平 措 ， 許思遙 ，徐志文 ，朱 玲

（1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2．西藏林芝市巴宜區(qū)農(nóng)牧局獸防站， 西藏 林芝 860100）

腹瀉仔豬中豬圓環(huán)病毒2型的檢測及生物信息學(xué)分析

平 措1，2， 許思遙1，徐志文1，朱 玲1

（1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2．西藏林芝市巴宜區(qū)農(nóng)牧局獸防站， 西藏 林芝 860100）

為研究仔豬腹瀉中豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的生物信息，參考GenBank發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)全基因組序列，設(shè)計(jì)并合成一對特異性引物，從四川地區(qū)豬場送檢的腹瀉仔豬病料中擴(kuò)增PCV2全長基因序列，回收PCR產(chǎn)物。將其插入PMD19-T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后篩選、提取陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。將測序結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)外的不同分離株進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，分離株基因組全長為1 767 bp，分離的三株基因組與GenBank上已發(fā)表的PCV2分離株之間的核苷酸同源性分別為1#94．7%～89．6%、2#94．7%～89．3%、3#96．4%～86．8%，氨基酸序列同源性為1#97．9%～95．7%、2#97．1%～95．5%、3#98．4%～94．8%，說明四川地區(qū)腹瀉仔豬病料中PCV2的變異相對保守。

豬圓環(huán)病毒2型；PCR檢測；生物信息學(xué)分析

圓環(huán)豬病毒（porcine circovirus，PCV）在1974年首次由德國學(xué)者Tischer在PK-15細(xì)胞培養(yǎng)污染物中分離得到[1]，在分類學(xué)上屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，它是一種無囊膜的單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒，為已知的最小的動物病毒之一。病毒粒子直徑14～17 nm，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜，含有共價閉合的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA，基因組大小約為1.76 kb。PCV對外界理化因子的抵抗力相當(dāng)強(qiáng)，即便在pH3的酸性環(huán)境及72 ℃的高溫環(huán)境中也能存活一段時間，氯仿作用不失活，無血凝活性[2，3]。致病性和核酸序列的不同，分為1型(PCV1)和2型(PCV2)[4]，近期有報(bào)道發(fā)現(xiàn)3型(PCV3)[5]。PCV1基因組長1 759 bp，PCV2基因組長1 767～1 768 bp，PCV3基 因 組長2 000 bp。研究發(fā)現(xiàn)，PCV2含有11個ORFs，有兩個主要即ORF1和ORF2[7]。ORF1編碼復(fù)制酶相關(guān)的rep蛋白，該蛋白氨基酸序列相當(dāng)保守，是與PCV1產(chǎn)生抗原交叉性的主要部位；ORF2編碼病毒的核衣殼蛋白[8，9]。PCV2和PCV1、PCV3間氨基酸序列同源性較低，差異較為明顯[10]。豬對PCV2具有較強(qiáng)的易感性，感染豬可自鼻液、糞便等代謝廢物中排出病毒，經(jīng)口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬。

PCV2為致病性的病毒[11]，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)、仔豬先天性震顫（CT）、增生性壞死性肺炎（PNP）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）、繁殖障礙、腸炎等多種疾病的病原[12]。腹瀉是豬的一種常見病，發(fā)病率高，常發(fā)病于冬春、夏秋的交替期。近年仔豬冬季腹瀉情況多發(fā)，并且仔豬腹瀉表現(xiàn)為發(fā)病率高，致死率高的整體情況。近年全國范圍內(nèi)仔豬腹瀉發(fā)病率高、死亡率高，造成較大經(jīng)濟(jì)損失，已成為影響我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大障礙。豬腹瀉中仔豬腹瀉占總量的比重較大，多發(fā)于1～3月齡的斷奶仔豬，腹瀉引起的死亡占仔豬死亡總數(shù)的40%。低日齡仔豬感染PCV2后繼發(fā)感染其他病原報(bào)道時有發(fā)生，尤其以腹瀉為典型臨床特征的病例更是常有報(bào)道，血清學(xué)調(diào)查表明，PCV在世界范圍內(nèi)流行[13]。圓環(huán)病毒（PCV）被列為世界公認(rèn)的當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的頭號疫病[14，15]，已引起世界各國的廣泛關(guān)注。這次實(shí)驗(yàn)通過PCR方法在仔豬腹瀉病料中克隆PCV2全基因，并與GenBank中的參考序列比較分析，有助于了解不同地區(qū)的PCV2毒株序列的同源性差異，為仔豬腹瀉病料中PCV2的分子生物學(xué)及分子流行病學(xué)調(diào)查提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)病料

病料的采集：病料主要來源2016年10月至2017年6月四川地區(qū)某豬場送檢腹瀉仔豬組織樣品，采集患腹瀉的死豬的病料組織樣品進(jìn)行檢測。

PCV2陽性病料由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心保存并提供。

病料的處理：采取剖解豬的腹股溝淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、肝臟等組織作為檢測PCV2的材料，加入少許PBS溶液，-70 ℃反復(fù)凍融3次，在研缽中經(jīng)行無菌研磨，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

表1 主要儀器

表2 DNA提取產(chǎn)物的PCR反應(yīng)體系

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DL2000 Marker、Marker III 購TIANGEN生物制品公司；2xTaq PCR master Mix 購 自 TaKa-Ra；氯仿，異丙醇，75%乙醇，TE；10 mg/mL EB JC存液：以l0 mg/mL濃度將EB溶于雙蒸水中，劇烈攪拌，完全溶解后，室溫下避光保存。

實(shí)驗(yàn)材料由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心提供。

1.1.3 主要儀器

主要儀器見表1。

1.1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank發(fā)表的PCV2全基因序列，通過Primer Premier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)出一對特異性引物。其序列如下：

1.2 方法

1.2.1 病料病毒DNA的提取方法

1）取病料研磨后取上清液離心（12 000 r/min×5 min） 后 去 400 μL上清液，加500 μL飽和酚后混勻靜置5 min。

圖1 PCV2基因的PCR電泳產(chǎn)物

2）再次離心（12 000 r/min×5min）后取上清液加入飽和酚、氯仿各200 μL， 混 勻 靜 置 5 min后 離 心（12 000 r/min×5 min）

3）重復(fù)步驟2）。

4）再取上清液加入氯仿400 uL，混勻靜置5 min后離心（12 000 r/min×5 min）。

5）離心后取上清液加入2倍體積異丙醇輕搖2 min后靜置放入冰箱（-20 ℃）10 min，

6）取出離心（12 000 r/min×5 min）。離心后棄上清液，用75%的冰乙醇1 mL清洗沉淀及管壁后離心（12 000 r/min×5 min）。

7）離心后棄上清液，室溫干燥沉淀。最后加入30～50 μL TE溶解干燥沉淀，放入-20 ℃保存。

1.2.2 DNA提取產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增

采用10 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為（見表2）：

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性：95 ℃ 4 min、變性 ：95 ℃ 30 s、退火：52.8 ℃ 30 s、延伸：72 ℃ 30 s，反應(yīng)35個循環(huán)、終延伸：72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

表3 目的片段PCR反應(yīng)體系

表4 國內(nèi)外某些PCV2的登錄號及來源

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳將PCR產(chǎn)物加入制作好的瓊脂糖凝膠孔中，采用DL 2000 marker，進(jìn)行電泳。

1.2.4 凝膠成像及對照

利用凝膠成像儀成像，并對結(jié)果進(jìn)行陰陽性對照。在電泳緩沖液中，5 V/cm電壓，電泳30 min。最終獲得長度約為1 767 bp的片段，與預(yù)期擴(kuò)增的片段長度相符。

1.2.3 目的DNA片段的回收與連接

按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行，取30～50μL的回收產(chǎn)物置-20 ℃?zhèn)浯妗?/p>

將回收好的目的片段與PMD19-T simple Vector 連接，反應(yīng)體系為（見表3）。

1.2.4 DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備

無菌條件下用挑取DH5α大腸桿菌多個菌落，接種于10 mL的LB肉湯中，37 ℃水浴振蕩培養(yǎng)過夜，次日取1 mL DH5α菌液接種于20 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃水浴振蕩培養(yǎng)至OD 0.6左右，將菌液轉(zhuǎn)移至15 mL離心 管， 冰 浴 10 min ，3 000 r/min ，離心5 min ，棄上清，將菌體懸浮在10 mL 0.1 mol/L CaCl2中，冰浴10 min，3 000 r/min，4 ℃ 離 心 5 min ，棄上清，將菌體重懸于10 mL 0.1 mol/L CaCl2，冰浴中放置12 h。

1.2.5 連接物的轉(zhuǎn)化、陽性克隆菌落挑選和鑒定

取100 μL上述制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入10 μL連接產(chǎn)物并攪拌混勻，先冰浴30 min，然后42 ℃水浴2 min ，再冰浴5 min，加入0.9 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃水浴振蕩1 h，將200 μL轉(zhuǎn)化菌涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG 瓊脂固體培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落生長情況，篩選出重組轉(zhuǎn)化體。再將其接種于10 mL LB/Amp/X-Gal/IPTG液體培養(yǎng)基中，于37 ℃以220 r／min搖振培養(yǎng)過夜。用菌液PCR挑選出陽性克隆菌落。通過電泳檢測，克隆的陽性重組質(zhì)粒均帶有相應(yīng)的目的片段。檢測為陽性，說明轉(zhuǎn)化成功。

取菌落PCR鑒定為陽性的菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。

2 結(jié)果

2.1 PCV2基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果

利用DNA Star，NCBI等軟件拼接、比對，確定測序結(jié)果為PCV2。將所得序列與NCIBI數(shù)據(jù)庫中收錄的國內(nèi)外部分PCV2基因序列（表4）進(jìn)行核苷酸的同源性比較。

將本次實(shí)驗(yàn)獲得的3株P(guān)CV2基因序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫里的十株P(guān)CV2基因和完整的PCV2基因序列，運(yùn)用DNA Star軟件進(jìn)行同源性分析。

1號PCV2基因組與國外四株P(guān)CV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為96.2%、97.7%、95.7%和 97.9%， 同源性相對較高且相差2.2%。在與國內(nèi)6株P(guān)CV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755） 和 廣 東 株（JX294717）的同源性在97.9%-96.1%之間，1號PCV2毒株與浙江株（AY188355）及山東株（AY536755）的同源性最高，達(dá)到97.9%。同源性最低的是北京株（AF381175），為96.1%。

2號PCV2基因組與國外四株P(guān)CV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為96.1%、97.0%、95.5%和 97.1%， 同源性相對較高且相差1.6%。在與國內(nèi)6株P(guān)CV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755） 和 廣 東 株（JX294717）的同源性在97.1%-96.0%之間，1號PCV2毒株與浙江株（AY188355）及山東株（AY536755）的同源性最高，達(dá)到97.9%。同源性最低的是北京株（AF381175），為96.0%。

圖2 PCV2基因核苷酸序列同源性比較

圖3 PCV2基因推導(dǎo)氨基酸同源性比較

圖4 PCV2推導(dǎo)氨基酸的遺傳進(jìn)化樹（最大似然法）

圖5 PCV2推導(dǎo)氨基酸的遺傳進(jìn)化樹（相似臨界法）

3號PCV2基因組與國外四株P(guān)CV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為95.1%、96.0%、94.8%和 96.3%， 同源性相對較高且相差1.5%。在與國內(nèi)6株P(guān)CV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755）和廣東株（JX294717）的同源性在98.4%～95.0%之間，1號PCV2毒株與南京株（AY556473）的同源性最高，達(dá)到98.4%。同源性最低的是北京株（AF381175），為95.0%。

1、2、3號的相互同源性比較相近，在97.7%～96.3%之間。

通過以上核苷酸同源性比較，可以看出，三株與國內(nèi)基因組進(jìn)行同源性比較與北京株（AF381175）同源性最低。浙江株（AY188355）（AY651850）的同源性比較相同，可以看出PCV2在進(jìn)化上比較保守的這一特性。

2.2 PCV2基因推導(dǎo)氨基酸的生物信息學(xué)分析結(jié)果

PCV2均含有11個ORF區(qū)域，有2個主要即ORF1和ORF2。ORF1編碼復(fù)制酶相關(guān)的rep蛋白，ORF2編碼病毒的核衣殼蛋白。本試驗(yàn)篩選PCV2基因的ORF1，獲得的核苷酸序列利用MEGA軟件推導(dǎo)出氨基酸序列，同時推導(dǎo)出上述NCBI數(shù)據(jù)庫里的十株P(guān)CV2基因的氨基酸序列，并利用DNA-start軟件進(jìn)行同源性分析，得出以下結(jié)果。

1號PCV2基因組與國外四株P(guān)CV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為91.3%、94.6%、89.6%和 94.7%， 同源性相對較高且相差5.1%。在與國內(nèi)6株P(guān)CV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755） 和 廣 東 株（JX294717）的同源性在94.7%-91.9%之間，1號PCV2毒株與浙江株（AY188355）及山東株（AY536755）的同源性最高，達(dá)到94.7%。同源性最低的是南京株（AY556473），為91.9%。

2號PCV2基因組與國外四株P(guān)CV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為90.0%、92.0%、89.3%和 92.2%， 同源性相對較高且相差2.9%。在與國內(nèi)6株P(guān)CV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、北京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755）和廣東株（JX294717）的同源性在94.7%～90.0%之間，1號PCV2毒株與南京株（AY556473）的同源性最高，達(dá)到94.7%。同源性最低的是北京株（AF381175），為90.0%。

3號PCV2基因組與國外四株P(guān)CV基因組加拿大株（AF027217）、美國株（AY391927）、法國株（HM623764）和丹麥株（FJ935780）同源性分別為87.1%、89.8%、86.8%和 90.3%， 同源性相對較高且相差3.5%。在與國內(nèi)6株P(guān)CV基因組浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 東 株（AY536755）和廣東株（JX294717）的同源性在96.4%～87.1%之間，1號PCV2毒株與南京株（AY556473）、的同源性最高，達(dá)到94.7%。同源性最低的是北京株（AF381175），為91.9%。

1、2、3號的相互同源性比較相近，在93.7%～90.3%之間。

通過以上核苷酸同源性比較，可以看出，三株推導(dǎo)出的氨基酸序列與南京株（AY556473）的同源性最高，與國外株法國株（HM623764）同源性最低，且都在90%以下。

2.3 PCV2基因推導(dǎo)氨基酸遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果

將有核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列利用MEGA軟件分析，采用Poisson模型分別使用最大似然法和相似臨界法重復(fù)1 000次進(jìn)行建樹分析，獲得下列進(jìn)化樹。

在繪制的兩幅進(jìn)化樹中可以看出，PCV2分成3個獨(dú)立的大群，1號PCV2基因組與2號、3號PCV2基因組不在一個大群，2號、3號PCV2基因組在一個大群。2號PCV2基因組和3號PCV2基因組在同一大群的不同亞組。并且2種不同的方法進(jìn)行分析得出的分組情況一致，相互印證，說明進(jìn)化樹穩(wěn)定。

3 討論

目前通過已知病毒株的基因序列來擴(kuò)增獲得流行株對應(yīng)基因序列，并使用軟件分析核苷酸組成的DNA序列和蛋白質(zhì)組成的氨基酸序列的同源性差異，來判斷目的基因的變異情況己經(jīng)成為病毒基礎(chǔ)研究中重要且常用的手段和方法[8]。通過對流行株序列相關(guān)分析，監(jiān)測流行株的變異情況及趨勢，提前做出預(yù)防措施對于生豬養(yǎng)殖有重要意義。

仔豬腹瀉情況多發(fā)，可由多種原因引起，通過對仔豬腹瀉病料中PCV2的檢測及生物信息學(xué)分析，可以看出PCV2在進(jìn)化上相對比較保守，但隨著流行時間的增加也逐漸發(fā)生了變異，這些變異是否能導(dǎo)致毒力發(fā)生變化尚不明確。至今為止，雖然PCV2的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是PCV2病毒的來源和致病機(jī)制尚不十分明確。并且當(dāng)前不同國家和不同臨床病癥下分離到的PCV2毒株間的致病性有何差異也暫不清楚，對PCV2病毒的變異也處在探索階段。因此，對PCV2毒株基因組序列差異開展研究，有助于闡明疫病暴發(fā)的真正原因，從而控制疫病，減少損失。

本研究克隆的3株P(guān)CV2毒株，基因組大小均為1 767 bp，與本次實(shí)驗(yàn)分析的其他PCV2毒株全基因組核苷酸序列同源性分型分別在在1#94.7%～89.6%、2#94.7%～89.3%、3#96.4%～86.8%之間，氨基酸序列同源性在1#97.9%～95.7%、2#97.1%～95.5%、3#98.4%～94.8%之間，說明三株P(guān)CV2 毒株與國內(nèi)外已報(bào)道的PCV2分離株的相對同源性較高，PCV2毒株間的親緣關(guān)系很近，符合PCV2不同分離株間在遺傳上比較保守這一特性，同現(xiàn)階段對PCV2病毒的研究成果相印證。但是分析結(jié)果，也可以看出盡管遺傳保守，但也存在著變異，并且變異的發(fā)生同地理位置分布有一定程度上的相關(guān)性。

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四川省科技支撐計(jì)劃(2014NZ0043;2015NZ0072)

主要作者：平措，1975年，男，藏族，西藏林芝，中級獸醫(yī)師，動物檢疫?？?，主要從事獸醫(yī)方向研究

2017-06-27）