臧凱宏 秦紅巖 馬 駿 任 遠 朱麗娟△

（1甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，蘭州730000；2甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，蘭州730000；3 蘭州大學第一醫(yī)院藥劑科，蘭州730000）

?論 著?

雌激素對大鼠內(nèi)臟痛覺感受及結(jié)腸5-羥色胺合成的影響*

臧凱宏1,2秦紅巖3馬 駿1,2任 遠1,2朱麗娟1,2△

（1甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，蘭州730000；2甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，蘭州730000；3蘭州大學第一醫(yī)院藥劑科，蘭州730000）

目的：研究雌激素對大鼠內(nèi)臟痛覺感受及結(jié)腸5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine, 5-HT) 合成的影響。方法Wistar雌性大鼠采用隨機數(shù)字表分組，分為假手術(shù)組，卵巢切除組及卵巢切除+雌激素組。卵巢切除+雌激素組動物皮下注射苯甲酸雌二醇（30 μg·kg-1），連續(xù)給藥2周。給藥結(jié)束后次日測定大鼠內(nèi)臟痛閾值、血清雌激素和孕激素水平；收集結(jié)腸組織測定5-HT含量、嗜鉻細胞數(shù)量及色氨酸羥化酶的表達。結(jié)果雌激素替代給藥后顯著提高卵巢切除大鼠血清雌激素水平、降低內(nèi)臟痛閾值、明顯提高結(jié)腸嗜鉻細胞數(shù)量、5-HT含量及色氨酸羥化酶的表達。結(jié)論雌激素對結(jié)腸5-HT合成具有正性調(diào)控作用，該機制可能參與雌激素介導的內(nèi)臟痛覺感受增強。

雌激素；內(nèi)臟痛；5-羥色胺；卵巢切除；嗜鉻細胞

臨床研究表明，痛覺存在顯著的性別差異，即女性的痛閾值明顯低于男性[1]。流行病學資料顯示，女性比男性更易患腸易激綜合征和間質(zhì)性膀胱炎等疾病，其發(fā)生可能與雌激素對內(nèi)臟痛覺轉(zhuǎn)導的正向調(diào)制作用有關(guān)[2]。雌激素通過激活雌激素受體參與痛覺調(diào)節(jié)，雌激素受體廣泛分布于腸神經(jīng)叢及腸上皮細胞，其激活可精密調(diào)控腸道感覺和分泌功能[3]。

5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine, 5-HT) 是參與調(diào)控胃腸功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，腸黏膜中嗜鉻細胞是其主要來源，色氨酸羥化酶 (tryptophan hydroxylase,TPH) 是其合成限速酶[4]。研究顯示，5-HT增多在內(nèi)臟痛覺形成中起關(guān)鍵作用，5-HT增多既可以通過激活傳入神經(jīng)上的5-HT受體介導痛覺反應(yīng)，又可以通過敏化外周痛覺感受器誘發(fā)痛覺超敏[5]。雌激素和5-HT均為內(nèi)臟痛覺的重要調(diào)控分子，二者之間是否存在相互作用？其相互作用是否對內(nèi)臟痛覺存在影響？目前尚缺少相關(guān)研究證據(jù)。研究雌激素與5-HT在內(nèi)臟痛覺調(diào)制中的相互作用可深入了解內(nèi)臟痛覺超敏的分子機制，對闡明腸易激綜合征和間質(zhì)性膀胱炎的發(fā)病機制具有重要意義。本研究擬應(yīng)用卵巢切除 (ovariectomy, OVX) 大鼠模型，考察OVX及雌激素替代對內(nèi)臟痛覺感受及腸道5-HT生成的影響。

方 法

1. 材料

（1）藥品與試劑

大鼠雌激素檢測ELISA試劑盒及大鼠5-HT檢測ELISA試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司(ARB12673，ARB11940)；大鼠孕激素測定ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(ML-E-00899)。Anti-TPH抗 體 購 自Santa Cruz公司 (sc30079)；anit-serotonin抗體購自Sigma公司(S5545)。即用型SABC (兔IgG) 免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司 (SA1022)；ECL發(fā)光試劑購于賽默飛世爾科技公司（32209）；苯甲酸雌二醇注射液（獸藥，規(guī)格2 mg/ml，批號：20151201）購于四川金科藥業(yè)有限公司。

（2）儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱（重慶永恒實驗儀器廠）；3K15型低溫離心機（Sigma公司）；酶標儀（Bio-Rad公司）；XB51-32H01型病理圖像分析系統(tǒng)（奧林巴斯）；DY89-1型電動勻漿機（寧波新芝生物科技有限公司）；1658001型蛋白印跡電泳儀（Bio-Rad）；LT-224S 型電子天平(北京賽多利斯)。

（3）動物

成年雌性Wistar大鼠，SPF級，體重200～240 g，購于甘肅中醫(yī)大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(甘)2001-0001-0001335。

2. 實驗方法

（1）卵巢切除大鼠模型

雌性大鼠隨機分為OVX手術(shù)組和假手術(shù)組。大鼠用7﹪水合氯醛(350 mg·kg-1, ip.)麻醉，于肋弓下側(cè)腹部做一約1 cm的切口，進入腹腔。沿子宮找到卵巢并用4號線結(jié)扎卵巢系膜血管，切除雙側(cè)卵巢，子宮復(fù)位后細線縫合切口，關(guān)腹。假手術(shù)組動物打開腹腔后摘取卵巢旁少許脂肪組織后關(guān)腹。

（2） 動物分組、給藥及樣品收集

動物共分為3組：假手術(shù)組(Sham)，OVX組及OVX+雌激素替代給藥組(OVX+E)。雌激素替代給藥方法：于卵巢切除后次日，動物給予苯甲酸雌二醇注射液(30 μg·kg-1, s.c.)[6]，Sham組及OVX組動物皮下注射滅菌純芝麻油作為對照。動物連續(xù)給藥2周，于末次給藥后次日進行腹壁收縮實驗測定內(nèi)臟痛閾值；然后水合氯醛麻醉，腹主動脈取血并分離血清進行雌孕激素測定；同時收集近端結(jié)腸組織，一部分多聚甲醛固定并制備石蠟切片，另一部分組織測定腸道5-HT含量及TPH蛋白表達。

（3）腹壁收縮實驗

具體實驗方法如文獻所示[7]：動物禁食，乙醚麻醉，將潤滑的球囊導管(6 cm)插入動物肛門并固定于動物尾部。動物放于透明籠內(nèi)適應(yīng)30 min，用血壓計以5 mmHg遞增的方式向球囊加壓并觀察動物變化，直至動物出現(xiàn)明顯的腹壁肌肉收縮伴腹壁抬高。記錄引起動物腹壁收縮反射所對應(yīng)的壓力值。每只大鼠共測定5次，每次間隔5 min，取其平均值作為該動物的內(nèi)臟痛閾值。

（4）免疫組織化學實驗

石蠟組織切片脫蠟至水，放于pH = 6.0的檸檬酸鈉緩沖溶液中采用微波法進行抗原修復(fù)。切片阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再用5%牛血清室溫封閉30 min。切片加入一抗（1:4 000稀釋）4℃孵育過夜，按照免疫組化試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、樹膠封片。嗜鉻細胞陽性染色為棕黃色，顯微鏡下拍片并進行統(tǒng)計：200×鏡下每張切片隨機選取5個視野，用Image J軟件計數(shù)每個視野中陽性染色的細胞數(shù)量并計算黏膜面積，用每平方米黏膜面積中的陽性染色細胞數(shù)作指標進行定量分析[8]。

（5）免疫印跡實驗

應(yīng)用免疫印跡實驗測定腸道組織中TPH的蛋白表達，具體方法如下：取近端結(jié)腸組織提取并制備組織蛋白樣品，12%SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。將PVDF膜與一抗（1:1 000稀釋）4℃搖床孵育過夜。洗去一抗，加入對應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。加入ECL發(fā)光試劑，暗室壓片，曝光。掃描顯影條帶，應(yīng)用Image J軟件計算灰度值，定量分析蛋白表達量。

（6）ELISA測定

腸組織加入含有EDTA的Tris鹽酸裂解液（含0.5% Triton X-100及蛋白酶抑制劑）進行組織勻漿。勻漿液經(jīng)10 000 G低溫離心10 min，分離上清，應(yīng)用大鼠5-HT檢測ELISA試劑盒進行5-HT含量測定。血清雌激素及孕激素測定根據(jù)ELISA試劑盒所提供的操作說明進行實驗。每個樣品設(shè)定2個復(fù)孔，結(jié)果取平均值進行統(tǒng)計分析。

3.統(tǒng)計分析

結(jié) 果

1.卵巢切除及雌激素替代對大鼠血清雌激素和孕激素水平的影響

與假手術(shù)組大鼠相比，卵巢切除手術(shù)組大鼠血清雌激素及孕激素水平明顯降低（P＜ 0.05），說明卵巢切除動物模型制備成功。與卵巢切除組大鼠相比，雌激素替代給藥顯著提高卵巢切除大鼠血清雌激素水平（P＜ 0.05，見表1），且該血清雌激素水平接近假手術(shù)組大鼠血清雌激素水平，說明雌激素替代治療比較成功。此外，表1結(jié)果顯示，雌激素替代對血清孕激素水平無明顯影響（P＞ 0.05，見表1）。

2.卵巢切除及雌激素替代對大鼠內(nèi)臟痛閾值的影響

與假手術(shù)組大鼠相比，卵巢切除手術(shù)組大鼠的內(nèi)臟痛閾值明顯升高（P＜ 0.05），提示卵巢切除可降低大鼠內(nèi)臟痛覺閾值。與卵巢切除組大鼠相比，雌激素替代可以明顯減低卵巢切除大鼠的內(nèi)臟痛閾值（P＜ 0.05，見表2），說明雌激素可以提升內(nèi)臟痛覺感受器的敏感性。

3. 卵巢切除及雌激素替代對大鼠腸道嗜鉻細胞數(shù)量及5-HT含量的影響

腸道嗜鉻細胞免疫組化染色結(jié)果見圖1，同假手術(shù)組大鼠相比，卵巢切除組大鼠腸道嗜鉻細胞數(shù)量明顯減少，而雌激素替代可逆轉(zhuǎn)卵巢切除大鼠腸道嗜鉻細胞數(shù)量的減少。如表3所示，卵巢切除組大鼠腸道嗜鉻細胞數(shù)量及5-HT含量均明顯低于假手術(shù)組大鼠（P＜ 0.05），提示卵巢切除可降低腸道嗜鉻細胞數(shù)量及5-HT含量。與卵巢切除組大鼠相比，雌激素替代給藥顯著提高卵巢切除大鼠結(jié)腸組織中嗜鉻細胞的數(shù)量及腸組織中5-HT的含量（P＜ 0.05），提示補充雌激素可增加大鼠腸道嗜鉻細胞數(shù)目及5-HT含量。

表1 卵巢切除及雌激素替代對大鼠血清雌激素和孕激素水平的影響(±SD，n=7)Table 1 Effects of ovariectomy (OVX) and estrogen supplementation on serum estrogen and progestogen level in rats(±SD，n=7)

表1 卵巢切除及雌激素替代對大鼠血清雌激素和孕激素水平的影響(±SD，n=7)Table 1 Effects of ovariectomy (OVX) and estrogen supplementation on serum estrogen and progestogen level in rats(±SD，n=7)

*P ＜ 0.05, 與假手術(shù)組比較，compared with sham group, #P ＜ 0.05, 與OVX組比較，compared with OVX group.

孕激素Progestogen (ng·ml-1)Sham18.94±4.8732.63±6.48 OVX 5.01±1.96 * 7.38±1.71*OVX+E 17.83±1.91 # 7.13±1.23組別Groups雌激素Estrogen (pg·ml-1)

表2 卵巢切除及雌激素替代對大鼠內(nèi)臟痛閾值的影響(±SD，n=7)Table 2 Effects of ovariectomy (OVX) and estrogen supplementation on visceral pain threshold pressure in rats(±SD，n=7)

表2 卵巢切除及雌激素替代對大鼠內(nèi)臟痛閾值的影響(±SD，n=7)Table 2 Effects of ovariectomy (OVX) and estrogen supplementation on visceral pain threshold pressure in rats(±SD，n=7)

*P ＜ 0.05, 與假手術(shù)組比較, compared with sham group， #P ＜ 0.05, 與OVX組比較，compared with OVX group.

痛閾值Pain threshold pressure(mmHg)Sham40.2±1.1 OVX 45.0±1.6 *OVX+E 40.4±1.1 #組別Groups

4. 卵巢切除及雌激素替代對大鼠結(jié)腸TPH表達的影響

與假手術(shù)組動物相比，卵巢切除手術(shù)組大鼠結(jié)腸組織中TPH的表達明顯降低（P＜ 0.05），該結(jié)果與結(jié)腸中嗜鉻細胞數(shù)量減少及5-HT含量降低一致。與卵巢切除組大鼠相比，雌激素替代給藥顯著提高結(jié)腸組織中TPH的表達（P＜ 0.05，見圖2、表4），提示雌激素可上調(diào)大鼠腸道TPH的表達。

討 論

我們的研究結(jié)果顯示，OVX大鼠內(nèi)臟痛閾值明顯提高，而雌激素替代可使OVX大鼠內(nèi)臟痛閾值恢復(fù)并接近正常水平，說明雌激素對內(nèi)臟痛覺感受具有增敏作用。該結(jié)果與文獻報道一致，研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可使慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠對熱刺激變得更加敏感[9]；雌激素通過上調(diào)大鼠背根神經(jīng)節(jié)中痛覺感受調(diào)制受體P2Y1的表達提高痛覺感受[10]；雌激素可提高初級感覺神經(jīng)元對疼痛介質(zhì)P物質(zhì)的感受性并參與痛覺敏感的發(fā)生[11]。目前認為，女性高發(fā)腸易激綜合征內(nèi)臟痛敏與雌激素對內(nèi)臟痛覺感受的增敏作用密切相關(guān)[2]。

圖1 免疫組化結(jié)果顯示卵巢切除及雌激素替代對大鼠結(jié)腸嗜鉻細胞數(shù)量的影響（箭頭所示為嗜鉻細胞，DAB，標尺= 100 μm）Fig. 1 Immunohistochemistry shows the effects of ovariectomy (OVX) and estrogen supplementation on colonic enterochromaf fi n cell number in rats (arrowheads indicate enterochromaf fi n cells, DAB, Scale bar = 100 μm).

表3 卵巢切除及雌激素替代對大鼠腸道嗜鉻細胞數(shù)量及5-HT含量的影響(±SD，n=7)Table 3 Effects of ovariectomy (OVX) and estrogen supplementation on colonic EC cell density and 5-HT content in rats(±SD，n=7)

表3 卵巢切除及雌激素替代對大鼠腸道嗜鉻細胞數(shù)量及5-HT含量的影響(±SD，n=7)Table 3 Effects of ovariectomy (OVX) and estrogen supplementation on colonic EC cell density and 5-HT content in rats(±SD，n=7)

*P ＜ 0.05, 與假手術(shù)組比較, compared with sham group， #P ＜ 0.05, 與OVX組比較，compared with OVX group.

5-HT含量5-HT content(ng·mg-1)Sham89.21±10.3811.87±2.47 OVX 69.99±14.75 * 7.18±2.44 *OVX+E84.18±6.50 # 9.98±1.83 #組別Groups嗜鉻細胞數(shù)量EC cell density(mm2)

圖2 卵巢切除及雌激素替代對大鼠結(jié)腸色氨酸羥化酶（TPH）蛋白表達的影響Fig.2 Effects of ovariectomy (OVX) and estrogen supplementation on protein expression of tryptophan hydroxylase (TPH) in the colon tissue of rats.

表4 卵巢切除及雌激素替代對大鼠腸道色氨酸羥化酶（TPH）蛋白表達的影響(±SD，n=7)Table 4 Effect of ovariectomy (OVX) and estrogen supplementation on protein expression of tryptophan hydroxylase (TPH) in the colon tissue of rats(±SD，n=7)

表4 卵巢切除及雌激素替代對大鼠腸道色氨酸羥化酶（TPH）蛋白表達的影響(±SD，n=7)Table 4 Effect of ovariectomy (OVX) and estrogen supplementation on protein expression of tryptophan hydroxylase (TPH) in the colon tissue of rats(±SD，n=7)

*P ＜ 0.05, 與假手術(shù)組比較, compared with sham group， #P ＜ 0.05,與OVX組比較，compared with OVX group(n=7).

色氨酸羥化酶表達（光密度比值）TPH expression (ratio of optical density)Sham1.19±0.14 OVX 0.42±0.03 *OVX+E 0.64±0.04 #組別Groups

5-HT是調(diào)節(jié)腸道功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，可通過與腸神經(jīng)元上的多種5-HT受體結(jié)合，調(diào)節(jié)胃腸道的感覺、運動和分泌功能。大量研究表明，腸道嗜鉻細胞數(shù)量的增加及5-HT含量增多是內(nèi)臟痛覺超敏發(fā)生的主要原因[12]，TPH抑制劑LX1031可減少腸道5-HT合成，臨床研究證實TPH抑制劑可明顯緩解腸易激綜合癥患者的內(nèi)臟痛敏[13]，說明腸道5-HT在內(nèi)臟痛覺超敏中發(fā)揮重要作用。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體和5-HT受體共同表達于腸道神經(jīng)叢，雌激素水平升高可上調(diào)5-HT受體的表達[14]，說明雌激素對5-HT信號系統(tǒng)具有增強作用。我們的研究顯示，OVX可下調(diào)腸道TPH的蛋白表達，而雌激素替代治療可上調(diào)TPH表達并使其接近正常水平，該結(jié)果與腸道嗜鉻細胞數(shù)量及5-HT含量變化比較一致。雌激素通過何種途徑調(diào)節(jié)TPH表達，該調(diào)節(jié)是轉(zhuǎn)錄前調(diào)控還是轉(zhuǎn)錄后修飾是我們后期研究中需要重點關(guān)注的問題，值得深入研究。

總之，雌激素可上調(diào)腸道5-HT合成酶表達，促進5-HT合成并提高5-HT含量，從而提高內(nèi)臟痛覺敏感性。本研究可為雌激素與5-HT相互作用研究提供依據(jù)，了解雌激素與5-HT在內(nèi)臟痛覺調(diào)制中的相互作用有望為腸易激綜合征內(nèi)臟痛覺超敏的分子機制研究提供線索。

[1] Dodds KN, Beckett EA, Evans SF,et al. Glial contributions to visceral pain: implications for disease etiology and the female predominance of persistent pain. Transl Psychiatry, 2016, 6(9):1～13.

[2] Mulak A, Taché Y. Sex difference in irritable bowel syndrome: do gonadal hormones play a role? Gastroenterol Pol, 2010, 17(2):89～97.

[3] Meleine M, Matricon J. Gender-related differences in irritable bowel syndrome: potential mechanisms of sex hormones.World J Gastroenterol, 2014, 20(22):6725～6743.

[4] Deiteren A, de Wit A, van der Linden L,et al. Irritable bowel syndrome and visceral hypersensitivity: risk factors and pathophysiological mechanisms. Acta Gastroenterol Belg, 2016, 79(1):29～38.

[5] Farzaei MH, Bahramsoltani R, Abdollahi M,et al.The Role of Visceral Hypersensitivity in Irritable Bowel Syndrome: Pharmacological Targets and Novel Treatments. J Neurogastroenterol Motil, 2016,22(4):558～574.

[6] Fukuda K, Yao H, Ibayashi S,et al. Ovariectomy exacerbates and estrogen replacement attenuates photothrombotic focal ischemic brain injury in rats.Stroke, 2000, 31(1):155～160.

[7] Al-Chaer ED, Kawasaki M, Pasricha PJ. A new model of chronic visceral hypersensitivity in adult rats induced by colon irritation during postnatal development.Gastroenterology, 2000, 119(5):1276～1285.

[8] Qin HY, Luo JL, Qi SD,et al. Visceral hypersensitivity induced by activation of transient receptor potential vanilloid type 1 is mediated through the serotonin pathway in rat colon. Eur J Pharmacol, 2010, 647(1-3):75～83.

[9] 趙欣，劉健，徐建國. 雌激素對慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠熱痛覺過敏的影響. 中華麻醉學雜志, 2004,24(4):279～281.

[10] 杜狄，王立鵬，馬蓓. 去卵巢大鼠雌激素替代后背根神經(jīng)節(jié)P2Y1受體表達增加. 第二軍醫(yī)大學學報,2011, 32(3):254～257.

[11] Ouyang A, Wrzos HF. Contribution of gender to pathophpiology and clinical presentation of IBS:should management be different in women? Am J Gastroenterol, 2006, 101(12):602～609.

[12] Farzaei MH, Bahramsoltani R, Abdollahi M,et al.The Role of Visceral Hypersensitivity in Irritable Bowel Syndrome: Pharmacological Targets and Novel Treatments. J Neurogastroenterol Motil, 2016, 22(4):558～574.

[13] Brown PM, Drossman DA, Wood AJ,et al. The tryptophan hydroxylase inhibitor LX1031 shows clinical bene fi t in patients with nonconstipating irritable bowel syndrome. Gastroenterology, 2011, 141(2):507～516.

[14] Rybaczyk LA, Bashaw MJ, Pathak DR,et al. An overlooked connection: serotonergic mediation of estrogen-related physiology and pathology. BMC Womens Health, 2005, 5:12.

EFFECTS OF ESTROGEN ON THE VISCERAL PAIN SENSITIVITY AND COLONIC 5-HT SYNTHESIS IN RATS*

ZANG Kai-Hong1,2, QIN Hong-Yan3，MA Jun1,2, REN Yuan1,2, ZHU Li-Juan1,2△
(1College of pharmacy, Gansu University of Traditional Chinese Medicine; Lanzhou, 730000, China;2Gansu Key Laboratory of Phamacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine; Lanzhou, 730000, China;3Department of pharmacy, First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Objective: To investigate the effects of estrogen on visceral pain sensitivity and colonic 5-hydroxytryptamine (5-HT) synthesis in rats.MethodsFemale Wistar rats were randomly divided and

ovariectomy (OVX) or sham operation. Three groups were set for this study, they are sham group, OVX group and OVX plus estrogen supplementation group. Rats in OVX group and sham group were treated with pure sesame oil subcutaneously as controls, and rats in OVX plus estrogen group were subcutaneously treated with estradiol benzoate(30 ug·kg-1), drugs were given to rats for consecutive 2 weeks. After drugs treatment, pain threshold pressure was measured by abdominal withdrawal re fl ex test; blood was collected for determination of the serum level of estrogen and progesterone by ELISA; and proximal colon tissue was also collected for 5-HT content assay, enterochromaf fi n cells counting, and tryptophan hydroxylase (TPH) expression detection by ELISA, immunohistochemistry and Western-blot, respectively.ResultsCompared with the rats in OVX group, the pain threshold in estrogen-treated rats was marked decreased, while colonic enterochromaf fi n cells density, 5-HT content as well as TPH expression were all signi fi cantly increased.ConclusionEstrogen can positively regulate colonic 5-HT synthesis, and this effect may have correlation with estrogen-mediated increase of visceral sensitivity.

Estrogen; Visceral pain; 5-Hydroxytryptamine; Ovariectomy; Enterochromaf fi n cells

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.09.000

國家自然科學基金資助項目（81341145；81400596）

△通訊作者 39921706@qq.com