趙莉媛 呂奇鵬

(1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,青海湟源 512100;2.西寧市野生動(dòng)物園,青海西寧 510005)

螺旋桿菌的檢測(cè)以及它對(duì)小鼠肝臟的影響

趙莉媛1呂奇鵬2

(1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,青海湟源 512100;2.西寧市野生動(dòng)物園,青海西寧 510005)

近年來,螺旋桿菌的感染有上升的趨勢(shì),越來越引起臨床的重視,實(shí)驗(yàn)室采取的鑒定方法尤為重要。目前用的比較多的有微生物分離培養(yǎng),血清學(xué)方法,形態(tài)學(xué)方法,PCR檢查。在過去的十幾年中,從小鼠體內(nèi)能分離出來的螺旋桿菌大致有五種,本文主要涉及肝型和膽囊型螺旋桿菌的PCR鑒定。此外,由于感染螺旋桿菌的小鼠并不一定就患有疾病,通常在體外沒有明顯的臨床癥狀,研究人員目前還未深究它在體內(nèi)是否帶來影響,因此本文也會(huì)討論螺旋桿菌對(duì)小鼠肝臟的影響。

螺旋桿菌;小鼠;鑒定;PCR;影響;肝臟

1 螺旋桿菌鑒定方法簡(jiǎn)介

由于HP與人類常見病密切相關(guān)且在人群中感染率高，因而受到重視，各種檢測(cè)方法也應(yīng)運(yùn)而生，常用的檢測(cè)方法有微生物學(xué)方法，血清學(xué)方法，形態(tài)學(xué)方法和PCR法，但各種檢測(cè)方法都不盡理想，本文主要介紹PCR法。此方法原理就是基因診斷，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA來判斷是否帶有螺旋桿菌。是目前靈敏度最高的，檢測(cè)速度最快的，使用最廣的檢測(cè)螺旋桿菌的方法。

2 螺旋桿菌感染對(duì)肝臟的影響

螺桿菌感染與肝腸疾病有關(guān)，大多數(shù)新螺桿菌屬成員都是先在動(dòng)物及禽類等體內(nèi)分離出來的，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)腸道螺桿菌能夠進(jìn)入血液，易位至肝臟引起炎癥和腫瘤，這在免疫力低下機(jī)體內(nèi)更為常見。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 實(shí)驗(yàn)步驟（感染螺旋桿菌的小鼠若干只）

3.1.1 病鼠外觀及剖檢變化：病鼠頸部、背部、大腿外側(cè)被毛脫落，脖頸部皮膚出現(xiàn)不規(guī)則潰爛；眼球突出，晶體渾濁，似失明；頜下淋巴結(jié)腫大并有針尖大小出血點(diǎn)；胃粘膜出現(xiàn)潰瘍，伴有針尖大小出血點(diǎn)；肝臟腫大，有灰白色大小不等壞死灶；脾臟腫大，色素沉著，有灰白色大小不等壞死灶；直腸脫落，腸粘膜出血；肛周潰爛，排便困難，糞便干燥帶血成顆粒狀。

3.1.2 細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)：分別取病鼠肝臟、直腸、回盲部?jī)?nèi)容物，加入2號(hào)營(yíng)養(yǎng)肉湯（已加相關(guān)抗生素，為選擇性培養(yǎng)基），用研磨器勻化后，1000r離心5 min，棄沉淀；上清經(jīng)0.45 m微孔濾膜過濾后，12000r離心2 min；棄上清，沉淀以100 uL的2號(hào)營(yíng)養(yǎng)肉湯懸浮混勻；移取5Oμl樣本接種血平皿。血平皿中添加10μg/ml萬古霉素；2.5μg/ml多粘菌素B；5μg/ml甲氧芐氨嘧啶；2μg/ml兩性霉素。37℃ 微需氧環(huán)境（85%N，10%CO2，5%O2）培養(yǎng)4～6d。

3.1.3 細(xì)菌分離：螺旋桿菌的菌落形態(tài)很特殊，在培養(yǎng)平皿上菌落如針尖狀，折光呈紅色；經(jīng)革蘭染色呈陰性，油鏡下觀察呈月牙形或鳥翼狀的獨(dú)特形態(tài)。將分離菌株純化后做生化分析。

3.1.4 螺旋桿菌DNA提?。航?jīng)形態(tài)觀察診斷為螺旋桿菌，刮下其平皿中的菌落，用“小量細(xì)菌DNA抽提試劑盒”純化提取細(xì)菌DNA。

3.1.5 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定：引物o508，o509的擴(kuò)增條件：22μl反應(yīng)體系中包括2μlDNA模版；10X PCR Buffer II2.2μl；20 mM forward o508 1.1μl；20 mM reverse o509 1.1μl；5 U/ml HOTSTAR Taq 0.12μl；orange dye 3.32μl；2.5 mM dNTP 1.76μl；25mM MgCl2 2.2μl；Q Buffer 2.2ul；H2O 6μl；擴(kuò)增程序：95℃15 min；94℃ 30 sec；60℃ 30 sec；72℃ 1min；循環(huán)35次后72℃2min；擴(kuò)增產(chǎn)物分析：反應(yīng)結(jié)束后，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。在紫外燈下觀察，使用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將陽(yáng)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后分別送去測(cè)序。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 細(xì)菌學(xué)檢查：從病鼠的肝、腸樣本中均分離到疑似菌株。革蘭氏染色結(jié)果形狀為鳥翼狀。在哥倫比亞血瓊脂平板上，分離菌株為灰白色、半透明、微凸起、不溶血的小菌落。純培養(yǎng)物經(jīng)革蘭染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性細(xì)小螺旋桿狀細(xì)菌，直徑為0.2～1.5μm。各項(xiàng)生化反應(yīng)結(jié)果經(jīng)鑒定完全符合肝螺桿菌的特性。

3.2.2 PCR檢測(cè)：如圖1。測(cè)序結(jié)果顯示：肝螺桿菌鼠源性分離菌株與Genbank中肝螺桿菌相應(yīng)的基因序列核苷酸同源性高達(dá)99%。

圖1 PCR擴(kuò)增螺旋桿菌屬16s rRNA與肝螺桿菌16S rRNA基因

3.2.3 病理組織學(xué)檢查：感染小鼠肝臟的肝細(xì)胞腫大，出現(xiàn)大小不等的空泡，部分胞核深染，局部壞死，肝小葉脂肪變性。淋巴細(xì)胞散在分布，脾巨噬細(xì)胞增多小葉間隔不清晰。

4 結(jié)論

本研究選用了適篩檢肝螺桿菌的分離培養(yǎng)的方法，建立了肝螺桿菌的多重PCR檢測(cè)方法，并結(jié)合病理學(xué)檢查方法，對(duì)該菌的生物學(xué)特性和分子生物學(xué)特性進(jìn)行初步探討，這為進(jìn)一步研究肝螺桿菌的致病機(jī)理及在我國(guó)開展流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的科學(xué)依據(jù)。

[1]徐叔云主編.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M.]人民衛(wèi)生出版社，1982.

[2]施新猷.大鼠各型放射病時(shí)心血管功能的變化[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，1985，5（3）：160.

[3]施新猷.現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中的應(yīng)用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1982，3（2）：177.