陳 昕，陳靈鋒，黃 穎

qPCR檢測(cè)結(jié)核桿菌在肺和胸膜上皮樣肉芽腫性疾病診斷中的意義

陳 昕，陳靈鋒，黃 穎

目的探討熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction, qPCR)法在診斷及鑒別診斷肺和胸膜結(jié)核病和其他肉芽腫性疾病中的意義。方法收集經(jīng)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)上皮樣肉芽腫性病變的肺和胸膜活檢的石蠟包埋組織142例，應(yīng)用qPCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA，同時(shí)行抗酸染色，并與臨床資料對(duì)比進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果在142例肺胸膜活檢標(biāo)本中，60例臨床診斷確診為結(jié)核病。采用qPCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性者58例，敏感性為96.67%，特異性為100%；抗酸染色陽(yáng)性者17例，敏感性為28.33%，特異性為97.56%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.47，P<0.001)。結(jié)論結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)有助于在石蠟包埋的肺和胸膜小活檢組織中快速、準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病，可用于疑似結(jié)核的肉芽腫性病變的鑒別診斷。

結(jié)核；分枝桿菌；福爾馬林固定石蠟包埋組織；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染病，近年來(lái)發(fā)病率呈增高趨勢(shì)。早期診斷并及時(shí)治療是控制結(jié)核病疫情的關(guān)鍵，因此，準(zhǔn)確、快捷、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法具有十分重要的意義。常規(guī)病理確診結(jié)核病，除了觀察其特征性肉芽腫性病理改變，還需找到結(jié)核分枝桿菌。病理科常規(guī)開(kāi)展齊-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法尋找病原菌，但抗酸染色普遍檢出率低。近年來(lái)，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction, qPCR)法逐漸應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，常用于痰液檢測(cè)，也陸續(xù)見(jiàn)有報(bào)道用于病理石蠟包埋組織。本實(shí)驗(yàn)組在一組疑似結(jié)核的活檢石蠟組織中同時(shí)采用qPCR法和抗酸染色進(jìn)行檢測(cè)，旨在評(píng)價(jià)兩種方法在輔助病理確診結(jié)核病中的價(jià)值與意義。

1 材料與方法

1.1一般資料選取福建省立醫(yī)院2013年1月～2015年12月期間肺、縱隔活檢組織經(jīng)病理檢查顯示上皮樣肉芽腫性病變、需排除結(jié)核病的石蠟包埋組織142例。其中肺、支氣管活檢組織99例，胸膜活檢組織32例及縱隔活檢組織11例(圖1)。其中男性73例，女性69例，年齡14～77歲，平均年齡44歲。所有病例均同時(shí)采用qPCR法檢測(cè)結(jié)核桿菌DNA，結(jié)合Ziehl-Neelsen抗酸染色檢查輔助診斷。本組142例肺、胸膜及縱隔活檢組織中，臨床確診為結(jié)核病60例，非結(jié)核病82例。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 QIACUBE全自動(dòng)核酸純化儀(Qiagen公司，德國(guó))；Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Qiagen公司，德國(guó))。

1.2.2試劑 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat.56404, Qiagen公司，德國(guó))；結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?[國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2009第3400575號(hào)]。

1.3方法

1.3.1qPCR 每例活檢石蠟組織10 μm厚切片8片，提取DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和OD值(A260/A280比值在1.6～2.0間的為合格樣本)。PCR擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌特異插入片段IS6110。反應(yīng)體系為40 μL(結(jié)核PCR反應(yīng)液37.8 μL、Taq酶0.2 μL、UNG酶0.06 μL)；反應(yīng)條件：37 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每批樣本均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、臨界陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照，對(duì)照品均來(lái)源于試劑盒中的對(duì)照質(zhì)粒DNA。結(jié)果判定：檢測(cè)樣本Ct值=40時(shí)，判為陰性；Ct值≤37.0時(shí)，判為陽(yáng)性；Ct值介于37.0和40之間時(shí)，建議復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果Ct值<40者，判為陽(yáng)性。

1.3.2抗酸染色 石蠟組織4 μm厚切片，常規(guī)二甲苯脫蠟至水；滴加苯酚堿性品紅液37 ℃孵育15～30 min，水洗；滴加分化液分化數(shù)秒，充分水洗；滴加Mayer蘇木精孵育30 s；流水沖洗10～15 min，干燥、透明、封固。結(jié)果判定：結(jié)核桿菌抗酸染色陽(yáng)性，呈鮮紅色；其他細(xì)菌及細(xì)胞呈藍(lán)色。高倍鏡下連續(xù)觀察300個(gè)視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌者，判為陰性；找到1～8條抗酸桿菌/300視野，判為可疑陽(yáng)性(±)；找到>3條抗酸桿菌/100視野，判為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值等。配對(duì)χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌19例抗酸染色結(jié)果為陽(yáng)性，總體陽(yáng)性率為13.38%(表1)；在60例臨床確診為結(jié)核病的活檢組織中，17例抗酸染色陽(yáng)性，敏感性為28.33%，特異性為97.56%，準(zhǔn)確性為68.31%(圖2)。

①A①B②A②B

圖1肺和胸膜活檢組織的上皮樣肉芽腫性炎性病變：A.肺活檢組織；B.胸膜活檢組織，低倍鏡下均呈慢性肉芽腫性炎性改變圖2抗酸染色結(jié)果：A病例抗酸染色可見(jiàn)多量抗酸抗菌(藍(lán)色箭頭)；B病例抗酸染色為陰性

2.2qPCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌142例疑似結(jié)核的肺、胸膜及縱隔活檢組織標(biāo)本中，58例結(jié)核桿菌核酸qPCR反應(yīng)為陽(yáng)性，總體陽(yáng)性率為40.9%(圖3)。在60例臨床確診為結(jié)核病的活檢組織中，qPCR檢測(cè)58例為陽(yáng)性，2例為陰性，敏感性為96.67%，特異性為100%，準(zhǔn)確性為98.59%(表1)。

本組142例肺、胸膜及縱隔活檢組織標(biāo)本中，17例qPCR和抗酸染色檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌均陽(yáng)性，82例均陰性，符合率為69.72%(表2)。對(duì)兩種方法進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.301(P<0.001)，兩者具有較好地吻合性。qPCR法敏感性高于抗酸染色法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.468，P<0.001，表1)。

表1 142例活檢標(biāo)本qPCR與抗酸染色檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果

表2 抗酸染色與qPCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌結(jié)果的一致性比較

圖3 qPCR檢測(cè)結(jié)果

A.圖2A病例的qPCR檢測(cè)結(jié)果示結(jié)核桿菌呈陽(yáng)性；B.圖2B病例的qPCR檢測(cè)結(jié)果呈陰性

3 討論

我國(guó)結(jié)核病防治形勢(shì)很嚴(yán)峻，發(fā)病率高居全球第3位，而且耐多藥結(jié)核病的疫情嚴(yán)重[1]。2007～2008年全國(guó)結(jié)核菌耐藥性基線調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)肺結(jié)核患者中多藥耐藥率為8.32%，每年新發(fā)耐藥的結(jié)核患者約為12萬(wàn)例，占全球每年新發(fā)病例總數(shù)的24%，位居全球的第2位[2]。2010年第五次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，一線抗結(jié)核藥物耐藥率為36.8%，二線抗結(jié)核藥物耐藥率為24.6%，總耐多藥率為6.8%[1]。

結(jié)核病的特征性病理學(xué)改變是肉芽腫性病變伴有干酪樣壞死。但結(jié)核的病理特征在HE染色中不具有特異性，很難與結(jié)節(jié)病及真菌感染等肉芽腫性疾病鑒別，一直以來(lái)病理科應(yīng)用Ziehl-Neelsen抗酸染色尋找結(jié)核桿菌，與其他肉芽腫性疾病鑒別診斷，是病理學(xué)診斷結(jié)核病的一種首選的輔助手段。然而抗酸染色的特異性具有局限性，除了結(jié)核分枝桿菌外，其它一些引起人、畜共感染的桿菌，如牛分枝桿菌、禽分枝桿菌以及麻風(fēng)桿菌等感染人體后均可呈肉芽腫性炎改變，或可伴干酪樣壞死，并且抗酸染色均呈陽(yáng)性[3]。因此，如果僅憑病理組織學(xué)形態(tài)和抗酸染色結(jié)果診斷，有可能將其他分枝桿菌感染誤診為結(jié)核。

qPCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR反應(yīng)中引入熒光標(biāo)記探針，操作步驟簡(jiǎn)單，又消除了非特異性擴(kuò)增，從擴(kuò)增到檢測(cè)的全程 “閉管”操作，避免產(chǎn)物污染，大幅度降低了假陽(yáng)性率。結(jié)核分枝桿菌3個(gè)序列常被選作目的擴(kuò)增片段：16SrRNA、rpoB和IS6110，其中IS6110插入序列是結(jié)核分枝桿菌群特異序列[4-5]。本實(shí)驗(yàn)選用的試劑盒擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌的特異序列IS6110。在本組病例中，qPCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌顯示出高度的敏感性及特異性，其敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗酸染色法。

小活檢組織病理診斷結(jié)核病更具挑戰(zhàn)性，抗酸染色查找結(jié)核桿菌陽(yáng)性率低，容易造成漏診。迄今少有肺及胸膜活檢組織中結(jié)核病診斷的大病例數(shù)報(bào)道。本組納入142例疑似結(jié)核的肺、胸膜及縱隔活檢組織，同時(shí)采用抗酸染色和qPCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行輔助診斷。結(jié)合臨床資料回顧性分析，臨床確診為結(jié)核病的60例中，qPCR檢測(cè)陽(yáng)性率為96.67%，抗酸染色陽(yáng)性率為28.33%，qPCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌敏感性明顯高于抗酸染色法?？顾崛旧皅PCR法檢測(cè)核酸桿菌均具有很高的特異性，qPCR特異性為100%，抗酸染色特異性為97.56%。qPCR法檢測(cè)核酸桿菌的陽(yáng)性率高于以往54.6%[5]、64.6%[6]的報(bào)道?？顾崛旧珯z測(cè)結(jié)核桿菌的陽(yáng)性檢出率普遍偏低，文獻(xiàn)報(bào)道不一，本組病例抗酸染色陽(yáng)性率為28.33%，低于既往51.3%[5]、39.8%[7]的報(bào)道，但接近于兩組30.5%及32.5%的陽(yáng)性率[6,8]。

分析本組病例抗酸染色陽(yáng)性率偏低的可能原因：(1)可能由于本組病例為小活檢組織，檢出率受限于是否活檢到包含結(jié)核桿菌的組織；但基于配對(duì)的qPCR反應(yīng)顯示很高的陽(yáng)性率，提示本組病例的抗酸染色操作和評(píng)判可能存在不足。(2)活檢組織僅含極少數(shù)的抗酸桿菌于鏡下觀察時(shí)被忽略。(3)認(rèn)為抗酸染色的操作很可能是導(dǎo)致本組抗酸染色檢出率低更為重要的原因。

抗酸染色的原理是加熱條件下使分枝桿菌與石碳酸復(fù)紅結(jié)合成復(fù)合物系鹽酸乙醇處理不易脫色的牢固性結(jié)合，經(jīng)堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌依然呈紅色，突顯于藍(lán)色背景中。但在實(shí)際操作中由于各種原因，抗酸染色結(jié)果不太穩(wěn)定，尤其在石蠟組織病理切片中的抗酸菌染上色后容易被鹽酸乙醇脫色，導(dǎo)致假陰性，造成陽(yáng)性率較低?？诐嵉萚9-10]對(duì)傳統(tǒng)抗酸染色進(jìn)行了改良，通過(guò)提高石蠟切片厚度；促染劑提高抗酸菌的被染色率；改良脫蠟液增加染色后抗酸菌的抗酸性，以及進(jìn)一步優(yōu)化背景染色，改良后的抗酸染色陽(yáng)性率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的抗酸染色法。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肺、胸膜活檢組織中采用qPCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌具有很高的敏感性及特異性，在輔助結(jié)核病的診斷中展示出良好的應(yīng)用前景。

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R 521； R 561

A

1001-7399(2017)10-1132-03

時(shí)間：2017-10-23 13:30 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.017.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.017

接受日期：2017-07-27

國(guó)家青年自然科學(xué)基金(81201794)、福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2015-ZQN-ZD-3)、福建省自然科學(xué)基金(2012J01117)、福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題(2012-CX-3)

福建省立醫(yī)院病理科/福建省立臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350001

陳 昕，女，技師。E-mail: 729039151@qq.com

黃 穎，女，博士，副主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: huang_ying11@hotmail.com