高平章,齊 肖,謝曉蘭,黃曉平,林惠彬

(1.泉州師范學院化工與材料學院，福建泉州 362000；2.惠安縣凈峰鎮(zhèn)政府，福建惠安 362100)

養(yǎng)殖水體鄰苯二甲酸二乙酯暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶的影響

高平章1,齊 肖1,謝曉蘭1,黃曉平1,林惠彬2

(1.泉州師范學院化工與材料學院，福建泉州 362000；2.惠安縣凈峰鎮(zhèn)政府，福建惠安 362100)

鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)是常用的塑化劑，也是環(huán)境廣泛存在的內(nèi)分泌干擾物。采用酶促反應動力學法及實時熒光定量PCR檢測分析養(yǎng)殖水體DEP暴露對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)殼膜幾丁質(zhì)酶的比活力和酶系列基因mRNA表達量的影響。結果顯示不同濃度組的DEP暴露對殼膜幾丁質(zhì)酶比活力的影響不具有顯著性；10 μg/L DEP暴露120 h后，對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系的LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個基因的mRNA表達量均被顯著抑制，但隨著暴露時間延長，這種顯著性差異轉化成非顯著性；而20 μg/L DEP脅迫對LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個基因的mRNA表達量沒有顯著性影響，不同濃度組的DEP暴露不同時間后對LV-CHT5、LV-CHT6兩個基因的mRNA表達量也均不具有顯著性影響。

鄰苯二甲酸二乙酯；凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)；殼膜幾丁質(zhì)酶；酶比活力；酶mRNA表達量

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦、萬氏對蝦等，原產(chǎn)于秘魯北部至墨西哥桑諾拉一帶的太平洋沿岸水域，生長于熱帶、亞熱帶、暖溫帶、溫帶海域。隨著人工養(yǎng)殖大規(guī)模增加，凡納濱對蝦已成為世界對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大品種之一。泉州地處沿海地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)比較發(fā)達，但養(yǎng)殖環(huán)境的污染特別是水質(zhì)中嚴重超標的金屬離子、有機化合物等都將引起對蝦體內(nèi)生理生化的變化，導致對蝦蛻殼困難、生長滯緩、患病率和死亡率升高等問題的出現(xiàn)，造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。

鄰苯二甲酸酯類(Phthalic Acid Esters，簡稱PAEs)又稱酞酸酯，作為塑化劑被廣泛應用于塑料、涂料、醫(yī)藥、化妝品等產(chǎn)品。研究發(fā)現(xiàn)PAEs類化合物是一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有雌激素樣活性，能對生物的正常行為及生殖、發(fā)育相關的激素代謝過程產(chǎn)生影響，其在環(huán)境中富集和隨食物鏈遷移將成為水生動物乃至人類的潛在威脅[2]。鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)是美國國家環(huán)保局(EPA)列出的6種優(yōu)先控制的PAEs有毒污染物之一，也是我國確定的3種PAEs環(huán)境優(yōu)先控制污染物之一[3]。我國水體的PAEs檢出率較高，其中福建九龍江水樣含有多種PAEs類化合物，最主要的污染物是鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP) 和DEP，含量分別達17.2 和11.7 μg/L[4]。泉州灣表層海水中各種PAEs類化合物含量均值為82.28 ng/L，DBP、DEP 和鄰苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯(DEHP)是主要成分，占總含量的71.15%[5]。水生動物對PAEs 有較強的生物富集能力，故近年來關于PAEs在水產(chǎn)品中的富集及毒性報道不少，姜琳琳[6]調(diào)查了閩南沿海地區(qū)各類水產(chǎn)品中的PAEs殘留水平，發(fā)現(xiàn)海水魚類、淡水魚類、蝦類、蟹類、貝類等水產(chǎn)品體內(nèi)均含有不同量的PAEs，殘留量為貝類>淡水魚>蝦≈蟹>海水魚。王興強等[7]研究發(fā)現(xiàn)DEP暴露會導致凡納濱對蝦血清蛋白含量、血清酚氧化酶和超氧化歧化酶活性降低，蝦免疫能力與存活率下降。但目前未見DEP等PAEs污染物對凡納濱對蝦健康發(fā)育密切相關的幾丁質(zhì)酶系的影響研究。幾丁質(zhì)酶是多基因家族，廣泛分布在蝦蟹等甲殼動物的內(nèi)臟、殼膜等組織中，與甲殼動物的蛻殼、孵化、食物消化及抗菌防御等密切相關。研究人員已克隆出7個凡納濱對蝦幾丁質(zhì)酶基因(LV-CHT1、LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT4、LV-CHT5、LV-CHT6、LV-CHT7)，并分析該基因家族各成員的功能分工，LV-CHT1、LV-CHT3和LV-CHT4基因編碼的幾丁質(zhì)酶不僅具有消化酶的功能，還與抗病防御和圍食膜蛻換有關；LV-CHT2、LV-CHT6和LV-CHT7基因編碼的幾丁質(zhì)酶與對蝦的周期性蛻殼密切相關；LV-CHT5基因編碼的幾丁質(zhì)酶與對蝦的先天免疫有關[8-9]。本實驗通過凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體的DEP暴露實驗，采用酶促反應動力學法及實時熒光定量PCR檢測對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力及酶系列基因 mRNA表達量變化，研究結果將闡明DEP對與對蝦蛻殼生長發(fā)育密切相關的殼膜幾丁質(zhì)酶系的影響機制，同時有助于了解DEP暴露對對蝦的毒理機制及為養(yǎng)殖水體塑化劑的監(jiān)控提供理論指導。

1 實驗材料與方法

1.1實驗材料與試劑

實驗材料：凡納濱對蝦(購于泉州秀土對蝦養(yǎng)殖場)，體長約(9.0±1.0) cm

實驗試劑：考馬斯亮藍G-250(國藥集團化學試劑有限公司)；鄰苯二甲酸二乙酯(國藥集團化學試劑有限公司)；牛血清白蛋白(上海藍季科技發(fā)展有限公司)；葡萄糖(天津市福晨化學試劑廠)；其他化學試劑均為西隴化工股份有限公司。使用的蒸餾水均為玻璃重蒸水。RNA提取試劑盒(OMEGA bio-tek公司)；5×PrimeScript Buffer(TaKaRa公司)；Taq酶(TaKaRa公司)；相關引物均為上海生物工程股份有限公司合成。Beta-actin基因引物：Beta-actin-F：5′-TACACCTTCACGACCACCGC-3′、Beta-actin-R：5′-TCTCCAGCGAGGAGGAGGAA-3′ ；幾丁質(zhì)酶系基因引物：

LV-CHT2-F:5′-CGGCAAGTACAGACCTGAAGACAT-3′

LV-CHT2-R:5′-AATCATAATCAGCCCAAGTGTCGTG-3′

LV-CHT3-F:5′-AACACCTCCGGCGGTTACAA-3′

LV-CHT3-R:5′-ACACCGAAGCCCAATCG-3′

LV-CHT5-F:5′-TGTCTCCGCTTTGGTGAGG-3′

LV-CHT5-R:5′-ATGGTGGTGGGCGTATTGTT-3′

LV-CHT6-F:5′-CGCTTTCATCCAACACCACC-3′

LV-CHT6-R:5′-CCTCGCGGAGTTCCTTAACC-3′

LV-CHT7-F:5′-CTTGTTCCAGATGGCACTGTATTT-3′

LV-CHT7-R:5′-TGGTTCTTGTTCAGGTGTCTTTTC-3′)

1.2實驗方法

1.2.1 凡納濱對蝦DEP暴露實驗

養(yǎng)殖場購置對蝦在實驗室馴養(yǎng)穩(wěn)定后，挑選同一生長期的對蝦在50 cm×35 cm×30 cm的養(yǎng)殖桶中進行暴露養(yǎng)殖。暴露養(yǎng)殖條件：養(yǎng)殖桶放水體20 L，對蝦50尾，水溫為(22±1) ℃，鹽度為10，pH值為7.6，DEP 暴露濃度分別為0(對照)、10、20 μg/L，每個濃度設3個平行組。實驗期間，每天持續(xù)增氧，定時換水。暴露120 h、240 h后分別取樣備用。

1.2.2 凡納濱對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶的抽提制備

凡納濱對蝦在1.2.1的暴露養(yǎng)殖條件下暴露一定時間后，每個濃度組取6條蝦，用蒸餾水將蝦體沖洗干凈，用吸水紙吸干蝦體表面水分后，分別取殼膜，研磨均勻，加入預冷的Tris-HCl(pH7.5)緩沖液1 mL，4 ℃下抽提1 h后，12 000 r/min冷凍離心20 min，收集上清液得幾丁質(zhì)酶粗酶液，冷凍備用。

1.2.3 酶蛋白濃度、酶活力及酶比活力測定

按考馬斯亮藍法[10]，采用試劑空白，用UV-1800紫外分光光度計測定不同濃度標準蛋白(牛血清白蛋白)溶液經(jīng)染色反應后在595 nm下的吸光度值(OD值)，以標準蛋白含量(μg)為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸得標準曲線方程為：Y=4.6×10-3×X,R2= 0.992 3。根據(jù)標準曲線測定方法和標準曲線方程測定酶蛋白溶液。

[11]，以N-乙酰氨基葡萄糖作標準物，采用DNS法測定還原糖濃度，以N-乙酰氨基葡萄糖含量(mg)為橫坐標，500 nm處的吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，回歸標準曲線得方程Y=1.25X，R2= 0.998。根據(jù)參考文獻[12]，往0.5 mL 0.1 mol/L pH 6.0磷酸緩沖液中加入等體積的1% 膠體幾丁質(zhì)溶液，混勻后在45 ℃下預熱10 min，加入0.3 mL幾丁質(zhì)酶液和0.2 mL蒸餾水，反應1 h后，沸水浴20 min終止反應，并迅速冷卻后加入1.5 mL DNS試劑，再沸水浴20 min后，冷卻至室溫再用蒸餾水定容至25 mL，搖勻后離心取上清，試劑空白，在500 nm下測吸光度，根據(jù)還原糖標準曲線換算酶解產(chǎn)物N-乙酰氨基葡萄糖含量。以N-乙酰氨基葡萄糖的生成速度來衡量幾丁質(zhì)酶活性大小。

酶活力單位(u)的定義：在溫度45 ℃、pH 6.0的測活條件下，每小時水解膠體幾丁質(zhì)生成1 μg N-乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量為一個活力單位；比活力定義為每毫克酶蛋白具有的酶活力單位數(shù)。

1.2.4 總RNA提取、純化與反轉錄

快速取殼膜的一小部分(大約100 mg)加入1 mL RNA-Slove regent和3顆鋼珠，用勻漿機勻漿三分鐘，4 ℃放置30 min，加入200 μL氯仿，混勻，在冰上放置10 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液加入250 μL無水乙醇混勻，用HiBind RNA Spin柱子過濾，分別用300 mL與400 mL Wash Buffer I、兩次500 mL Wash Buffer II各沖洗柱子，并在10 000 r/min離心1 min去除濾液，在14 000 r/min離心2 min甩干，用40 μL DEPC-水將mRNA溶解轉移至新的離心管中，即得到總RNA。用微量核酸蛋白分析儀測定RNA濃度。

RT-PCR反應體系：2 μL的5×PrimeScript Buffer(含有PrimeScriptRTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反應Buffer)，500 ng RNA，最后用DEPC-水補足至10 μL，反應條件為：37 ℃反轉錄15 min，85 ℃反轉錄酶失活5 s。在該反轉錄體系及條件下反轉錄得cDNA。

1.2.5 幾丁質(zhì)酶的實時熒光定量PCR及mRNA相對表達量測定

在LightCycle 480 II實時熒光定量PCR儀進行擴增。反應體系為：Taq酶(含有TaKaRa Ex Taq HS DNA Polymerase,dNTP mixture,Mg2+,Tli RNaseH和SYBR Green I.)10 μL，前后引物各0.8 μL(0.4 μmol/L)，DEPC-水6.4 μL，cDNA模板2 μL，反應條件為95 ℃預變性30 s，共1個循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，共40個循環(huán)。

1.2.6 DEP暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系基因的mRNA表達量影響測定

按1.2.1暴露方法進行暴露實驗，暴露一定時間后，每個濃度組取6條蝦(同1.2.2的對蝦樣品)，用蒸餾水將蝦體沖洗干凈，用吸水紙吸干蝦體表面水分后，快速取蝦殼的一小部分，按1.2.4方法提取mRNA并反轉錄為cDNA，按1.2.5方法分別對凡納濱對蝦的內(nèi)參基因Beta-actin和幾丁質(zhì)酶系基因LV-CHT1、LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT4、LV-CHT5、LV-CHT6、LV-CHT7進行實時熒光定量PCR，PCR反應結束，記錄其復制次數(shù)。以Beta-actin為內(nèi)參，根據(jù)文獻[13]公式CT=(CT,Target-CT,Actin)Time x-(CT,Target-CT,Actin)Time 0，用濃度代替其中的時間即可計算在不同濃度下的CT值，再計算即可得出各基因相對擴增倍數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理和分析

采用 SPSS 20.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因子方差(ANOVA)和Duncan統(tǒng)計分析.得到平均值和標準差 (mean±SD)，當P<0.05時，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1DEP暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力影響

以水體終濃度分別為0、10、20 μg/L的DEP進行凡納濱對蝦暴露養(yǎng)殖實驗，分別在暴露120 h、240 h后取樣，分析測定殼膜幾丁質(zhì)酶的比活力，由圖 1可見，與非暴露組的對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力比較，養(yǎng)殖水體DEP暴露120 h后，暴露組的殼膜幾丁質(zhì)酶比活力隨著DEP暴露濃度增大出現(xiàn)先下降后回升的趨勢，10 μg/L的DEP使對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力下降了32.4%，但20 μg/L的DEP暴露下，對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力基本沒有變化，統(tǒng)計分析各濃度組幾丁質(zhì)酶比活力差異不具有顯著性。但隨著DEP暴露時間的延長，當暴露240 h后，DEP的脅迫激活了對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力，10、20 μg/L的DEP 分別使幾丁質(zhì)酶比活力上升了138.7%、71.0%，但這種激活作用也沒有顯著性。

圖1 DEP暴露不同時間后凡納濱對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力比較.

2.2DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系基因的mRNA表達量影響

通過凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體的DEP暴露實驗，采用實時熒光定量PCR分別檢測對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系基因LV-CHT1、LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT4、LV-CHT5、LV-CHT6、LV-CHT7的 mRNA表達量變化，結果表明，DEP暴露前后，凡納濱對蝦殼膜部位均檢測不到LV-CHT1和LV-CHT4基因的表達；但能檢測到LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT5、LV-CHT6和LV-CHT7基因的表達，且在不同濃度的DEP暴露不同時間后，各基因的mRNA表達量均發(fā)生不同程度變化。

2.2.1 DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達量影響

凡納濱對蝦分別在含不同濃度DEP的養(yǎng)殖水體中暴露不同時間后取樣，分析測定殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達量。圖 2結果顯示，與對照組相比較，凡納濱對蝦在含不同濃度DEP的水體中脅迫養(yǎng)殖120 h與240 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達量均呈現(xiàn)先抑后揚趨勢。與其它濃度組相比，10 μg/L的DEP脅迫120 h后讓殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達量出現(xiàn)顯著性下降，而20 μg/L的DEP脅迫120 h則使mRNA表達量上升，這種上升趨勢與空白對照組比較不具有顯著性，但與10 μg/L濃度組相比具有顯著性。DEP暴露240 h后，10 μg/L的DEP使殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達量明顯下降，而20 μg/L的DEP使mRNA表達量大幅上升，但統(tǒng)計分析顯示各濃度組間不存在顯著性差異。

圖2 DEP暴露對凡納濱對蝦幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達量影響.

2.2.2 DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT3基因的mRNA表達量影響

由圖3可見，與對照組相比較，凡納濱對蝦在含不同濃度DEP的水體中脅迫養(yǎng)殖120 h與240 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT3基因的mRNA表達均被抑制。與其它濃度組相比，對蝦在10 μg/L的DEP水體中脅迫120 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT3基因的mRNA表達量出現(xiàn)顯著性大幅度下降，20 μg/L的DEP脅迫120 h也使mRNA表達量下降，這種下降趨勢與空白對照組比較不具有顯著性，但與10 μg/L濃度組相比具有顯著性。DEP暴露240 h后，與對照組相比，不同濃度暴露組的殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT3基因的mRNA表達受抑制程度相當，且抑制趨勢均不具有顯著性。

圖3 DEP暴露對凡納濱對蝦幾丁質(zhì)酶LV-CHT3基因的mRNA表達量影響

2.2.3 DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT5基因的mRNA表達量影響

由圖4可知，與對照組相比較，凡納濱對蝦分別在含10、20 μg/L的DEP水體中脅迫養(yǎng)殖120 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT5基因的mRNA表達均被小幅抑制，且抑制程度相當，統(tǒng)計分析表明不同濃度組間的mRNA表達量不具有顯著性差異。而凡納濱對蝦分別在含10、20 μg/L的DEP水體中脅迫養(yǎng)殖240 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT5基因的mRNA表達均被小幅激活，且激活程度相當，統(tǒng)計分析表明不同濃度組間的mRNA表達量同樣不具有顯著性差異。

圖4 DEP暴露對凡納濱對蝦幾丁質(zhì)酶LV-CHT5基因的mRNA表達量影響.

2.2.4 DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT6基因的mRNA表達量影響

圖5結果顯示，與對照組相比較，凡納濱對蝦在含不同濃度DEP的水體中脅迫養(yǎng)殖120 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT6基因的mRNA表達呈現(xiàn)先激活后抑制趨勢。與對照組比較，10 μg/L的DEP脅迫120 h后使殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT6基因的mRNA表達量上升了72.4%；而20 μg/L的DEP使mRNA表達量下降了25.8%，進一步統(tǒng)計分析比較不同濃度組間的表達量差異，結果表明不具有顯著性。當DEP暴露延長至240 h后，與對照組比較，不同濃度暴露組均因DEP的脅迫使殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT6基因的mRNA表達被激活，激活程度隨著DEP濃度增大而增大，但激活趨勢不具有顯著性。

圖5 DEP暴露對凡納濱對蝦幾丁質(zhì)酶LV-CHT6基因的mRNA表達量影響.

2.2.5 DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT7基因的mRNA表達量影響

由圖6可見，與對照組相比較，凡納濱對蝦在含10 μg/L 的DEP水體中脅迫養(yǎng)殖120 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT7基因的mRNA表達被顯著性抑制，表達量下降了57.0%。而20 μg/L的DEP脅迫120 h后也使殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT7基因的mRNA表達量下降了14.0%，但這種下降趨勢與其它濃度組相比不具有顯著性。凡納濱對蝦在含不同濃度DEP中暴露240 h后，LV-CHT7基因的mRNA表達量也均受到不同程度抑制，10 μg/L的DEP對LV-CHT7基因的mRNA表達抑制程度比20 μg/L的DEP抑制程度大，但不同濃度的DEP脅迫對LV-CHT7基因的mRNA表達量影響均不具有顯著性。

圖6 DEP暴露對凡納濱對蝦幾丁質(zhì)酶LV-CHT7基因的mRNA表達量影響.

3 討論

DEP是一種塑化劑，是生產(chǎn)聚氯乙烯的原料，伴隨著我國聚氯乙烯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，DEP造成的水質(zhì)污染日趨嚴重。該物質(zhì)已成為水環(huán)境中檢出最多的有機污染物之一[14]。王興強等[7]對凡納濱對蝦進行DEP暴露實驗，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過90 d的暴露實驗，由于蝦一直處于應激狀態(tài)，不斷消耗對蝦體內(nèi)免疫因子，最終導致血清蛋白、血清酚氧化酶和超氧化歧化酶等免疫因子含量及活性下降，對蝦免疫系統(tǒng)崩潰，導致對蝦生理機能失調(diào)，影響對蝦生長。幾丁質(zhì)酶在對蝦生長發(fā)育過程中發(fā)揮多種生化功能，具有促進幾丁質(zhì)類食物消化吸收、調(diào)控圍食膜和外殼周期性蛻換及抗菌防御等作用[9]。本研究考察DEP暴露120 h和240 h對凡納濱對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶的影響，結果表明不同濃度組的DEP暴露對殼膜幾丁質(zhì)酶比活力的影響不具有顯著性；但比較同一濃度組暴露不同時間的殼膜幾丁質(zhì)酶比活力，結果顯示非暴露組的殼膜幾丁質(zhì)酶比活力基本不變，而暴露組隨著暴露時間的延長酶比活力明顯提高，說明DEP脅迫對殼膜幾丁質(zhì)酶比活力有促進作用，對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶對養(yǎng)殖水體DEP的存在會表現(xiàn)出應激反應。幾丁質(zhì)酶活力變化趨勢與王興強等[7]的DEP暴露實驗后的酚氧化酶、超氧化歧化酶的變化趨勢相反，這可能與幾丁質(zhì)酶具有多種生理功能作用有關，也可能與暴露時間長短有關。

為了進一步了解PAEs 對凡納濱對蝦的免疫毒性和發(fā)育毒性，故本研究進一步考察了DEP暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系基因的影響。結果顯示10 μg/L DEP暴露120 h后，對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系的LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個基因的mRNA表達量均是被顯著抑制，但隨著暴露時間延長到240 h，這種顯著性差異轉化成非顯著性；20 μg/L DEP脅迫對LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個基因的mRNA表達量沒有顯著性影響，不同濃度組的DEP脅迫對LV-CHT5、LV-CHT6等兩個基因的mRNA表達量影響也沒有顯著性。進一步分析同濃度組不同暴露時間點各個幾丁質(zhì)酶基因的mRNA表達量差異，發(fā)現(xiàn)在整個實驗考察過程中，對照組的各個幾丁質(zhì)酶基因的mRNA表達量均比較穩(wěn)定，而DEP暴露組中，除了LV-CHT7基因的mRNA表達量基本不受暴露時間影響，LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT5和LV-CHT6基因的mRNA表達量均會受暴露時間影響。DEP暴露組的殼膜LV-CHT2及LV-CHT5基因的mRNA表達量均隨DEP脅迫時間延長而上調(diào)；10 μg/L DEP暴露會隨脅迫時間延長使殼膜LV-CHT3基因的mRNA表達量提高，但在20 μg/L DEP暴露過程中比較穩(wěn)定；殼膜LV-CHT6基因在10 μg/L DEP暴露下，會隨脅迫時間延長mRNA表達量被輕微回調(diào)，但20 μg/L DEP則隨著暴露時間延長mRNA表達量被大幅度提高。可見，DEP暴露對對蝦殼膜各個幾丁質(zhì)酶基因的mRNA表達具有影響，時間延長基本上導致LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT5和LV-CHT6基因的mRNA表達量上調(diào)。Zhao等[15]研究也表明凡納濱對蝦感染白斑病毒后，體內(nèi)幾丁質(zhì)酶基因表達上調(diào)。Zhao等和本實驗室DEP脅迫研究結果說明，在外界脅迫影響和體內(nèi)病毒感染情況下，對蝦產(chǎn)生的免疫反應會使體內(nèi)幾丁質(zhì)酶基因表達上調(diào)，這種基因表達影響將導致酶活力受影響，從而導致對蝦的蛻殼生長發(fā)育受影響。

進一步整體分析DEP暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶活力及基因表達影響，發(fā)現(xiàn)DEP暴露對酶活力及基因表達的影響趨勢基本一致，短時間低濃度DEP脅迫對對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶mRNA的表達量和比活力具有抑制現(xiàn)象，這應該是對蝦對外界DEP脅迫產(chǎn)生的應激反應。而隨著脅迫時間延長，殼膜幾丁質(zhì)酶的mRNA表達量和酶比活力均出現(xiàn)上升趨勢，這種趨勢與王興強等[7]研究發(fā)現(xiàn)的免疫因子活力受DEP長期脅迫后呈現(xiàn)的下降趨勢相反，可見，在我們實驗考察的時間范圍內(nèi)，DEP脅迫沒有引起對蝦的免疫系統(tǒng)崩潰，反而是啟動應激免疫調(diào)控系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫應答反應，但這種免疫應答反應隨著暴露時間進一步延長是否將會再發(fā)生改變，這還有待今后進一步研究。

參考文獻：

[1]樸順金,謝曉蘭,黃乾生,等.不同養(yǎng)殖期的凡納濱對蝦外殼膜NAGase基本性質(zhì)比較[J].臺灣海峽,2006,25(3):348-352.

[2]葛 健,林 芳,韓寶瑜.鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)在羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)體內(nèi)代謝動力學和殘留研究[J].海洋與湖沼,2011,42(1):137-141.

[3]Wang J L,Ye Y C,Wu W Z.Comparison of di-n-methylphthalate biodegradation by free and immobilized microbial cells [J].Biomedical and Environmental Sciences,2003,16(2):126-132.

[4]陸 洋,袁東星,鄧永智.九龍江水源水及其出廠水鄰苯二甲酸酯污染調(diào)查[J].環(huán)境與健康雜志,2007,24(9):730-735.

[5]莊婉娥,姚文松,汪廈霞,等.泉州灣海水及沉積物中PAEs的分布及化學組成[J].環(huán)境與健康雜志,2011,28(10):898-902.

[6]姜琳琳.閩南地區(qū)水產(chǎn)品中鄰苯二甲酸酯類(PAEs)的分布特征及風險評價[J].漁業(yè)科學進展,2015,36(4):139-144.

[7]王興強,曹 梅,閻斌倫,等.塑料增塑劑對凡納濱對蝦存活、生長和免疫的影響[J].生態(tài)毒理學報,2010,5(1):69-75.

[8]杜 娟,謝曉蘭,石 艷,等.患紅體病的凡納濱對蝦外殼膜NAGase基本性質(zhì)的改變[J].應用與環(huán)境生物學報,2008,14(2):207-210.

[9]Huang Q S,Yan J H,Tang J Y,et al.Cloning and tissue expressions of seven chitinase family genes inLitopenaeusvannamei[J].Fish and Shellfish Immunology,2010,29(1):75-81.

[10]謝曉蘭,曾 煒,高平章,等.黃粉蟲幾丁質(zhì)酶的純化及性質(zhì)[J].泉州師范學院學報,2012,30(4):56-61.

[11]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data Using Real-Time Quantitative PCR and the method [J].Methods,2002,25(4):402-408.

[12]李海濤,黃歲樑.水環(huán)境中鄰苯二甲酸酯的遷移轉化研究[J].環(huán)境污染與防治,2005,28(11):127-135.

[13]Zhao Z Y,Yin Z X,Weng S P,et al.Profiling of differentially expressed genes in hepatopancreas of white spot syndrome virus-resistant shrimp (Litopenaeusvannamei) by suppression subtractive hybridization [J].Fish and Shellfish Immunology,2007,22(5):520-534.

EffectsofdiethylphthalateexposureonchitinasefromepidermisofLitopenaeusvannamei

GAO Ping-zhang1,QI Xiao1,XIE Xiao-lan1,HUANG Xiao-ping1,LIN Hui-bin2

(1.CollegeofChemicalEngineeringandMaterials,QuanzhouNormalUniversity,QuanzhouFujian362000,China; 2.JingfengTownGovernment,HuianCounty,Huian362100Fujian,China)

Diethyl phthalate (DEP) is one of the commonly used plasticizers.It is also a widespread environmental endocrine disruptors.In this paper,the effects of DEP exposure on the activity and mRNA expressions ofLitopenaeusvannameiepidermal chitinase were investigated using enzymatic reaction dynamic method and the real-time fluorescent quantitative PCR.The results showed that DEP exposure have no significant influence on the activity of epidermal chitinase.The mRNA expressions of epidermal chitinase gene such as LV-CHT2,LV-CHT3,LV-CHT7 were significantly inhibited after exposure to 10 μg/L DEP for 120 hrs.However,data significance disappeared when the exposures were continued.The 20 μg/L DEP had no significant effects on the mRNA expression of LV-CHT2,LV-CHT3 and LV-CHT7.Similar effects was observed for the mRNA expressions of LV-CHT5 and LV-CHT6 after DEP exposure.

diethyl phthalate;Litopenaeusvannamei;epidermal chitinase;enzymatic activity;mRNA expression

2017-03-28；

2017-09-25

國家自然科學青年基金項目(31302190)；福建省自然科學基金項目(2012J01047)；泉州市優(yōu)秀人才培養(yǎng)專項(16D04)

高平章(1980- )，男，博士，副教授，研究方向為藥理及毒理效應研究。E-mail:gaopingzhang@126.com

謝曉蘭。E-mail:xxl_qztc@163.com

X524

A

1000-6907-(2017)06-0101-07