李永勝，馬曉峰

(1.甘肅省人民醫(yī)院 急診科，甘肅 蘭州 730000; 2.國營長風機器廠職工醫(yī)院 內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000)

·論著·

烏司他丁對腸道上皮細胞屏障損傷的保護作用分析

李永勝1，馬曉峰2

(1.甘肅省人民醫(yī)院 急診科，甘肅 蘭州 730000; 2.國營長風機器廠職工醫(yī)院 內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000)

目的探討烏司他丁(UTI)對腸道上皮細胞屏障損傷的保護作用及其機制。方法培養(yǎng)Caco-2細胞，并建立腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導的單層上皮細胞模型，隨機分為空白對照組、TNF-α模型組、UTI低劑量組(5萬U/kg)、UTI中劑量組(10萬U/kg)、UTI高劑量組(20萬U/kg)。采用Millicell電阻儀和多功能讀板儀分別測定各組上皮細胞電阻(TER)和異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(FITC-dextran)，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定白細胞介素6(IL-6)、IL-10水平，流式細胞儀測定細胞凋亡率，免疫蛋白質印記(Western blot)技術測定緊密連接蛋白閉合蛋白(occludin)和緊密黏連蛋白1(ZO-1)表達水平。結果與空白對照組相比，TNF-α模型組TER、FITC-dextran、occludin和ZO-1表達水平均明顯下降，IL-6、IL-10、細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與TNF-α模型組比較，經(jīng)UTI處理后，TER、FITC-dextran、occludin和ZO-1表達水平升高，IL-6、IL-10、細胞凋亡率降低(P<0.05)，其中以UTI高劑量組變化最顯著(P<0.05)。結論UTI可能通過抑制炎性介質釋放，調節(jié)緊密連接相關蛋白表達，抑制TNF-α誘導的腸道上皮細胞屏障功能損傷。

腸；細胞屏障；腫瘤壞死因子α；烏司他丁；緊密連接蛋白

腸道上皮細胞屏障是維持腸道屏障功能的關鍵[1]，腫瘤壞死因子α(TNF-α)是重要的致炎因子，可損害腸上皮細胞及其細胞間緊密結構，影響腸道屏障功能。烏司他丁(UTI)是一種廣譜酶抑制劑，可抑制中性粒細胞、內(nèi)皮細胞等釋放的絲氨酸蛋白酶，具有抑制炎癥、清除氧自由基等作用[2]。最近研究表明，UTI抗炎效果確切，對小鼠腸道黏膜損傷有保護作用[3-4]，但具體作用機制尚不明確。本研究通過建立TNF-α誘導的單層腸上皮細胞(IECs)屏障模型，從細胞功能、分子水平方面綜合評價UTI對模型細胞的保護作用，并探討作用機制，為UTI治療腸黏膜屏障損傷提供依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1試劑與設備 UTI由廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司提供；DMEM高糖培養(yǎng)基由美國GIBCO BRl公司提供；人腸上皮細胞注射株Caco-2細胞由美國ATCC公司提供；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)由北京中杉金橋生物技術有限公司提供；兔抗occludin抗體由美國Abcam公司提供；兔抗ZO-1抗體由美國Santa Cruz公司提供；TNF-α、IL-6 ElISA檢測試劑由上海森雄生物技術公司提供；Millicell電阻儀由Millipore公司提供；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱由美國NAPCO公司提供BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀由美國Becton Dickinson公司提供。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及單層上皮細胞模型的建立 用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人腸上皮細胞注射株Caco-2細胞，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔日換液，檢測跨上皮細胞電阻(TER)。體外上皮屏障形成判斷標準：培養(yǎng)21～28天后TER明顯升高，且數(shù)值穩(wěn)定。

1.2.2Millicell電阻儀和多功能讀板儀分別測定TER和異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(FITC-dextran) 將傳代至23～31代的Caco-2細胞用于實驗，實驗開始后換用實驗室培養(yǎng)液，由不含谷氨酰胺(Gln)和胎牛血清(FBS)的DMEM、10 nmol/L 4-羥乙基哌乙磺酸(HEPES)、10 g/L丙酮酸鈉構成。Caco-2細胞單層以5×105/個接種于96孔板，分別在頂室與底室中加入實驗室培養(yǎng)液100 μl和600 μl，隔天換液。顯微鏡下觀察細胞生長情況及緊密連接的完整性。測量不同時間點TER值。細胞在實驗前加入無血清培養(yǎng)基饑餓12小時，設置空白對照組(無TNF-α、UTI)和TNF-α處理組，TNF-α處理組分別不加入UTI或加入UTI低(5萬U/kg)、中(10萬U/kg)、高劑量組(20萬U/kg)，每組3個復孔，孵育過夜后，空白對照組更換細胞培養(yǎng)液，UTI低、中、高劑量組分別給予5萬U/kg、10萬U/kg，20萬U/kg UTI繼續(xù)培養(yǎng)24小時。用Millicell電阻儀的兩電極置入小室頂側和基底側測定TER值。各Caco-2細胞處理48小時，采用FITC-葡聚糖((FITC-dextran))熒光示蹤法檢測腸上皮細胞通透性。預熱D-hank液至37 ℃，清洗Transwell頂室、底室1次，分別添加FITC-葡聚糖(1 mg/ml)100 μl、D-hank液500 μl，置于96孔板內(nèi)，37 ℃、5%CO2條件下孵育2小時。取底室液體，采用多功能讀板儀(芬蘭Thermo公司)檢測樣品熒光長度，激光波長480 nm，發(fā)生光波長520 nm，重復測量5次取平均值。

1.2.3ELISA測定IL-6、TNF-α水平 將Caco-2細胞單層以5×105/L接種于24孔板，分組及干預方法同1.2.2，培養(yǎng)24小時后收集上清液，采用ElISA法測定各組IL-6、IL-10水平。

1.2.4流式細胞儀測定細胞凋亡率 將Caco-2細胞單層以每孔3×105/L各細胞接種于6孔板，培養(yǎng)過夜，分組及干預方法同1.2.2。干預24小時后吸除培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞3次，制成單細胞懸液，并用PBS重懸，密度為1.0×106個/ml，加入FITC Annexin V和PI各5 μl，室溫下孵育15分鐘后，加入PBS 400 μl，采用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.5采用免疫蛋白質印記(western blot)技術測定緊密連接蛋白occludin、zo-1表達水平 將Caco-2細胞單層以1.0×105/L接種于24孔板，提取總蛋白，SDS-PAGE電泳，根據(jù)抗體實驗說明書推薦濃度用一抗稀釋液稀釋對應抗體，其中兔抗occlidin抗體為1∶800，兔抗ZO-1抗體為1∶200，將封閉好的PVDF膜放入稀釋一抗中，孵育過夜，TBST溫床上洗膜3次。按照1∶3 000的比例用脫脂奶粉稀釋二抗，與PVDF膜孵育，孵育1小時，TBST溫床上洗膜3次。按照發(fā)光液試劑盒說明書吸取1 ml試劑A和試劑B，混合后滴到PVDF膜上，吸去周邊多余發(fā)光劑，測量吸光度值，重復測量3次取平均值。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差(x-±s)表示，多組間比較進行方差齊性檢驗，如方差齊，采用單因素方差分析，如方差不齊采用Welah校正。組間多重比較在方差齊時選用Dunnett法檢驗，方差不齊時選用Dunnet T3檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1TER、FITC-dextran比較 與空白對照組比較，TNF-α模型組、UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組TER、FITC-dextran均明顯下降(P<0.05)；與TNF-α模型組比較，UTI治療后TER、FITC-dextra明顯升高(P<0.05)，UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 TER、FITC-dextran比較(n=3)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與TNF-α模型組比較，#P<0.05；與UTI低劑量組比較，△P<0.05；與UTI中劑量組比較，▲P<0.05

2.2Caco-2細胞單層炎性水平比較 與空白對照組比較，TNF-α模型組、UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組IL-6、IL-10均明顯升高(P<0.05)；與TNF-α模型組比較，UTI治療后IL-6、IL-10明顯降低(P<0.05)，UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 Caco-2細胞單層炎性水平比較(n=3)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與TNF-α模型組比較，#P<0.05；與UTI低劑量組比較，△P<0.05；與UTI中劑量組比較，▲P<0.05

2.3Caco-2細胞單層凋亡率及緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達比較 與空白對照組比較，TNF-α模型組、UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，Occludin、ZO-1表達水平明顯下降(P<0.05)；與TNF-α模型組比較，UTI治療后細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，Occludin、ZO-1表達水平明顯增加(P<0.05)；UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3，見圖1，2。

表3 Caco-2細胞單層凋亡率及緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達的比較(n=3)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與TNF-α模型組比較，#P<0.05；與UTI低劑量組比較，△P<0.05；與UTI中劑量組比較，▲P<0.05

圖1Caco-2細胞單層凋亡率分析

圖2緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達A、B、C、D、E分別為空白對照組、TNF-α模型組、UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組

3 討 論

完整的腸道上皮細胞屏障是維持腸道屏障功能重要的一環(huán)，可阻止腸內(nèi)大分子毒素、細菌等穿過腸壁，預防全身炎癥反應(SIRS)、多器官功能障礙綜合征(MODS)等發(fā)生。腸黏膜上皮細胞緊密連接完整與否直接影響腸道上皮屏障功能，一旦上皮緊密連接缺失或變異，細胞間隙通透性明顯增加，腸道屏障功能被破壞[5]。緊密連接主要位于上皮細胞頂端，包括Occludin、ZO-1、claudin-2蛋白等，其中Occludin是一種擴膜蛋白，通過Occludin蛋白封閉細胞間隙，與ZO-1蛋白共同形成緊密連接的基礎結構，可調控物質的細胞轉運途徑，是目前研究最多的緊密連接功能蛋白；ZO-1是ZO異構體最為主要的部分，可將縫隙連接(GJ)、黏附連接(AJ)連接在一起，在維持腸黏膜上皮細胞緊密連接完整性中起重要作用[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，炎性介質、腸道內(nèi)細菌、細胞因子等均會導致Occludin、ZO-1等緊密連接蛋白表達異常，增加腸黏膜通透性，影響腸道屏障功能[7]。故本研究選取Occludin、ZO-1作為觀察指標。

TNF-α是重要的致炎性因子之一，可通過激活肌球蛋白輕鏈激酶(MlCK)所接介導的肌球蛋白輕鏈激酶化，導致緊密連接蛋白重組，破壞腸道屏障功能，一般阻斷TNF-α后，腸道屏障功能會有所恢復[8-9]。多數(shù)研究指出，TNF-α會增加腸黏膜通透性[10-11]。本實驗中，我們在Transwell的上下室均加入TNF-α，以保證Caco-2單層細胞頂部和基底部均可接觸到TNF-α，結果顯示TER、FITC-dextra均下降，說明TNF-α會破壞Caco-2細胞單層屏障功能，增加細胞通透性增加，與Coskun等[12]研究結果一致。另外，本實驗中，TNF-α模型組Occludin、ZO-1蛋白較空白對照組明顯降低，提示Occludin、ZO-1蛋白表達異常，可能影響腸黏膜上皮細胞緊密連接完整性。劉行等[13]研究指出，緊密連接蛋白重新分布是TNF-α損害腸道上皮細胞功能的重要機制之一，本研究結果與其一致。

UTI主要來源于人尿的相對分子質量為67 000的糖蛋白，對絲氨酸蛋白酶、透明質酸梅、纖溶酶等多種酶有抑制作用，還可抑制白細胞釋放TNF-α、IL-6等炎性介質，降低細胞毒性作用，減輕腸黏膜充血，降低腸道通透性，預防腸道細菌、內(nèi)毒素移位[14-15]。Shikimi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，UTI可抑制炎性介質(如TNF-α、IL-6等)釋放，減輕其對器官功能的損害。周玉坤等[17]研究發(fā)現(xiàn)，UTI對急性重癥膽囊炎所致腸黏膜損傷有保護作用，能改善緊密連接相關蛋白表達異常情況。常瑞明等[18]研究指出，UTI可通過降低炎性介質釋放、降低腸黏膜Caspase-3等保護心肺復蘇后大鼠受損腸黏膜。因此，我們考慮UTI可改善TNF-α誘導的Caco-2細胞屏障功能障礙。為證實這一猜想，本實驗組中，加入不同劑量的UTI，結果表明加入UTI后可改善TNF-α引起的TER、FITC-dextran下降，且治療后IL-6、IL-10明顯降低，Occludin、ZO-1表達水平上調，呈現(xiàn)出劑量依賴性，說明UTI可上調緊密連接蛋白表達，降低腸黏膜通透性。

綜上所述，TNF-α與腸道上皮細胞屏障損傷密切相關，UTI對TNF-α誘導的腸道上皮細胞屏障損傷有保護作用，其機制可能為抑制IL-6、IL-10炎性介質釋放、上調緊密連接蛋白；另外，UTI對腸道上皮細胞屏障損傷的保護作用呈具有劑量依賴性。

[1] 王惠凌， 姜源濤， 張紅， 等. 重癥腦卒中患者腸粘膜屏障功能的變化[J]. 臨床薈萃， 2015， 30(5): 529-532.

[2] 張濤， 李孝建， 鄧忠遠， 等. 烏司他丁對燒傷患者凝血功能及全身炎癥反應的影響[J]. 西部醫(yī)學， 2016， 28(2): 201-203.

[3] 葉小玲， 陶珮， 陳月娥， 等. 烏司他丁對膿毒癥大鼠小腸粘膜屏障功能的保護作用[J]. 中華臨床感染病雜志， 2015， 8(6): 549-553.

[4] Shu X， Zhang J， Wang Q， et al. Glutamine decreases intestinal mucosal injury in a rat model of intestinal ischemia-reperfusion by downregulating HMGB1 and inflammatory cytokine expression[J]. Exp Ther Med， 2016， 12(3):1367-1372.

[5] Rodríguez-Feo JA， Puerto M， Fernndez-Mena C， et al. A new role for reticulon-4B/NOGO-B in the intestinal epithelial barrier function and inflammatory bowel disease[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2015， 308(12): G981-993.

[6] Tian S， Guo R， Wei S， et al. Curcumin protects against the intestinal ischemia-reperfusion injury: involvement of the tight junction protein ZO-1 and TNF-α related mechanism[J]. Korean J Physiol， 2016， 20(2):147-152.

[7] Ma J， Wang P， Liu Y， et al. Krüppel-like factor 4 regulates blood-tumor barrier permeability via ZO-1， occludin and claudin-5[J]. J Cell Physiol， 2014， 229(7): 916-926.

[8] Watson AJ， Hughes KR. TNF-α-induced intestinal epithelial cell shedding: implications for intestinal barrier function[J]. Ann Y Acad Sci， 2012， 1258(1): 1-8.

[9] Du X， Meng Q， Sharif A， et al. Surfactant proteins SP-A and SP-D ameliorate pneumonia severity and intestinal injury in a murine model of staphylococcus aureus pneumonia[J]. Shock， 2016， 46(2):164-172.

[10] Moran GW， O'Neill C， Mclaughlin JT. GlP-2 enhances barrier formation and attenuates TNFα-induced changes in a Caco-2 cell model of the intestinal barrier[J]. Regul Pep， 2012， 178(1-3): 95-101.

[11] 馬遠航， 楊松巍， 孫禮剛， 等. SIRT1在TNF-α介導的腸上皮屏障破壞中的作用及機制研究[J]. 重慶醫(yī)學， 2014， 43(16): 1969-1971.

[12] Coskun M. Involvement of CDX2 in the cross talk between TNF-α and Wnt signaling pathway in the colon cancer cell line Caco-2[J]. Carcinogenesis， 2014， 35(5): 1185-1192.

[13] 劉行， 王鳳君. 緊密連接蛋白與燒傷后腸道屏障功能障礙研究進展[J]. 中華燒傷雜志， 2010， 26(5): 351-353.

[14] Feng M， Shu Y， Yang Y， et al. Ulinastatin attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis by enhancing anti-inflammatory responses[J]. Neurochem Int， 2014， 64(1): 64-72.

[15] Deng W， Abliz A， Xu S， et al. Severity of pancreatitis-associated intestinal mucosal barrier injury is reduced following treatment with the NADPH oxidase inhibitor apocynin[J]. Mol Med Rep， 2016， 14(4):3525-3534.

[16] Shikimi T， Kaku K， Uegaki J， et al. Serum contents of the free forms of alpha(1)-microglobulin and ulinastatin: relation to diseased states in patients with mood disorders[J]. Neuropsychobiology， 2001， 43(3): 145-149.

[17] 周玉坤， 李剛強. 烏司他丁對急性重癥膽管炎所致肝屏障損傷的作用和影響[J]. 肝膽胰外科雜志， 2015， 27(3): 209-213.

[18] 常瑞明， 常建星， 江志鵬， 等. 烏司他丁對心肺復蘇后大鼠腸屏障的保護作用[J]. 中華急診醫(yī)學雜志， 2015， 24(11): 1234-1238.

Protectiveeffectofulinastatinonintestinalepithelialcellbarrier

Li Yongsheng1， Ma Xiaofeng2

1.DepartmentofEmergency，GansuProvincialHospital，Lanzhou730000，China; 2.DepartmentofMedicine，GansuNationalChangfengMachineryFactoryHospital，Lanzhou730070，China

LiYongsheng，Email:zf26892@126.com

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of ulinastatin (UTI) on intestinal epithelial cell barrier.MethodsCaco-2 cells were cultured， epithelial cells monolayer models induced by tumor necrosis factor-α(TNF-α ) were established and were randomly divided into blank control group， TNF-α model group， low-dose UTI group (50 000 U/kg)， middle-dose UTI group (100 000 U/kg) and high-dose UTI group (200 000 U/kg). The transepithelial electrical resistance (TER) and fluoresce in isothiocyanate marked dextran FITC-dextran in all groups were determined by Millicell electrical resistance meter and multifunctional plate reader. Interleukin 6 (IL-6) and IL-10 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ElISA). The apoptosis rate was measured by flow cytometry， and the expression of tight junction protein occludin and ZO-1 were measured by Western blot.ResultsThe expression of TER， FITC-dextran， occludin and ZO-1 were significantly lower in TNF-α model group than those in blank control group， while IL-6， IL-10 and apoptosis rate were significantly higher (P<0.05). After UTI treatment， TER， FITC-dextran， occludin and ZO-1 were significantly higher than those in TNF-α model group， while IL-6， IL-10 and apoptosis rate were significantly lower (P<0.05). UTI change in high-dose group was the most significant (P<0.05).ConclusionUTI may protect the intestinal epithelial cell barrier injury induced by TNF-α through inhibiting the release of inflammatory mediators and regulating the expression of tight junction associated proteins.

intestines; cell mucosal barrier; tumor necrosis factor-alpha; ulinastatin; tight junction protein

李永勝，Email: zf26892@126.com

R322.45

A

1004-583X(2017)11-0953-04

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.11.009

2017-05-31 編輯:張衛(wèi)國