(xù)注射，給藥時間4 min，給藥后將針頭留置1 min，給藥劑量3.5 μg/μl，最后注入美藍0.5 μl(20 g/L)，以確定注射位置，注射美藍溶液不在腦室的給予剔除。

1.3 腦室內(nèi)固定、染色定位 完成實驗后麻醉大鼠(過量水合氯醛)，開胸經(jīng)升主動脈插管后給予心臟灌注，0.9%氯化鈉溶液100 ml快速沖洗干凈血液，然后用4%的多聚甲醛溶液40 ml進行灌注，快灌注200 ml，剩余200 ml給予緩慢灌注，甲醛灌注固定后取腦組織，再于甲醛固定液固定24 h。先暴露第四腦室的底部，迷走復合體位于腦干背側，中腦導水管旁，應從中間往下取。將標本再固定12 h，倒掉固定液，隨后3次蒸餾水沖洗，2次50%乙醇給予沖洗后，再依據(jù)乙醇濃度逐級脫水，包括70%乙醇脫水1 d，80%乙醇脫水過夜后，95%乙醇脫水3 h，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ分別脫水2 h，二甲苯透明，石蠟包埋。蘇木精-伊紅染色法進行染色定位迷走復合體：二甲苯中脫蠟，無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各2 min浸泡，用自來水再沖洗5 min，蘇木精液中浸泡染色15 min，最后伊紅染色3 min，脫水透明封片。首先找到中腦導水管，中腦導水管上通間腦的第三腦室，下通第四腦室、背側是四疊體下丘、上丘，腹側是中腦被蓋以及大腦腳，然后進行迷走復合體定位。見圖1。

圖1 定位中腦導水管

1.4 免疫組化檢測迷走復合體上阿黑皮素原的表達 免疫組化方法：二甲苯中脫蠟，無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各2 min浸泡，自來水沖洗、PBS沖洗、修復組織抗原、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性、滴加正常非免疫動物血清、滴加抗體，3，3-二氨基苯聯(lián)胺顯色至陽性細胞出現(xiàn)，封片，鏡下觀察。免疫組化陽性結果判斷：陽性細胞呈棕色變化。隨機取陽性切片的5個視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)，取平均值。另外再隨機選5個視野，互不重疊，運用圖像分析系統(tǒng)，算出每個視野陽性細胞積分光密度，取平均值作為阿黑皮素原定量指標。

2 結果

2.1 免疫組化檢測迷走復合體上阿黑皮素原的表達陽性細胞計數(shù)結果 大鼠側腦室置管自由恢復1周，清醒無麻醉狀態(tài)下中樞注射瘦素后，免疫組化檢測迷走復合體上阿黑皮素原的表達陽性細胞計數(shù)結果：注射瘦素1 h后測迷走復合體上阿黑皮素原的陽性細胞數(shù)，與生理鹽水對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。中樞注射瘦素組檢測迷走復合體上阿黑皮素原的表達3 h、5 h后測陽性細胞數(shù)，與生理鹽水對照組中樞側腦室注射瘦素組1、3、5 h各亞組比較，差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。見表1,圖2、3。

組別1h3h5h中樞注射瘦素組16.83±2.5516.90±3.6116.62±2.66生理鹽水對照組17.09±1.9117.08±1.917.06±1.89

圖2 迷走復合體上阿黑皮素原表達比較

圖3 迷走復合體上阿黑皮素原的表達

2.2 免疫組化檢測迷走復合體上阿黑皮素原的表達陽性細胞積分光密度結果 大鼠側腦室置管，清醒無麻醉狀態(tài)下側腦室注射瘦素后，免疫組化檢測迷走復合體上阿黑皮素原的表達陽性細胞積分光密度結果：陽性細胞積分光密度1、3、5 h亞組分別與與生理鹽水對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)，中樞注射瘦素組中1、3、5 h亞組，組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。見表2，圖2、3。

組別1h3h5h中樞注射瘦素組46.72±4.6844.21±4.7543.20±1.96生理鹽水對照組43.54±3.3843.51±3.3943.49±3.40

3 討論

瘦素在弓狀核，通過與瘦素受體結合，激活阿黑皮素原(POMC)，抑制神經(jīng)肽Y而發(fā)揮作用[4,5]。迷走神經(jīng)支配了整個胃腸系統(tǒng)，實施全部副交感神經(jīng)對胃的調(diào)控，占迷走神經(jīng)80%構成的傳入纖維，終止于孤束核，占迷走神經(jīng)20%構成的傳出纖維，是由迷走運動背核發(fā)出的，孤束核和迷走運動背核位于第四腦室底部，腦干背側，兩個核團腹背相連，統(tǒng)稱迷走復合體。迷走神經(jīng)傳入纖維將飽感的信號傳到位于后腦的孤束核(位于腦干的尾端)，孤束核整合來自腹腔內(nèi)臟、胃腸道、口腔味覺等的信號，產(chǎn)生了飽感，同時與前腦的室旁核雙向聯(lián)系，對接收的信號進行整合。孤束核上具有與進食有關的神經(jīng)肽類相關受體，如前阿黑皮素受體的表達，將相關受體的拮抗劑、激動劑注入第四腦室(臨近孤束核)，可以產(chǎn)生攝食反應。孤束核上也存在瘦素和前阿黑皮素受體，提示前腦、后腦共同處理來自傳入纖維的信號，孤束核可能如腦干其他部位如弓狀核那樣，對瘦素產(chǎn)生生物學反應[6]。迷走復合體是迷走神經(jīng)的運動及感覺中樞，其上也存在阿黑皮素原。

瘦素通過與功能受體結合來發(fā)揮生物學作用。瘦素生物學作用廣泛，其中最重要的是調(diào)節(jié)攝食[7]，通過影響下丘腦的食欲中樞，與下丘腦上瘦素受體的結合，抑制神經(jīng)肽Y合成與釋放，減少攝食量，從而使產(chǎn)熱減少，實現(xiàn)對體質(zhì)量和體質(zhì)的調(diào)控，從而達到調(diào)節(jié)體重下降的目的，電生理學方法同樣證明，瘦素通過影響下丘腦弓狀核上神經(jīng)肽Y神經(jīng)元的信號轉(zhuǎn)導，引起食欲下降，從而降低體重，瘦素還增加下丘腦上的促黑激素(MSH)分泌，促黑激素可以使食欲減退。瘦素還參與對生殖的調(diào)節(jié)，瘦素在發(fā)育與生殖的信號傳遞中有重要的作用，可作用在下丘腦-垂體-性腺軸各個層次，瘦素通過與下丘腦瘦素長型受體結合調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素的釋放和性行為，中樞注射瘦素可使卵泡刺激素、促黃體激素和催乳素分泌減少[8]。另外，瘦素還參創(chuàng)傷的修復,參與促進血細胞的生成,促進血管的新生,近來的研究還顯示,瘦素在免疫應答和炎性反應中也有重要的調(diào)節(jié)作用,瘦素及瘦素受體與骨肉瘤的發(fā)生關系密切,與對神經(jīng)內(nèi)分泌、血壓等的調(diào)節(jié)[9-17]。

瘦素在中樞作用的靶器官是下丘腦，下丘腦上有豐富瘦素受體存在，主要是弓狀核瘦素受體表達最豐富，將瘦素微量通過中樞注入，可抑制大鼠攝食行為。瘦素的這些作用，是通過影響單胺類、神經(jīng)肽和一些細胞因子完成的。阿黑皮素原是一類神經(jīng)肽，265個氨基酸組成，基因在小鼠上定位于12-4，人染色體上定位于2p23.2，刪除動物阿黑皮素原基因，動物腎上腺皮質(zhì)激素減少分泌，再次注射后可逐漸恢復。阿黑皮素原經(jīng)水解后形成多種肽，包括促黑激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、β-內(nèi)啡肽等，在垂體、弓狀核、胰腺、皮膚、睪丸等發(fā)現(xiàn)其表達。阿黑皮素原在弓狀核的表達受瘦素的影響，與血液循環(huán)中的瘦素濃度成正比，瘦素濃度低，阿黑皮素原表達少，瘦素濃度高，阿黑皮素表達多[6]。瘦素與瘦素受體作用，通過細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，引起阿黑皮素表達。

阿黑皮素原和瘦素受體共同存在于弓狀核，給大鼠注入瘦素，阿黑皮素原會增加，同時表現(xiàn)為動物的攝食量減少，即瘦素發(fā)揮生物學作用可能部分依賴阿黑皮素原的變化。迷走復合體上也有瘦素受體的表達，其上也存在阿黑皮素原，瘦素是否同下丘腦弓狀核一樣也在迷走復合體對阿黑皮素原進行調(diào)節(jié)呢。本實驗通過在實驗前1周給大鼠于側腦室留置不銹鋼制導管,并用導絲封閉導管,讓實驗用SD大鼠恢復1周,恢復期間每日進行馴養(yǎng),實驗當日在大鼠清醒沒有麻醉狀態(tài)下側腦室注射瘦素，此法避免了應激因素的干擾以及麻藥的影響,得出的結果非常接近正常生理狀態(tài),是神經(jīng)生物學可靠的實驗方法，相較于體外細胞培養(yǎng)，具備明顯優(yōu)勢，實驗結果可信。本研究通過中樞注射瘦素后監(jiān)測迷走復合體上的阿黑皮素原的表達，通過免疫組化檢測迷走復合體上阿黑皮素原的表達陽性細胞計數(shù)結果：注射瘦素1、3、5 h后測得陽性細胞數(shù)分別是(16.83±2.55)、(16.90±3.61)、(16.62±2.66)，與生理鹽水組比較，差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。注射瘦素1、3、5 h后測得陽性細胞積分光密度的結果分別是(46.72±4.68)、(44.21±4.75)、(43.20±1.96)，與生理鹽水對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。1、3、5 h亞組，各亞組間比較，無論是陽性細胞計數(shù)結果，還是陽性細胞積分光密度結果，差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。兩種實驗方法，所得結果一致，均沒有統(tǒng)計學意義，這一結果與Huo等[18]的研究成果一致，不同于以往研究證實的同弓狀核一樣也在迷走復合體對阿黑皮素原進行調(diào)節(jié)。因此推測對大鼠側腦室給予瘦素不能引起迷走復合體上阿黑皮素原表達的增多。

胰島素是由β胰島細胞來分泌的一種因子，它作用在脂肪、肝臟、肌肉等器官組織，能夠調(diào)節(jié)血糖水平，同時也可作用在阿黑皮素原和NPY神經(jīng)元，但既往的觀點認為胰島素和瘦素作用在不同的阿黑皮素原神經(jīng)元亞群而發(fā)揮調(diào)節(jié)能量平衡作用，但Dodd等[19]的研究證實阿黑皮素原神經(jīng)元可以整合胰島素和瘦素的信號，促進白色脂肪組織棕色化以維持能量平衡。另外迷走復合體生成胰高血糖素-1的神經(jīng)元上含瘦素受體，胰高血糖素-1是瘦素作用的靶細胞，使用胰高血糖素-1的拮抗劑，會阻斷瘦素抑制攝食的作用[20]。因此推測在迷走復合體上，不同于下丘腦弓狀核，引發(fā)阿黑皮素原的基因表達，瘦素發(fā)揮生物學活性，是通過與瘦素受體的結合，或是其他一些多肽，但是具體的作用機制還依靠進一步的研究來證實。

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Effectsofleptinbymeansoflateralventricleinjectiononproopiomelanocortinindorsalvagalcomplexinofrats

ZHAOYanjun*,MALixin,WURuiqin,etal.

*DepartmentofEmergency,TheAffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity,Hebei,Chengde067000,China

ObjectiveTo investigate the effects of leptin by means of lateral ventricle injection on proopiomelanocortin in dorsal vagal complexin of rats,and to explore whether the leptin can adjust proopiomelanocortin in dorsal vagal complex like hypothalamic arcuate nucleus,so as to find a possible path that leptin plays a role in vagal complex.MethodsThirty-six SD rats were randomly divided into experimental group and control group,with 18 rats in each group,moreover,the experimental group was redivided into 3 subgroups according to the death time after injection (1h,3h,5h),with 6 rats in each subgroup. The stainless steel catheter was detained in lateral ventricle of rats for 1 week,then the rats were free to resume and domesticated,then the rats in experimental group were given leptin 3.5μg/μl by lateral ventricle injection,however,the rats in control group were given 0.9% sodium chloride solution 3.5μg/μl.Finally the dorsal vagal complex was located by Hematoxylin-eosin dyeing,and the expression of proopiomelanocortin was detected.ResultsOn 1,3,5h after giving leptin by intracerebroventricular injection,there were no significant differences in the positive expression cell count and positive expression cell integral optical density of proopiomelanocortin in dorsal vagal complex between experimental group and control group (Pgt;0.05). Moreover there were no significant differences in the positive expression cell count and positive expression cell integral optical density of proopiomelanocortin in dorsal vagal complex among the three subgroups (Pgt;0.05).ConclusionInjecting leptin into lateral ventricle of rats can not result in the increase of proopiomelanocortin in dorsal vagal complex.

leptin; proopiomelanocortin; dorsal vagal complex; intracerebroventricular injection;rats

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.22.006

項目來源：河北省重點科技研究計劃(編號：20110546)

067000 河北省承德市,承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院急診科(趙艷軍)，消化內(nèi)科(馬立新、吳瑞芹、李炳慶)；承德醫(yī)學院科研處(宋成軍)

李炳慶，067000 河北省承德市,承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；

E-mail:727102164@qq.com

R 589.2

A

1002-7386(2017)22-3388-04

2017-06-21)