黃俊杰,王志斌,陳納,張建色,王志翊,黎婷,戴開宇,梅勁,樓新法

(1.溫州醫(yī)科大學 生物支架移植與免疫研究所,浙江 溫州 325035;2.溫州醫(yī)科大學 第二臨床醫(yī)學院,浙江 溫州 325035;3.浙江大學附屬第一醫(yī)院 普外科,浙江 杭州 310058)

.論 著.

大網膜包埋移植肝臟去細胞生物支架血管化過程觀察

黃俊杰1,3,王志斌1,陳納2,張建色1,王志翊1,黎婷1,戴開宇1,梅勁1,樓新法1

(1.溫州醫(yī)科大學 生物支架移植與免疫研究所,浙江 溫州 325035;2.溫州醫(yī)科大學 第二臨床醫(yī)學院,浙江 溫州 325035;3.浙江大學附屬第一醫(yī)院 普外科,浙江 杭州 310058)

目的:觀察肝臟去細胞生物支架(AHS)大網膜包埋移植后的血管新生過程.方法:采用TritonX-100灌注法制備大鼠肝臟AHS,HE染色、掃描電鏡、鑄型、DNA含量檢測、免疫熒光染色等方法鑒定去細胞效果;通過大網膜包埋移植肝臟AHS,分別于術后1、3、7、14、28 d處死大鼠,病理切片HE染色觀察移植肝臟AHS血管新生過程.結果:灌注法制備的肝臟AHS空間結構與細胞外基質成分保留完整,細胞成分基本被去除,AHS組DNA含量與正常對照組比差異有統計學意義(P<0.01);大網膜包埋移植肝臟AHS術后3 d,靠近網膜移植區(qū)的支架內出現血竇,術后7 d出現新生血管,并逐漸向移植支架中心區(qū)域延伸,血管逐步分化成熟,14 d以后形成血管化網狀組織,28 d以后血管化網狀組織仍存在.結論:大網膜包埋移植促使肝臟AHS再細胞化,最終可形成血管化的網狀結構.

肝臟;去細胞;血管;組織工程;大鼠

再造一個可供移植的肝臟組織或類器官是肝臟組織工程學的最終目標,除種子細胞外,支架材料是誘導種子細胞黏附、增殖、分化并維持功能的重要載體,也是構建組織工程肝臟的基礎.肝臟去細胞生物支架(acellular hepatic scaffolds,AHS)制備技術改變了傳統天然細胞外基質(extracellular matrixc,ECM)和人工合成高分子聚合物等支架材料結構成分單一、生物相容性差等缺點,正常肝臟ECM的主要成分及其組成的三維空間結構如肝動靜脈、門靜脈和膽道等管道均得到完整保留[1],還能夠誘導各類干細胞向類肝細胞分化[2-3],是理想的可用于生物人工肝、器官重構等研究的生物支架材料.支架材料血管化是實現組織工程肝臟的體外培養(yǎng)構建與體內移植的重要途徑,目前肝細胞體外培養(yǎng)系統的氧和營養(yǎng)供給主要來自與培養(yǎng)液的滲透交換,這不但限制了肝細胞培養(yǎng)的數量與質量,也使得體外構建的組織工程肝臟無法通過血管縫合方式直接進行體內移植.為此本研究通過體內大網膜包埋移植AHS,動態(tài)觀察移植支架血管化過程,為后續(xù)深入研究移植支架中的血管再生機制以及體外AHS血管化組織構建提供實驗基礎.

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康10周齡雄性SD大鼠50只,體質量(200±20)g,由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供,動物生產許可證號:SCXK(浙)2010-0044.采用完全隨機法將SD大鼠分為AHS制備組(n=10)、正常對照組(n=10)和ASH大網膜包埋移植組(n=30,分移植術后1、3、7、14、28 d組,每組6只),正常對照組用于獲取正常肝臟和大網膜組織標本.動物實驗嚴格按照科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》執(zhí)行.

1.2 主要試劑與儀器 TritonX-100(美國Sigma公司);肝素鈉(美國Sigma公司);PBS(美國Gibco公司);丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS,上海奔流化工技術有限公司);DNA檢測試劑盒(美國Omega公司);I型膠原(COL1)、IV型膠原(COL4)、纖維連接蛋白(FN)、層黏連蛋白(LN)抗體(美國Invitrogen公司);青霉素、鏈霉素(上海薄蘊生物有限公司);Long pump蠕動泵(YX1515X-A,保定蘭格恒流泵有限公司);超級潔凈工作臺(DL-CJ-1N,北京東聯哈爾儀器制造有限公司);恒溫循環(huán)水槽(HX-105,北京長流科學儀器公司);熒光顯微鏡(美國Olympus公司).

1.3 肝臟AHS的制備及鑒定

1.3.1 肝臟AHS的制備:SD大鼠經5%水合氯醛(6 μL/g)行腹腔注射麻醉后,碘伏消毒,打開腹腔,門靜脈插管,50 mL肝素PBS沖洗去除肝內殘余血液后游離肝臟,放置無菌培養(yǎng)皿中,在無菌超凈臺上,37 ℃下調整門靜脈灌注液流速為0.9 mL/min,灌注壓調至40 mmHg,依次灌注300 mL肝素PBS,1 000 mL溶解于PBS(pH=12.0~12.5)的1% Triton X-100,500 mL乙醇與0.3%過氧乙酸溶液,2 000 mL添加青霉素和鏈霉素的PBS溶液.灌注后的肝臟去細胞支架于4 ℃的含有青霉素和鏈霉素的PBS溶液中無菌密封保存,用于大網膜包埋移植.

1.3.2 肝臟AHS鑄型制備:將ABS、丙酮、油畫顏料相混,充分攪勻.ABS濃度為5%,分別配成紅、藍、黃3種顏色.從AHS的肝總動脈插管灌入紅色填充劑,門靜脈插管灌入藍色填充劑,下腔靜脈插管灌入黃色填充劑,灌注壓力為20~45 mmHg.分別隔2、6、12 h后再補灌,補灌壓力為40~60 mmHg,直至肝表面出現細小均勻的紅、藍、黃點.灌注完畢后于4 ℃冰箱中放置24 h使填充劑凝固成型,再置于36.5%鹽酸溶液中腐蝕1周后,將標本用流水緩慢沖洗干凈.

1.3.3 HE染色觀察:正常對照組的大鼠肝臟與肝臟AHS經4%多聚甲醛固定,酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋后切片,HE染色后光鏡下觀察.

1.3.4 免疫熒光染色:石蠟切片厚度5 μm,常規(guī)脫蠟至水,并進行抗原修復,然后用PBS漂洗每5 min 3次;2% BSA在37 ℃濕盒內封閉30 min;分別加入兔抗大鼠COL1、COL4、FN、LN抗體(通常1:100稀釋,用0.01 mol/L pH值7.4的PBS稀釋),4 ℃過夜;PBS漂洗5 min,共3次;加熒光標記的二抗抗體,37 ℃濕盒避光孵育30 min;避光PBS漂洗5 min,共3次;室溫4'6-二脒基-2-苯基吲哚(4'6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)復染10 min,PBS沖洗5 min,共1次; 甘油緩沖液封片;熒光顯微鏡下觀察,胞核呈藍色熒光,COL1、COL4、FN、LN的表達為綠色熒光.

1.3.5 掃描電鏡觀察:將正常肝臟和肝臟AHS組織標本切成小于1.0 mm3大小的組織塊,0.9%氯化鈉溶液漂洗,2%戊二醛溶液固定,經PBS漂洗,用1%鋨酸固定液固定后,乙醇梯度脫水,干燥、鍍膜,置于電鏡下觀察.

1.3.6 正常肝臟與肝臟AHS組織DNA含量測定:取正常肝臟和肝臟AHS組織標本100 mg,經蛋白酶K酶解后,提取基因組DNA(按照DNA試劑盒說明操作),微量紫外分光光度計測定其濃度.

1.4 大網膜包埋移植肝臟AHS及其血管化過程觀察

用75%乙醇擦洗無菌超凈臺3遍,將密封保存的肝臟AHS切成約8 mmX8 mmX8 mm大小的立方體,用大網膜對支架進行包裹并縫合后,將移植物置入腹腔,分別于術后1、3、7、14、28 d處死大鼠,獲取大網膜包埋AHS移植物,HE染色動態(tài)觀察支架內血管新生過程.

1.5 統計學處理方法 采用SPSS18.0統計軟件分析處理.計量資料用表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗.P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 肝臟AHS的鑒定

2.1.1 肝臟AHS組織形態(tài)與結構:肝臟在灌注過程中顏色逐漸變淺,最后成為半透明狀,肉眼可見清晰完整的白色分支狀脈管結構.HE染色顯示正常肝臟組織結構清楚、肝細胞條索狀排列、細胞核清晰;在匯管區(qū)可見肝動脈、門靜脈、膽管的分支,見圖1A;掃描電鏡可見正常肝臟為大量的肝細胞整齊排列,見圖1B;肝臟AHS呈透明"蜂窩狀",僅可見細胞外基質成分,肝小葉、血管和膽管內均無細胞殘留,無細胞核結構,但肝臟特有的小葉狀結構依舊清晰可見,中央靜脈和匯管區(qū)管道也保留完整,見圖1C.肝臟AHS細胞外基質呈連續(xù)"漁網狀"結構,管腔完整、中空而無細胞殘留,見圖1D.肝臟AHS鑄型標本顯示肝動脈(紅色)、肝靜脈(藍色)和門靜脈(黃色)主干及其分支管道結構基本完整,走形清晰,見圖1E-F.

2.1.2 2組DNA含量分析:與正常肝臟比,肝臟AHS的DNA含量顯著降低(P<0.01),見表1.

2.1.3 肝臟AHS免疫熒光染色:正常對照組的肝臟COL1、COL4、FN及LN免疫熒光陽性結果呈綠色,細胞密集,DAPI熒光顯示藍色胞核清晰(陽性),見圖2A-D.肝臟AHS相應區(qū)域可見綠色熒光表達的COL1、COL4、FN及LN,DAPI熒光顯示綠色胞核清晰(陰性),見圖2E-H.

2.2 大網膜包埋移植肝臟AHS后血管化過程 實驗過程未出現大鼠死亡.大網膜包埋移植肝臟AHS術后1、3、7、14、28 d,肝臟去細胞支架移植物隨著植入時間的延長逐漸縮小,并失去其原有的形狀.HE染色顯示支架植入1 d后,支架與大網膜邊界清楚,兩者交界處有許多深染的炎癥細胞浸潤,見圖3C-D;植入3 d后炎癥細胞浸潤范圍由交界處逐漸向支架中心蔓延,交界處已有少許血竇,見圖3E-F;植入7 d后支架全部被炎癥細胞浸潤,支架內形成較多的新生血管,血管密度由移植支架邊緣區(qū)向中心區(qū)遞減,見圖3G-H;植入14 d后新生血管仍然較多,炎癥細胞密度較移植第7天時明顯增加,但支架結構整體呈現萎縮趨勢,見圖3I-J;植入28 d后移植的支架區(qū)域范圍縮小,但依然能夠看到大量新生血管與細胞,見圖3K-M.

圖1 肝臟AHS組織形態(tài)和結構圖

表1 正常肝臟與肝臟AHS的DNA含量比較(n=10,)

表1 正常肝臟與肝臟AHS的DNA含量比較(n=10,)

與正常對照組比:aP<0.01

組別 核酸(μg/μL) 260 nm吸光度值 280 nm吸光度值 260/280正常對照組 4 350.0±378.0 86.992±12.894 46.692±7.564 1.86±0.32 AHS制備組 211.6± 25.3a 3.890± 0.873 2.251±0.683 5.19±1.67

圖2 正常肝臟與肝臟AHS COL1、COL4、FN和LN免疫熒光染色圖(X200)

3 討論

肝臟是一個由多管道構成的復雜器官,制備具有營養(yǎng)物質和代謝產物輸送管道的支架材料是構建組織工程肝臟的關鍵,目前可用于肝臟組織工程的支架材料主要有天然ECM和人工合成支架等,一般為多孔隙結構支架材料,雖然可以為肝細胞提供黏附生長空間,但由于沒有完整的血流灌注通道,加上肝細胞對氧需求量旺盛,很難在此基礎上構建結構和功能完整的組織工程肝臟.AHS制備技術的出現突破了傳統支架材料的局限性,在心臟[4]、肺臟[5-6]、腎臟[7]等器官的AHS制備以及再生與重構研究領域均取得了顯著進展.本研究通過灌注法制備的大鼠AHS,肝內ECM成分及其組成的脈管管道結構如肝動脈、肝靜脈、門靜脈、膽道等均得到完整保留,HE染色顯示ECM結構連續(xù)完整,未發(fā)現細胞核殘留,DNA含量測定僅為(211.6±25.3)ng/μL,為后續(xù)通過循環(huán)灌注培養(yǎng)等方式體外構建血管化的組織工程肝臟提供了理想的支架材料.此外深入研究AHS的成分與結構,可為通過3D打印等先進技術實現肝臟支架材料的規(guī)模研發(fā)提供基礎.

支架材料的血管化是實現體外組織工程肝臟構建和移植的重要基礎,雖然可將血管內皮細胞接種于支架材料,構建血管內皮細胞化支架材料,方便人工組織的體內移植,但是血管內皮細胞在支架材料上存活率低、易凋亡,不能形成功能性血管來維持移植物中細胞的氧和營養(yǎng)供給[8].簡單的支架血管內皮細胞化很難與具備完整結構與功能血管的支架材料相比,深入研究體內移植支架材料的血管化過程,是實現體外支架材料血管化的重要研究途徑.大網膜含有豐富的毛細血管,具備較強的再生能力,易于和移植支架材料建立廣泛的側枝循環(huán),是研究支架材料血管化過程及機制的重要自體生物反應器,在脊髓[9]、骨骼[10]等組織的體內移植血管化過程中均取得了良好的效果.大網膜包埋移植AHS證明移植的支架能在7 d左右形成新生血管,移植支架在14 d左右雖然有部分降解,但形成了結構完整的新生動靜脈和微血管網,這種血管化的網狀組織結構為體外構建血管化AHS提供全新研究平臺.

大網膜包埋移植AHS血管化從動態(tài)觀察來看,是一個機體對外來支架材料的再加工過程.首先是炎癥細胞的浸潤,在對移植支架再加工的基礎上,成纖維細胞參與了移植支架的重塑,在此基礎上發(fā)生血管新生,并逐步分化成熟.血管生成(angiogenesis)和血管發(fā)生(vasculogenesis)可能參與了這一過程,在支架近網膜移植側,大網膜通過血管生成,向移植支架內新生血管、炎癥細胞和成纖維細胞通過血管進入到支架內,對支架進行結構重塑,這一過程發(fā)生在支架移植早期;在支架重塑基礎上,移植支架內逐漸出現新生血管,這些血管早期管腔閉合,內無紅細胞,并逐步發(fā)育成熟,與體內循環(huán)聯通后形成成熟的動靜脈和網狀血管.通過大網膜包埋移植AHS,大網膜脂肪細胞和微血管內皮細胞能夠合成具有強烈血管生成作用的血管內皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子[11],可快速誘導移植支架材料內血管再生,另一方面AHS雖然去除了大部分細胞成分,但仍保留了大量具有生物學活性的血管內皮生長因子等[12],能夠促進移植支架材料再細胞化過程中的血管生成,但具體機制仍值得進一步研究,并且血管化的網狀組織結構是否能夠應用于種子細胞的移植也值得深入觀察.

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(本文編輯:吳彬)

Observation on the process of vascular reconstruction in acellular hepatic scaffolds of rat after transplantation into the greater omentum

HUANG Junjie1,3, WANG Zhibin1, CHEN Na2, ZHANG Jianse1, WANG Zhiyi1, LI Ting1,DAI Kaiyu1, MEI Jin1, LOU Xinfa1.
1.Institute of Bioscaffold Transplantation and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.School of the Second Clinical Medical Sciences, Wenzhou Medical University,Wenzhou, 325035; 3.Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhejiang University, Hangzhou,310058

Objective: To observe the process of vascular reconstruction in acellular hepatic scaffolds of rat after transplantation into the greater omentum. Methods: Acellular hepatic scaffolds were harvested from adult SD rats by perfusing with TritonX-100. The scaffolds and native livers were observed through genomic DNA content analysis, scanning electron microscopy, HE stain, immunofluorescence and vascular cast. Then the acellular hepatic scaffolds were transplanted into the greater omentum in rats to investigate the vascular reconstruction. Rats were sacrificed respectively at 1, 3, 7, 14 or 28 days post-implantation and sections from the explanted grafts were analyzed by HE stain for morphology and microstructures. Results: Scanning electron microscope, HE stain and immunofluorescence showed most collagen fibers but no visible cell nuclei remained after decellularization in the scaffolds compared with the native livers. Vascular cast showed the pipeline structures of acellular hepatic scaffolds were intact and clear. Quantitative analysis of DNA content within the scaffolds showed only (211.6 ± 25.3) ng/μL. Then the blood sinus were observed on border of grafts at 3 days after transplantation into greater omentum. Afterwards the neovessels appeared, got into the internal of scaffolds, and formed microvascular network gradually in hepatic scaffolds after 14 days. The de novo microvascular network were still existed in hepatic scaffolds on 28 days. Conclusion: The implantation of greater omentum can promote the recellularization and eventually formation of vascularized reticular structures in the decellularized hepatic scaffolds.

hepar; decellular; vessel; tissue engineering; rats

R329.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.001

2017-03-11

浙江省自然科學基金資助項目(LY13H030010,LY14H180008);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(2013KYA121,2016KYA061,2016KYA135);溫州市科技局公益類項目(Y20140664);浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃項目(2014R 413024,2015R413031).

黃俊杰(1991-),男,浙江溫州人,碩士生.

樓新法,教授,Email:wzb326@126.com.