張俊+李偉+張靜+申莉莉+王鳳龍+章松柏+楊金廣

摘要：2016年6月從青島即墨市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗(yàn)基地采集疑似感染番茄黃化曲葉病毒的煙葉樣品。提取病葉總DNA，使用雙生病毒（Geminivirus）通用引物PA/PB對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，感病葉片DNA僅檢測出番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，簡稱TYLCV）；根據(jù)測定的部分序列片段，設(shè)計(jì)了1對全長序列背向引物，對其基因組全長進(jìn)行克隆測定。結(jié)果顯示，該病毒核酸為單鏈環(huán)狀 DNA，基因組為單一組分 DNA-A，經(jīng)過分子比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，TYLCV-SDQDJM（GenBank：KY640456）與山東省濰坊市番茄分離物TYLCV、山東省泰安市番茄分離物TYLCV同源性最高為99%，與已經(jīng)報(bào)道的其他地區(qū)TYLCV分離物同源性均在97%以上，因此確定從青島即墨市采集的煙草矮化病毒癥狀煙株是由TYLCV侵染所致；同時(shí)采集了發(fā)病植株以及周邊蔬菜保護(hù)地部分蔬菜上的煙粉虱成蟲進(jìn)行檢測，其中15.0%的煙粉虱樣品檢出番茄黃化曲葉病毒，因此明確了侵染該地區(qū)煙草的番茄黃化曲葉病毒是由帶毒煙粉虱傳播的。

關(guān)鍵詞：番茄黃化曲葉病毒；煙草；煙粉虱；分子鑒定；全基因組序列分析

中圖分類號： S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0050-04

收稿日期：2016-03-13

基金項(xiàng)目：中國煙草總公司重大專項(xiàng)[編號：110201601024（LS-04）]；山東省自然科學(xué)基金（編號：ZR2015YL065、ZR2014CQ025）；紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（編號：HYHH2016YL02）。

作者簡介：張 ?。?993—），男，湖北松滋人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊《颈O(jiān)測。E-mail：191172885@qq.com。

通信作者：章松柏，博士，副教授，研究方向?yàn)椴《颈O(jiān)測與分子病毒學(xué)，E-mail：yangtze2008@126.com；楊金廣，博士，副研究員，研究方向?yàn)闊煵莶《静【C合防治與分子病毒學(xué)，E-mail：yangjinguang@caas.cn。 煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其病毒病的危害是最為嚴(yán)重的。煙草病毒病曾相繼在世界各主產(chǎn)煙區(qū)暴發(fā)流行，每年給煙草生產(chǎn)帶來重大損失，嚴(yán)重影響煙葉的品質(zhì)，給煙農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。2016年6月，青島即墨市煙田發(fā)現(xiàn)了部分煙株表現(xiàn)矮小，葉片黃化上卷，呈現(xiàn)皺縮癥狀，推測該煙株疑似感染雙生病毒（Geminivirus）。該病毒病在我國西南煙區(qū)發(fā)生尤為普遍，特別是在部分煙區(qū)的冬春煙墑危害嚴(yán)重，例如在廣西省百色煙區(qū)冬春煙上發(fā)病率超過60%，給當(dāng)?shù)責(zé)熑~生產(chǎn)造成極大損失，直接導(dǎo)致百色煙區(qū)冬春煙的絕產(chǎn)，促使了百色煙區(qū)煙葉種植模式的調(diào)整[2]。

作為菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）的典型代表，番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，簡稱TYLCV）是由煙粉虱（Bemisia tabaci） 傳播的一種雙生病毒，其病原是具有孿生顆粒形態(tài)的植物病毒，核酸為單鏈環(huán)狀 DNA，基因組為單一組分 DNA-A[3]，在實(shí)際生產(chǎn)中，主要通過煙粉虱在番茄和辣椒等蔬菜作物上傳播危害，每年給蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。近年來，該病毒傳播介體煙粉虱在山東省煙區(qū)危害較為嚴(yán)重，在濰坊、臨沂、日照、青島等市煙區(qū)均存在不同程度的發(fā)生，而該病毒侵染引起的病毒病田間癥狀鮮見發(fā)生。本研究首次明確了山東省青島即墨市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗(yàn)基地?zé)熖镏幸伤瓢療熤晔鞘躎YLCV侵染所致。筆者對采集的病樣進(jìn)行了病原分子鑒定，對分離物全基因組進(jìn)行克隆和序列分析，同時(shí)采集發(fā)病煙田及周邊保護(hù)地內(nèi)的煙粉虱，利用雙生病毒通用引物對采集到的煙粉虱樣品進(jìn)行檢測，明確了該病毒在青島煙區(qū)的傳播途徑，為該病毒病的精準(zhǔn)測報(bào)和防控提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病樣品采集 待測樣品于2016年6月采自山東省青島即墨市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗(yàn)基地?zé)熖?，煙粉虱成蟲樣品采自試驗(yàn)基地?zé)熖?、周邊保護(hù)地蔬菜及雜草上，成蟲數(shù)量約600頭，每組10頭，分為60組，置于-80 ℃保存待用。本試驗(yàn)中以采自山東省壽光市的TYLCY侵染的番茄植株作為陽性對照，以健康煙草植株為陰性對照。

1.1.2 相關(guān)試劑材料 DNA提取試劑盒（Plant Genomic DNA Kit），昆蟲基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit），膠回收試劑盒，克隆載體（pEASY-Blunt Simple Cloning Kit）以及感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物有限公司；Prime STAR Max Premix（2×）以及DL2000 DNA Maker購自TaKaRa公司。其他常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取，PCR擴(kuò)增及目的基因的連接、克隆、測序 使用植物DNA提取試劑盒（Plant Genomic DNA Kit）提取病樣總DNA。使用昆蟲基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）提取煙粉虱樣品總DNA。使用檢測雙生病毒的通用引物PA/PB進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的序列經(jīng)Blast程序與GenBank中已經(jīng)上傳的TYLCV的DNA-A序列進(jìn)行比對，確定病樣感染番茄黃化曲葉病毒后，根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的TYLCV全序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)1對全長序列背向引物擴(kuò)增病毒DNA-A全序列，所用引物詳見表1。擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，將目的條帶進(jìn)行膠回收純化，回收產(chǎn)物克隆到pEASY-Blunt載體上。待克隆檢測為陽性重組質(zhì)粒后，委托上海生工青島測序部進(jìn)行測序。endprint

1.2.2 序列分析 將測序后得到的序列通過Blast程序進(jìn)行比對，在NCBI上選取同源性最高的TYLCV分離物全基因組，利用DNAMAN軟件進(jìn)行一致率分析，使用SnapGene軟件對樣品基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。選取山東省TYLCV分離物和部分有代表性分離物的全基因組序列為對照，利用MEGA 51中的鄰接法，對青島即墨市的TYLCV分離物全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析[5-7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙生病毒通用引物PCR檢測結(jié)果

以提取煙草病株葉片DNA為模板，利用雙生病毒通用引物PA/PB進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物為約500 bp大小的特異性條帶（圖1），經(jīng)克隆、測序、Blast程序比對，發(fā)現(xiàn)青島即墨市感病煙葉樣品擴(kuò)增出的基因片段與GenBank已經(jīng)登錄的部分地區(qū)TYLCV分離物的同源性達(dá)到98.0%以上。因此，筆者初步確定該樣品感染了TYLCV。

2.2 病毒分離物DNA-A全序列的克隆與序列分析

2.2.1 病毒分離物DNA-A全序列的克隆 利用設(shè)計(jì)的全長序列背向引物對感病樣品的DNA-A全序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物為約2 800 bp大小的特異性條帶（圖2）。經(jīng)克隆、測序后結(jié)果表明，青島即墨市煙草分離物TYLCV-SDQDJM序列全長為2 781個(gè)核苷酸。該序列為閉合環(huán)狀單鏈DNA，

共6個(gè)ORF，具有菜豆金色花葉病毒屬病毒基因組典型特征。圖4顯示，這6個(gè)開放閱讀框分別是AV1基因（308～1 084 nt，編碼外殼蛋白）、AV2基因（148～498 nt，編碼和病毒移動(dòng)相關(guān)蛋白）以及位于互補(bǔ)鏈上的AV1基因（1 542～2 615 nt，編碼復(fù)制酶）、AV2基因（1 226～1 633 nt，編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白）、AV3基因（1 081～1 485 nt，編碼增強(qiáng)復(fù)制的蛋白）和AV4基因（2 171～2 464 nt）。通過Blast比對發(fā)現(xiàn)山東省青島即墨市煙草上的分離物TYLCC-QDJM與山東省濰坊市番茄上的分離物TYLCV-SDWF-L7（GenBank：KC999850.1）、云南省 TYLCV-YN4392（GenBank：KU934104.1）、海南省 TYLCV-HNJZ19（GenBank：KX034543.1）的同源性最高為99%。與來自中國不同地區(qū)的TYLCV分離物的同源性均在98%以上。

2.2.2 序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 利用DNAMAN軟件，將擴(kuò)增測序得到的TYLCV-SDQDJM分離物的DNA-A全序列與國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的具有代表性的TYLCV分離物全序列進(jìn)行比對，得出核苷酸的一致率。同時(shí)，將其與GenBank中已經(jīng)登錄的侵染煙草的其他DNA病毒全序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，TYLCV-QDJM DNA-A與來自中國不同地區(qū)的TYLCV分離物的一致率均在97%以上，其中與山東省濰坊市和山東省泰安市的分離物一致率最高，為99%，與山東省其他地區(qū)以及國內(nèi)其他省份還有國外部分地區(qū)報(bào)道的番茄黃化曲葉病毒一致率都在97%以上。而與侵染煙草的其他DNA病毒序列比對發(fā)現(xiàn)，該煙草病毒樣品與中國番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl China virus，簡稱TYLCCNV）、番茄曲葉病毒（tomato leaf curl China virus，簡稱ToLCCNV）、煙草曲葉病毒（tobacco leaf curl virus，簡稱TbLCV）、煙草曲莖病毒（tobacco curl shoot virus，簡稱TbCSV）、番茄黃化曲葉撒丁尼亞病毒（tomato yellow leaf curl Sardinia virus，簡稱TYLCSV）[8]的一致率都在76%以下。因此，該病毒分離物為番茄黃化曲葉病毒的一個(gè)分離物（TYLCV-SDQDJM）。

為進(jìn)一步分析青島即墨市煙草TYLCV-QDJM分離物與已經(jīng)報(bào)道的各TYLCV分離物及侵染煙草的其他DNA病毒的親緣關(guān)系，本研究選取了來自國外12個(gè)國家以及國內(nèi)12個(gè)地區(qū)的TYLCV代表分離物，同時(shí)選取了國內(nèi)外不同地區(qū)已經(jīng)報(bào)道的侵染煙草的其他5類DNA病毒作為外組利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[9]。從該系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）可以看出，SDQDJM與來自中國的12個(gè)分離物以及國外的8個(gè)分離物親緣關(guān)系較近，并聚在一個(gè)大的分支。其中 TYLCV-SDQDJM與TYLCV-SDWF78親緣關(guān)系最近，位于一個(gè)小分支上，而與科威特分離物（TYLCV-KISR4）、阿曼分離物（TYLCV-BidBid）、伊朗分離物（TYLCV-Ir2）以及沙特阿拉伯分離物（TYLCV-Jeddah）親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。同時(shí)，由圖5還可以看出，侵染煙草的其他雙生病毒分離物位于外族分支上，其中番茄黃化曲葉撒丁尼亞病毒意大利分離物（TYLCSV-Sar-[IT：Sic：04]）與番茄黃化曲葉病毒沙特阿拉伯分離物（TYLCV-Jeddah）位于一個(gè)小分支上。

2.3 煙粉虱體內(nèi)TYLCV檢測鑒定

將試驗(yàn)基地?zé)熖锛爸苓吺卟吮Ｗo(hù)地部分蔬菜上捕獲的煙粉虱樣品以每組10頭，共分為60組，提取煙粉虱樣品DNA作為模板，使用雙生病毒通用引物PA/PB進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共計(jì)9組樣品擴(kuò)增得到大小約為500 bp的特異性條帶（圖3），經(jīng)測序后使用Blast程序比對，最終確定15.0%的煙粉虱樣品攜帶TYLCV。值得注意的是，利用雙生病毒通用引物PA/PB，只檢測到了TYLCV，并沒有檢測到其他雙生病毒種類，說明青島地區(qū)可能僅有一種雙生病毒危害。

此次危害當(dāng)?shù)責(zé)煵莸臒煼凼饕荁型煙粉虱[10]，而山東省當(dāng)?shù)貜V泛種植的大棚蔬菜給煙粉虱提供了很好的越冬場所，5—11月進(jìn)入煙粉虱危害嚴(yán)重時(shí)期，而隨著山東省近年來保護(hù)地蔬菜種植規(guī)模的擴(kuò)大，栽培方式多樣，種類增多，給煙粉虱提供了豐富的寄主范圍和適宜的生長環(huán)境，有利于煙粉虱越冬，為來年雙生病毒的傳播提供了良好的生境。先前報(bào)道表明，近幾年TYLCV在山東省本地番茄上危害十分嚴(yán)重，各地均有報(bào)道，而煙粉虱寄主范圍十分廣泛，可危害74科600種植物[11]。因此筆者推測，本次采集到的煙粉虱在取食本地TYLCV侵染的蔬菜時(shí)，成功獲取并攜帶TYLCV，隨著正常的遷飛過程進(jìn)入青島即墨市煙田，開始取食煙草幼嫩煙葉，隨著口針穿過煙葉表皮細(xì)胞和薄壁細(xì)胞，其攜帶的TYLCV成功通過煙粉虱的傳播侵染了當(dāng)?shù)責(zé)煵?。endprint

3 結(jié)論與討論

山東省煙區(qū)是我國老煙區(qū)之一。近年來，隨著農(nóng)業(yè)耕作結(jié)構(gòu)的調(diào)整，特別是保護(hù)地栽培的廣泛發(fā)展，使山東省煙區(qū)病毒病種類發(fā)生了較大變化。通過近5年煙草病蟲害預(yù)測預(yù)報(bào)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)分析，煙粉虱作為煙草上的主要害蟲在山東省煙區(qū)發(fā)生越來越重，已經(jīng)上升為僅次于蚜蟲的刺吸式害蟲，但煙粉虱傳播的雙生病毒在山東省煙草上鮮見發(fā)生，主要報(bào)道集中在保護(hù)地栽培的番茄上[9]。本研究首次報(bào)道了山東省青島市煙草上發(fā)現(xiàn)的植株矮化和葉片皺縮的煙株是由煙粉虱傳播的TYLCV侵染所致。通過對山東省青島即墨市煙草病毒分離物DNA-A的全序列分析，明確了該分離物為番茄黃化曲葉病毒的一個(gè)分離物。該分離物與山東?。▔酃猓㏕YLCV同源性達(dá)到了99%，而與山東省以外的其他TYLCV分離物同源性較小，表明TYLCV在遺傳進(jìn)化上表現(xiàn)出一定的地理隔離。通過檢測即墨市周邊保護(hù)地部分蔬菜上的煙粉虱，發(fā)現(xiàn)采集到的15.0%煙粉虱樣品攜帶TYLCV，表現(xiàn)TYLCV具備潛在大發(fā)生的危險(xiǎn)，應(yīng)引起當(dāng)?shù)刂参锉Ｗo(hù)從業(yè)者的警惕，提前做好治蟲防病措施，以防該病毒病暴發(fā)成災(zāi)。

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