周方，李 希，*，向采芹，馮建安，黃嫣

Box-Behnken設計優(yōu)化藿芪溫陽丸純化工藝

周方1，李 希1，2*，向采芹1，馮建安2，黃嫣1

目的：應用Box-Behnken設計-響應面法優(yōu)化藿芪溫陽丸純化工藝參數(shù)條件。方法：以黃芪甲苷含量和除雜率的綜合評分為響應值，單因素試驗結合Box-Behnken設計對轉速，濃縮料液比，離心時間進行考察，優(yōu)選藿芪溫陽丸純化工藝參數(shù)條件。結果：藿芪溫陽丸純化工藝最佳條件為：濃縮料液比為1:3.10，3320 r/min，離心20.15 min。結論：運用Box-Behnken設計-響應面法優(yōu)化藿芪溫陽丸純化工藝，穩(wěn)定可行。

黃芪甲苷；除雜率；Box-Behnken；響應面法；純化工藝

藿芪溫陽丸由醫(yī)生經(jīng)驗方所得，有淫羊藿，黃芪，仙茅，雞血藤等藥味組成，具有溫陽益氣，活血祛瘀的功效，主治女子痛經(jīng)、經(jīng)前期綜合癥、多囊卵巢綜合癥，下肢淋巴水腫，男子陽痿遺精等癥。

純化是采用適當?shù)姆椒ê驮O備除去中藥提取液中雜質的操作，一般常用的有水提醇沉法，醇提水沉法，超濾法，澄清劑法，大孔樹脂吸附法等[1～2]。因在制劑的生產(chǎn)過程中，離心沉降工藝可作為醇沉的替代方法[3]，故本實驗應用離心分離法作為藿芪溫陽丸的純化方法，并應用Box-Behnken設計-響應面法來優(yōu)選純化工藝參數(shù)。此方法主要通過多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的關系，從而達到優(yōu)選工藝參數(shù)條件的目的，并且預測性能強[4]。

1 儀器與材料

TG-16S臺式微量高速離心機（四川蜀科儀器有限公司）；Agilent-1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；奧泰ELSD800 蒸發(fā)光散射檢測器；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CS101電熱鼓風干燥箱（重慶實驗設備廠制造）；電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；藥材飲片（四川新荷花中藥飲片股份有限公司）；黃芪甲苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：974-200106）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制[5]

精密稱取黃芪甲苷對照品7.04 mg，置5 ml容量瓶，加甲醇至刻度，定容，搖勻。精密量取2 ml，置5 ml容量瓶中。加甲醇至刻度，搖勻，既得0.5632 g﹒L-1的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制

精密移取提取液適量，加甲醇40 ml超聲30min，置蒸發(fā)皿中蒸干為粉末，殘渣加水10 ml使溶解。水飽和正丁醇提取3次，每次40 ml，合并正丁醇液。氨試液洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，甲醇定容于5 ml容量瓶即得。

2.3 陰性樣品溶液配制

取不含黃芪的提取液，按照2.2項下方法制的陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件及專屬性考察

色譜柱（VP-ODS 150L×4.6 5012145），流動相為乙腈：水（30：70），流速1 ml﹒min-1，漂移管溫度：60 ℃，載氣壓強：2.00 bar,柱溫：25 ℃，理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應不低于4000，檢測器：ELSD。 取對照品、供試品以及陰性樣品溶液各10 μL， 按照上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖1。表明該方法專屬性良好。

2.5 線性范圍考察

分別取6組不同濃度的對照品溶液（0.12432，0.24864，0.37296，0.49728，0.6216，1.2432g﹒l-1）各10ul，以對照品峰面積的常用對數(shù)值為縱坐標Y，以進樣量的常用對數(shù)值為橫坐標X， 繪制標準曲線。線性回歸得到回歸方程為：Y＝1.5692X＋4.2459（r＝0.9997）。結果表明黃芪甲苷在1.2432 ug～12.432 ug范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗考察

取上述供試品溶液一份，分別于 0、2、4、8、12、24 h測定黃芪甲苷峰面積，得出供試品中黃芪甲苷平均峰面積積分值為190945，RSD為2.1%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 單因素試驗

以黃芪甲苷含量為指標，單因素試驗方法考察轉速，濃縮料液比，離心時間對純化工藝的影響。

2.7.1轉速考察 濃縮料液比為1:3，離心時間為20 min，考察不同轉速（1000，2000，3000，4000，5000，6000 r/min）對黃芪甲苷含量的影響。隨著轉速的增加黃芪甲苷含量先增大后趨于平穩(wěn)，當轉速為3000 r/min時，黃芪甲苷含量最大。

2.7.2濃縮料液比考察 離心時間為20 min，轉速為3000 r/min，考察不同濃縮料液比（1:1，1:2，1:3，1:4，1:5）對黃芪甲苷含量的影響。隨著濃縮料液比的增大黃芪甲苷含量先增大后減小，當濃縮料液比為1:3時，黃芪甲苷含量最大。

2.7.3 離心時間考察 濃縮料液比為1:3，轉速為3000 r/min，考察不同離心時間（10，15，20，25，30，35 min）對黃芪甲苷含量的影響。隨著離心時間的增加黃芪甲苷含量先增大，后趨于平穩(wěn)，當離心時間為25 min時，黃芪甲苷含量最大。

2.8 響應面優(yōu)化實驗

2.8.1 響應面實驗設計 根據(jù)單因素試驗結果設計因素水平表（表1），以黃芪甲苷含量和除雜率的綜合評分為指標，應用Box-Behnken設計（表2），統(tǒng)計軟件Design-Expert.8.05b對試驗結果進行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程為：Y=87.55+0.30A+1.43B+0.36C+0.92AB-1.03AC-0.088BC-0.93A2-7.31B2-4.71C2(r=0.9839)。說明模型對實際情況擬合較好。方差分析見表3。1330003200.31987.3688.48 1430003200.29098.5686.18 1530002100.22778.3472.47 1615003300.31425.7482.38 1745003100.30286.8883.51

表1 因素水平表

表2 藿芪溫陽丸純化工藝Box－Behnken試驗設計

圖1 專屬性考察（橫坐標單位為t/min）

其中綜合評分=黃芪甲苷含量/最高值×70＋除雜率/最高值×30。除雜率=提取出膏率（24.26%）－純化出膏率。出膏率=(M2－M1)V2/mV1×100%。（M1為已恒重的蒸發(fā)皿質量，M2為加入提取液后蒸發(fā)皿恒重質量，V1為一定量的提取液，V2為待測樣品總體積，m為待測樣品藥材總質量）。

表3 方差分析

由表3可得，此模型P=0.0002＜0.01，表明該模型極顯著，可用來響應值預測。矢擬項P=0.2305＞0.05，不顯著，說明本實驗無其他顯著性因素的影響。3個因素對純化工藝的影響順序為B＞C＞A，其中B（濃縮料液比）因素P=0.0181＜0.05，表明B因素顯著，具有統(tǒng)計學意義。A（轉速）因素和C（離心時間）因素對此工藝的影響不是很大。B2和C2（P值均小于0.01）為極顯著，具有統(tǒng)計學意義。2.8.2 響應面分析 應用Design-Expert.8.05b軟件繪制轉速，濃縮料液比，離心時間的響應面3D圖，如圖2

所示。圖中可看出轉速在3000-3500 r/min之間，濃縮料液比在1:3左右，離心時間20 min左右時，綜合評分的值為最高。最終通過響應面分析及實際應用綜合考慮，藿芪溫陽丸純化工藝參數(shù)條件為，3320 r/min，濃縮料液比為1:3.10，離心20.15 min。

2.8.3 驗證試驗 為了驗證優(yōu)化結果的穩(wěn)定性，應用優(yōu)選出的參數(shù)條件安排3組平行實驗。測得黃芪甲苷含量分別為0.3198，0.3146，0.3205 mg/g，平均值為0.3183 mg/g。除雜率分別為7.58%，8.33%，8.01%，平均除雜率為7.97%。綜合評分為90.04分，與預測值相比其誤差小于3%，說明該模型有較好的預測性，且優(yōu)化參數(shù)條件穩(wěn)定。

3 討論

中藥復方的純化工藝在制劑生產(chǎn)過程中有著非常重要的作用，其目的為盡量的溶出方中各藥的有效成分或有效部位，最低限度的保留無效甚至有害的雜質，并減少服用量，增加制劑的穩(wěn)定性，提高療效等[6]。本研究利用離心法來進行中藥復方的純化，借助離心機高速旋轉產(chǎn)生的離心力，使固液達到分離。對于工藝優(yōu)化應用最普遍的是正交設計，但其數(shù)學模型的預測力差，選出條件為已選定水平上的最佳條件，而非最優(yōu)條件，有一定的局限性[7]。采用Box－Behnken設計-響應面法，建立了一個因素與響應值之間的非線性模型，可準確得到優(yōu)化最佳工藝條件。應用最終優(yōu)選出的純化條件得到黃芪甲苷的含量為0.3183 mg/g，除雜率為7.97%。為后續(xù)制劑研發(fā)奠定了基礎。

圖2 響應面3D圖

[1] 何春喜,余澤義,何毓敏等. 竹節(jié)參總皂苷的大孔吸附樹脂純化與離子交換樹脂脫色工藝研究[J]. 中草藥,2017,48(06):1146-1152.

[2] 董泰瑋,王昌利,史亞軍. 復方龍脈寧滴丸中葛根素和薯蕷皂苷純化工藝研究[J]. 陜西中醫(yī),2015,36(02):230-232.

[3] 李同莉,趙國英,袁秀榮,周華,薛金貴. 鹿紅方提取純化工藝研究[J]. 上海中醫(yī)藥雜志,2015,49(11):83-86.

[4] 高寧,張婷婷,張薇等. Plackett-Burman設計和響應面法優(yōu)化黑果小檗果實總黃酮超聲提取工藝[J]. 新疆醫(yī)科大學學報,2017,40(04):494-49.

[5] 國家藥典委員會.中國藥典2015年版[S].一部.北京:中國中醫(yī)藥出版社,2015.

[6] 周剛. 中藥復方新藥研發(fā)中工藝研究需關注的問題[J]. 中國新藥雜志,2014,23(16):1865-1867.

[7] 蘭金榮,葉文斌. 響應面法與正交設計法比較研究天麻多糖提取優(yōu)化工藝[J]. 包裝與食品機械,2014,32(04):10-15.

The optimization of the purification technology of Huoqiwenyang pill using Box-Behnken design

/ZHOU Fang1,LI Xi1,2,XIANG Cai-qin1, FENG Jian-an2, HUANG Yan1//1.( School of Pharmacy, Chengdu university of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan;2. Institute of TCM, Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine sciences, Chengdu 610031, Sichuan)

Objective:To optimize the purification technology parameters of Huoqiwenyang pill using Box-Behnken design response surface method.Method:The purification technology parameters of Huoqiwenyang pill were optimized with the comprehensive score of Astragaloside content and impurity removal efficiency as response value. The rotational speed,concentration solid-liquid ratio, centrifugal time were investigated by the combination of single factor experiment and the Box-Behnken design.Result:The best purification technology of Huoqiwenyang pill is as following: concentration solid-liquid ratio of 1:3.10, 3320 r﹒min-1, centrifugation for 20.15 min.Conclusion:The purification technology parameters of Huoqiwenyang pill optimized by Box-Behnken design response surface method is feasible and stable .

Astragaloside; impurity removal efficiency; Box-Behnken; response surface method; purification technology

R283.6

A

1674-926X(2017)05-006-04

1成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 611137 2四川省中醫(yī)藥科學院中醫(yī)研究所 四川 成都 610031

周方，女(漢1993-)在讀碩士研究生，從事中藥新制劑、新技術、新工藝的研究，Tel:18291097486 Email:969708702@qq.com.

*李 希，女(漢1969-)，碩士，教授，從事中藥新制劑、新技術、新工藝的研究工作，Tel:13608170046 Email:1836820767@qq.com

2017-4-14

(責任編輯：傅舒)