魏 雪，何 燕，章如松，王 璇，余 波，陳 輝，周曉軍，馬恒輝

南京市30家醫(yī)療單位病理組織處理方法調(diào)查分析

魏 雪，何 燕，章如松，王 璇，余 波，陳 輝，周曉軍，馬恒輝

醫(yī)療單位；病理組織；處理方法；調(diào)查分析；固定；脫水；透明；浸蠟

近年隨著病理技術的快速發(fā)展，病理組織處理模式已由人工操作轉(zhuǎn)為全自動密閉式組織脫水機的廣泛使用。病理組織的固定、脫水、透明以及浸透等處理已進入恒溫、恒濕的標準化和規(guī)范化操作，所有這些變化有效地提升病理組織制片的質(zhì)量。本文選取南京市30家醫(yī)療單位進行調(diào)查分析，旨在調(diào)查各單位病理組織處理的現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)可能存在的問題，以期更好的為病理組織的處理提供良好的參考依據(jù)及改進措施，共同提高病理組織處理水平。

1 材料與方法

1.1材料收集南京30家醫(yī)療單位參加調(diào)查(28家公立醫(yī)院、2家病理檢驗中心)，調(diào)查信息包括各單位詳細的組織處理程序：如組織處理溶液、組織處理方法(時間、溫度)等。分析方法以各單位為獨立的觀察單位，采用百分比統(tǒng)計分析方法進行。

1.2制備法本組所有參加調(diào)查的單位均在全自動密閉式脫水機中進行，使用自動組織處理程序。參加調(diào)查的各單位在病理組織制片流程中的每一環(huán)節(jié)所涉及的試劑全部依據(jù)龔志錦等編著的《病理組織制片和染色技術》、王伯沄等編著的《病理學技術》、仲劍平主編的《醫(yī)療護理技術操作常規(guī)》以及中華醫(yī)學會編著的《臨床技術操作規(guī)范·病理學分冊》等標準實施[1-4]。

1.3溶液選用(1)固定液：①10%中性福爾馬林：40%甲醛10份，水90份。②中性福爾馬林：甲醛液100 mL，蒸餾水900 mL，加入適量碳酸鎂或碳酸鈣作為中和劑，中和后前者約為pH 7.6，后者為pH 6.3～6.5。③中性緩沖福爾馬林：甲醛液100 mL，蒸餾水900 mL，NaH2PO4.H2O 4.0 g，Na2HPO46.5 g；使pH值達6.8～7.0。④AF液：95%或無水乙醇(A)90 mL，40%(濃)甲醛(F)10 mL。此液兼有脫水作用，固定后可直接入95%乙醇繼續(xù)脫水。⑤AAF液：95%或無水乙醇(A)90 mL，冰醋酸(A)5 mL，40%(濃)甲醛(F)10 mL。此液兼有脫水作用，冰醋酸能把未分裂細胞核的染色質(zhì)沉淀成為可以染色的塊狀體，細胞核因此被顯示清楚。(2)脫水液：梯度乙醇為70%、75%、80%、85%、95%以及無水乙醇。(3)透明液：①二甲苯。②硬脂酸熔點56～69.6 ℃。(4)浸蠟液：石蠟熔點范圍為42 ℃、54 ℃、56～58 ℃以及58～60 ℃。所選定的試劑配方要綜合考慮實際使用中的標本數(shù)量、溫度、濕度等多種因素，結合實際情況使用對照比較，選用最合適的配方。

1.4處理流程(1)固定：取材后立即固定，以抑制組織自溶，保持各種組織的原狀。(2)沖洗：常規(guī)固定液可用流水沖洗，水流不能急，緩慢沖洗。(3)脫水：是固定后組織處理的第一步，即從組織成分內(nèi)去除游離的水分和多余的固定液。(4)透明：作為脫水和浸透溶液之間的透明溶液，它既要能溶解于脫水液，又要能溶解于浸透液。(5)浸蠟：石蠟是組織實驗室最常用的滲透和包埋劑，組織需包埋于石蠟等物質(zhì)中，使液態(tài)變固態(tài)，且有一定硬度，才能用切片機切成薄片。

2 結果

2.1固定劑參加調(diào)查的30家醫(yī)療單位選用固定劑種類繁多，詳見表1。(1)使用10%福爾馬林的9家單位，6家設置甲醛液1缸，3家2缸，總時間為1～4 h，只有1家過夜。(2)使用中性甲醛液的9家單位，7家設置中性甲醛液1缸，2家2缸，總時間為1～2 h。(3)使用中性緩沖福爾馬林的4家單位，2家設置中性緩沖福爾馬林1缸，2家2缸，總時間為1～2 h。(4)使用AF液的單位1家，AF液1缸，總時間為2 h。(5)使用AAF液的單位2家，設置AAF液2缸，總時間為3 h。(6)使用甲醛/AF液的1家單位，甲醛和AF液各1缸，總時間為2 h 50 min。(7)使用甲醛/AAF液的1家單位，甲醛和AF液各1缸，總時間為2 h。(8)使用中性甲醛/AF液的單位1家，中性甲醛液設置3缸，總時間為1 h 30 min，AF液1缸，時間1 h。(9)使用中性甲醛/AAF液的單位1家，設置中性甲醛液和AAF液各1缸，總時間為2 h 30 min。(10)使用中性緩沖甲醛/AAF液的單位1家，設置中性緩沖甲醛液2缸，總時間為5 h 30 min。(11)溫度設置：1家38 ℃，1家40 ℃，余28家均為常溫。

表1 固定液的選擇

2.2脫水劑參加調(diào)查的30家醫(yī)療單位均使用乙醇作為脫水劑。(1)使用的梯度乙醇分別為70%、75%、80%、85%、95%以及無水乙醇。(2)各家單位乙醇脫水液起始濃度的選擇詳見表2。1家設置乙醇4缸，2家5缸，14家6缸，7家7缸，5家8缸，1家9缸。總時間：2家3 h，2家4 h，3家5 h，6家6 h，7家7 h，3家8 h，3家9 h，1家10 h，2家11 h，1家12 h，1家過夜。(3)溫度設置：1家35 ℃，1家40 ℃，1家50 ℃，余27家均為常溫。

表2 乙醇脫水液起始濃度的選擇

2.3透明浸蠟劑參加調(diào)查的30家醫(yī)療單位在透明和浸蠟步驟有兩種方法。(1)9家單位選擇硬脂酸和石蠟混合液透明兼浸蠟和石蠟浸蠟。正常設置分別為兩缸混合液，硬脂酸和石蠟的比列第一缸和第二缸分別為3 ∶2和2 ∶3。其中，4家單位硬脂酸石蠟混合液設置2缸、石蠟設置1缸，2家單位硬脂酸石蠟混合液設置2缸、石蠟設置2缸，1家單位硬脂酸石蠟混合液設置1缸、石蠟設置2缸，1家單位硬脂酸和石蠟混合液(硬脂酸和石蠟比例2缸均為2 ∶3)設置2缸、石蠟設置1缸，還有1家單位硬脂酸和石蠟混合液(硬脂酸和石蠟比例為3 ∶2)僅設置1缸。溫度設置3家60 ℃，3家65 ℃，2家65～70 ℃，1家70～80 ℃。(2)21家單位選擇二甲苯透明，石蠟浸蠟，其中二甲苯和石蠟的使用情況詳見表3。二甲苯溫度設置1家單位35 ℃，1家單位40 ℃，1家單位60 ℃，余18家單位常溫。(3)30家單位石蠟熔點2家為42 ℃，1家為54 ℃，2家為58～60 ℃，余25家均為56～58 ℃。(4)石蠟設置和時間，6家為2缸，總時間為3～6 h。3家為3缸，總時間為3 h。12家為4缸，總時間為1 h 30 min～6 h。(5)石蠟溫度設置詳見表4。

3 討論

病理組織切片質(zhì)量的好壞直接影響病理診斷的準確性，沒有質(zhì)量過關的病理組織切片就沒有準確的病理診斷。在病理組織切片制備過程中，雖然組織處理是最基本的操作之一，但卻是保證組織切片質(zhì)量最重要的基礎。如果前期組織處理不佳，即使后期操作規(guī)范，仍然無法制備出高質(zhì)量的病理組織切片。因此，做好組織處理是病理技術質(zhì)量控制環(huán)節(jié)中最基本且最重要的環(huán)節(jié)。

表3 二甲苯和石蠟設置

表4 石蠟溫度設置

本次調(diào)查結果顯示，目前南京市30家醫(yī)療衛(wèi)生單位已全部使用組織處理機進行組織處理，雖然有效地降低組織處理各環(huán)節(jié)中人工操作帶來的質(zhì)量不穩(wěn)定性，但依然有些單位在組織處理個別環(huán)節(jié)甚或大部分環(huán)節(jié)，存在錯誤或不規(guī)范的做法。為了規(guī)范組織處理的流程，有效地提高組織處理的技術水平，我們建議在病理組織處理環(huán)節(jié)著重注意以下幾點。(1)固定環(huán)節(jié)：能有效地保存細胞和組織成分，減少組織的損傷，是組織處理前最重要的步驟之一[1-2]。在正式開始組織處理前必須保證組織充分固定，如果組織固定不適當、不完整，制出的切片組織結構出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，此時做HE染色，組織結構模糊，細胞核質(zhì)不分明。組織中抗原物質(zhì)丟失嚴重。固定液的質(zhì)量非常重要，至少每周更換一次，使組織標本能夠徹底固定。固定液陳舊、改變其pH值呈中性或弱堿性的性質(zhì)，發(fā)生酸化對組織中酶的活性有影響[3]。4%甲醛液存放一段時間后極易氧化產(chǎn)生甲醛，呈酸性，不宜固定標本，而采用中性福爾馬林具有良好的固定作用，穿透速度快，組織硬化程度小[4]，其細胞形態(tài)保存良好，層次分明，基本無萎縮。(2)脫水環(huán)節(jié)：乙醇脫水能力強，在脫水過程中繼續(xù)硬化組織，是一種優(yōu)良脫水劑。但高濃度乙醇對組織有強烈收縮、硬化作用，因此在脫水過程中一般從低濃度開始，逐步遞進其濃度。有文獻報道[5]將此類組織塊用二甲苯多次脫蠟后，入梯度乙醇直至水化，再重新脫水有一定效果。故宜及時固定組織，更換試劑，掌握好脫水時間，延長組織在95%乙醇中的脫水時間，做到徹底脫水。含蠟組織塊脫水不足是指處理病理標本時組織塊脫水不盡而被浸蠟甚至包埋，以致石蠟不能完全浸透組織，失去應有的支持作用，表現(xiàn)為含蠟組織塊發(fā)軟，制成蠟塊后組織塊與周邊石蠟容易發(fā)生脫離，此種蠟塊往往難以切出組織薄片，即使強行切出也會出現(xiàn)組織擠壓、破碎，影響病理診斷。在組織脫水環(huán)節(jié)，所有單位均采用乙醇作為脫水劑，乙醇與水呈完全互溶性質(zhì)，乙醇較為經(jīng)濟，適合優(yōu)選為常規(guī)組織脫水劑[6]。組織脫水時間在低濃度乙醇中可以長些，盡量避免在高濃度的乙醇如無水乙醇中停留的時間過長，否則會造成組織過硬、扭曲，影響切片[5,7]，影響病理醫(yī)師閱片。(3)透明環(huán)節(jié)：9家(30%)單位選擇硬脂酸和石蠟混合液透明，21家(70%)單位選擇二甲苯透明石蠟浸蠟透明。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)選用硬脂酸和石蠟混合液作為透明浸蠟劑，硬脂酸的含量不易控制，特別對于含脂肪較多的組織，使用硬脂酸取代二甲苯易發(fā)生脫片[8]，不能保證制片質(zhì)量的穩(wěn)定性。處理的組織倘若硬脂酸置換不徹底，在展片中會出現(xiàn)組織在水中離散及免疫組化染色掉片的問題。經(jīng)二甲苯處理的組織容易發(fā)脆、發(fā)硬，特別是子宮肌瘤、子宮頸、甲狀腺的血凝塊、淋巴結等組織，切片易出現(xiàn)“搓衣板樣”或“百葉窗樣”，經(jīng)硬脂酸石蠟混合液處理則不存在該現(xiàn)象。組織未及時固定引起組織腐敗、干燥；組織塊過厚或所取組織太多；脫水液濃度不能達標或容量過少；用于透明的二甲苯內(nèi)混有少量雜質(zhì)(如酒精、水等)；用于浸蠟的液狀石蠟內(nèi)混有大量雜質(zhì)等以上情況均會造成組織塊浸蠟不徹底。及時檢查所收標本的狀況，包括固定液的種類、濃度及量；及時更換脫水所用的酒精、透明用的二甲苯及用于浸蠟的液體石蠟；必要時重新取材或重新浸蠟及時補救。(4)浸蠟環(huán)節(jié)：選擇石蠟需要質(zhì)純，無氣泡和雜質(zhì)，有適度的黏韌性。石蠟分為軟蠟(熔點50～54℃)和硬蠟(熔點56～60 ℃)。軟蠟多用于組織浸透，硬蠟多用于組織包埋。夏季室溫高時可選用熔點較高的硬蠟，在冬季室溫低時可選用熔點較低的軟蠟。一般情況下，太硬切片時容易破碎，不易切成蠟帶；反之，如采用的石蠟太軟時，切片常皺縮，難以成蠟帶，貼片時也難把切片攤平。組織浸蠟時，最好采用熔點為54 ℃的軟蠟。一般組織浸蠟時間為2～4 h。

本次調(diào)查針對組織處理的附加方法如攪拌、加壓和試劑質(zhì)控等數(shù)據(jù)，因文章篇幅有限未及涵蓋。

(本文獲得南京市30家醫(yī)療單位病理技術同行的大力支持和幫助，特此致謝！)

[1] 龔志錦，詹镕洲，著. 病理組織制片和染色技術[M]. 上海：上海科學技術出版社，1994:16-20.

[2] 仲劍平. 醫(yī)療護理技術操作常規(guī)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2003:1985-1988.

[3] 王伯沄，李玉松，黃高異，等. 病理學技術[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2000:67-82,129.

[4] 中華醫(yī)學會，編著. 臨床技術操作規(guī)范·病理學分冊[M]. 北京:人民軍醫(yī)出版社, 2004:1-26.

[5] 馬恒輝，周曉軍. 組織切片常見問題與對策[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2009,25(2):211-214.

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[7] 趙寶忠，張立華，李恩鴻. 病理組織脫水劑及組織脫水工藝的再認識[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2011,27(4):438.

[8] 周 茜. 環(huán)保醇性組織固定液和硬脂酸石蠟混合液制片的探討[J]. 診斷病理學雜志, 2012,19(2):157.

時間：2017-9-18 6:23 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.029.html

R-33

B

1001-7399(2017)09-1049-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.029

接受日期：2017-06-26

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院病理科，南京 210002

魏 雪，女，技師。E-mail: 554685825@qq.com

馬恒輝，男，副主任技師，通訊作者。E-mail: mafanbushao@163.com