霍元楠，蔣增海*，，王宇坤，謝倩倩，張彥兵

(1．河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2．河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046）

副豬嗜血桿菌病診斷與耐藥分析

霍元楠1，2，蔣增海*，1，2，王宇坤1，2，謝倩倩1，2，張彥兵1，2

(1．河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2．河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046）

2017年3月，河南省清豐縣某豬場(chǎng)育肥豬發(fā)生咳嗽、腹式呼吸、體溫升高等癥狀，為確診病因，采集典型病豬的肺、心血，分離出一種細(xì)菌，通過染色鏡檢、氧化酶觸酶試驗(yàn)和PCR分子鑒定，最終確定出分離菌為副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)，編號(hào)為qff01。選擇14種藥物，采用紙片擴(kuò)散法，對(duì)已確定為副豬嗜血桿菌的分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其結(jié)果表明分離菌株對(duì)頭孢噻呋鈉、阿莫西林-克拉維酸、恩諾沙星、頭孢曲松、阿奇霉素等藥物敏感，對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、土霉素、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶耐藥。本研究結(jié)果對(duì)該豬場(chǎng)的副豬嗜血桿菌病防治工作提供了一定的參考依據(jù)。

副豬嗜血桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

副豬嗜血桿菌屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，是引起豬的格拉澤氏病(Glasser's Disease)的病原菌[1]，可以引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)豬健康狀況和菌株毒力的高低，副豬嗜血桿菌，可以造成急性或者慢性的感染，尤其對(duì)早期斷奶仔豬造成較大的危害。隨著我國(guó)豬場(chǎng)的規(guī)?；图s化進(jìn)程的加快，副豬嗜血桿菌病已成為當(dāng)前的流行趨勢(shì)，很多地區(qū)都有對(duì)該病的報(bào)道[2]。

2016年3月，河南省清豐縣某豬場(chǎng)，飼養(yǎng)基礎(chǔ)母豬150頭，存欄3月齡育肥豬約1 000頭，自從2月1日發(fā)生嚴(yán)重流感以后，多數(shù)圈舍的豬已恢復(fù)，還剩下少數(shù)圈舍豬還未康復(fù)，表現(xiàn)為嚴(yán)重的腹式呼吸，呼吸頻率加快，咳嗽，體溫升高到40.5～41 ℃，采食稍有減少，體況正常，皮膚發(fā)白；剖檢病變?yōu)樾陌e液（圖1），肺實(shí)質(zhì)性變硬，氣腫，肺臟肉變、胰腺樣變（圖2），表面散在出血點(diǎn)，氣管內(nèi)存在有大量泡沫性黏液，肺臟與胸膜黏結(jié)，腸系膜淋巴結(jié)腫大，肝臟膽汁充盈。用藥情況，強(qiáng)力霉素肌注給藥，氟苯尼考加替米考星拌料，一直不見好轉(zhuǎn)。為了診斷與控制該病，選取典型病例，進(jìn)行了副豬嗜血桿菌分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

圖1 剪開心包膜，出現(xiàn)明顯的心包積液現(xiàn)象

圖2 肺表面散在出血點(diǎn)，實(shí)質(zhì)性變硬，出現(xiàn)肉變、胰腺樣變

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，胰酪胨大豆肉湯（TSB)購(gòu)自BD公司，配制時(shí)，加入終濃度為5%的新生牛血清（購(gòu)自杭州天杭生物技術(shù)股份有限公司），同時(shí)加入終濃度為10μg/mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)量（購(gòu)自Roche公司，使用前需過濾除菌）；5%鮮血瓊脂平板購(gòu)自于江門市凱林貿(mào)易有限公司。

1.1.2 藥敏片

頭孢噻呋，頭孢曲松，氨芐西林，頭孢他啶，阿莫西林-克拉維酸，氨曲南，四環(huán)素，土霉素，恩諾沙星，環(huán)丙沙星，氯霉素，磺胺甲惡唑/甲氧芐啶，阿奇霉素，克林霉素，均購(gòu)自oxoid公司。

1.1.3 PCR材料

瓊脂糖（Low EEO MμLti-purpose Agarose）購(gòu)自HydraGene公司；2×Taq PCR Master mix緩沖液購(gòu)自Genview公 司；DL2000 DNA Marker由Taksps公司提供；參考文獻(xiàn)[3]根據(jù)副豬嗜血桿菌16SRNA序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增預(yù)片段為822 bp大??；上游引物：5'-GGCTTTCGTCACCCTCTGT-3'；下游 引 物 ：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'。

1.1.4 其他試劑

快速革蘭氏染色液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；金黃色葡萄球菌由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng)

無菌采集患豬肺部組織、心血，分別接種于已添加NAD和犢牛血清的TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察其生長(zhǎng)情況，挑取疑似副豬嗜血桿菌單個(gè)菌落，進(jìn)一步純化2～3代。

1.2.2 涂片鏡檢

從TSA平板上，挑取上述可疑單菌落，均勻涂抹于潔凈的載玻片上，自然干燥，火焰固定后，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察形態(tài)。

1.2.3 衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象

挑取可疑單個(gè)菌落，水平劃線接種于鮮血瓊脂平板上，再在該平板上垂直劃線接種金黃色葡萄球菌落，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察是否有衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象和溶血現(xiàn)象。

1.2.4 接觸酶反應(yīng)

挑取疑似HPS菌落加入到6%H2O2，觀察是否有氣泡產(chǎn)生。

1.2.5 PCR鑒定

挑取純培養(yǎng)的兩個(gè)單菌落洗脫于含200μL無菌去離子水中，渦旋均勻后，煮沸10 min立即放入-20 ℃冰箱凍融10 min，12 000 r/min離心3 min，取上清液作DNA模板。反應(yīng)體 系 ：PCR Master Mix 12.5μL， 上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，滅菌的雙蒸水9.5μL，模板2μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠1×TAE緩沖液中電泳。

1.2.6 藥敏試驗(yàn)

挑取TSA平板上純化培養(yǎng)物，接種于含有NAD的胰蛋白大豆肉湯（TSB）中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。用TSB肉湯稀釋菌懸液至0.5麥?zhǔn)隙?，用滅菌棉簽蘸取菌液，均勻涂抹于TSA培養(yǎng)基，用無菌的鑷子夾取藥敏片平貼于培養(yǎng)基表面，在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 分離、培養(yǎng)

采集肺臟組織、心血接種于TSA平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，生長(zhǎng)為大小0.5～2 mm、無色、透明、濕潤(rùn)、光滑的圓形菌落，進(jìn)一步純化2～3代后，菌落形態(tài)未見改變（圖3），與已報(bào)道的文章[4]形態(tài)一致。

圖3 分離菌在TSA上生長(zhǎng)，出現(xiàn)針尖樣大小，濕潤(rùn)光滑透明

2.2 涂片鏡檢

將可疑菌落，涂片，染色、鏡檢，可見細(xì)菌為革蘭氏陰性，菌體表現(xiàn)多形態(tài)，細(xì)小桿菌，短桿菌，稍微彎曲，長(zhǎng)絲狀，或者以單個(gè)散在纖細(xì)桿狀者居多（圖4）。

圖4 分離菌在油鏡下觀察，可見細(xì)菌為革蘭氏陰性，出現(xiàn)細(xì)小桿菌，短桿菌，稍微彎曲，長(zhǎng)絲狀，或者以單個(gè)散在等多種形態(tài)

2.3 觸酶反應(yīng)結(jié)果

挑取疑似HPS菌落加入到6 %H2O2，立即產(chǎn)生大量氣泡。

2.4 衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象

在血瓊脂平板上出現(xiàn)明顯的衛(wèi)星現(xiàn)象，離葡萄球菌菌苔越近其菌長(zhǎng)勢(shì)越好，菌落越大，可見許多圓形，針尖大小，邊緣整齊的菌落。遠(yuǎn)離葡萄球菌菌苔越遠(yuǎn)，菌落則越少、越小，甚至無菌落生長(zhǎng)（圖5）。推斷出葡萄球菌周圍有利于副豬嗜血桿菌的生長(zhǎng)［5］。

圖5 衛(wèi)星現(xiàn)象，三條粗實(shí)線為接種的金黃色葡萄球菌，可見離葡萄球菌越近，分離菌長(zhǎng)得越好，越遠(yuǎn)則只有少量菌落生長(zhǎng)，甚至無菌落生長(zhǎng)

2.5 PCR鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物在凝膠電泳成像儀中可觀察到約822 bp的DNA片段，以DL2000Marker為標(biāo)準(zhǔn)。可見待測(cè)樣品與預(yù)期片段大小相符合（圖6）。

圖6 分離菌PCR結(jié)果

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由于副豬嗜血桿菌目前還沒有判斷標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]中，流感嗜血桿菌藥物判定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行判定。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明本株副豬嗜血桿菌對(duì)頭孢噻呋鈉、阿莫西林-克拉維酸、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等獸用藥敏感；同時(shí)對(duì)頭孢曲松、阿奇霉、氨曲南、頭孢他啶、克林霉素等人用藥均敏感；但是對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、土霉素、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶耐藥（見表1）。

3 分析與討論

根據(jù)本病流行特點(diǎn)、臨床癥狀、病理變化和細(xì)菌分離與鑒定結(jié)果，將本次病例確診為副豬嗜血桿菌病。由于副豬嗜血桿菌十分嬌嫩，對(duì)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，臨床病料分離HPS有一定的難度，進(jìn)行細(xì)菌分離時(shí)，常需要新鮮病料，適宜的培養(yǎng)條件和富含營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基，才能提高其臨床分離率，本試驗(yàn)在TSA、TSB培養(yǎng)基中，添加了犢牛血清、NAD，適合于副豬嗜血桿菌分離、培養(yǎng)。

目前該病的防治措施主要包括預(yù)防接種、藥物防治和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。疫苗免疫接種是預(yù)防副豬嗜血桿菌的有效方法之一。然而其血清型復(fù)雜，目前已知有15個(gè)血清型，但國(guó)內(nèi)各地流行的血清型不盡相同［7］，且各型之間缺乏交叉保護(hù)，因此，臨床上一般使用藥物來防控該病。根據(jù)本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議使用阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻呋或者恩諾沙星對(duì)該豬場(chǎng)病例進(jìn)行治療，根據(jù)養(yǎng)殖戶反饋，治療效果較好。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌分離株對(duì)獸醫(yī)臨床上常用藥物：氨芐西林、四環(huán)素、土霉素、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶均耐藥，雖然氯霉素是動(dòng)物禁用藥物，但是對(duì)該藥物仍然耐藥，估計(jì)與同類藥物氟苯尼考長(zhǎng)期在豬場(chǎng)使用有關(guān)，進(jìn)一步解釋了養(yǎng)殖戶使用氟苯尼考等藥物控制不住疫情的原因。

因此，在日常管理中，合理使用抗生素，減少其耐藥的產(chǎn)生，保持良好的飼養(yǎng)管理，加強(qiáng)通風(fēng)，免疫接種當(dāng)?shù)亓餍卸局?，搞好環(huán)境衛(wèi)生，避免混合感染，實(shí)行全進(jìn)全出的策略，可以減少該病發(fā)生的概率。

[1] OLIVEIRA S，PIJOAN C.Haemophilus parasuis：new trends on diagnosis，epidemiology and control[J].Veterinary Microbiology，2004，99(1)：1-12.

[2] 蔡旭旺，劉正飛，陳煥春，等.副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) ，2005，24(1)：55-58.

[3] OLIVEIRA S，GALINA L，PIJOAN C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2001，13(6)：495-501.

[4] 陸國(guó)林，何海健.浙江省副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué) ，2010，40(6)：622-625.

[5] 薛國(guó)聰，徐成剛，涂玉蓉，等.副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī) ，2010，37(1)：134-137.

[6] 孫長(zhǎng)貴.2013年CLSI+M100-S23文件中文版[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013（1）：96-99.

[7] 周斌，儲(chǔ)岳峰，李超，等.華東地區(qū)副豬嗜血桿菌的分離、血清型鑒定與藥敏分析 [J]. 畜牧與獸醫(yī) ，2009，41(11)：84-86.

河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：MXK2016102）；

霍元楠（1994-），女，河南信陽人，本科，主要從事豬病臨床診斷與防治研究；

蔣增海（1976-），男，四川簡(jiǎn)陽人，講師，E-mail:50242328@qq.com。

2017-07-11)