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        快速檢測鯉春病毒血癥熒光RT-PCR方法的建立與應(yīng)用

        2017-11-17 06:27:02肇慧君
        獸醫(yī)導(dǎo)刊 2017年14期
        關(guān)鍵詞:病毒血癥鯉魚特異性

        吳 斌 王 紅 張 琳 肇慧君

        (1.遼寧出入境檢驗檢疫局,遼寧大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué),遼寧大連 116044)

        快速檢測鯉春病毒血癥熒光RT-PCR方法的建立與應(yīng)用

        吳 斌1王 紅2張 琳1肇慧君1

        (1.遼寧出入境檢驗檢疫局,遼寧大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué),遼寧大連 116044)

        本文建立快速檢測鯉春病毒血癥的熒光RT-PCR方法。利用同一對引物和探針,以梯度稀釋的方法測定熒光RT-PCR法針對SVCV的靈敏性、特異性及重現(xiàn)性。熒光RT-PCR方法能夠檢測出104倍稀釋的SVCV,靈敏度性高。同時,該方法的特異性很強(qiáng),對其他病毒,如傳染性胰腺壞死病毒(IPNV)、傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)、病毒性出血敗血病毒(VHSV)均未有擴(kuò)增反應(yīng)。方法的重現(xiàn)性也較好。熒光RT-PCR具有較高的靈敏度特異性和重現(xiàn)性,在魚類疫病的早期快速診斷方面具有重要作用。

        鯉春病毒血癥(SVC);熒光RT-PCR;靈敏性;特異性;重現(xiàn)性

        鯉春病毒血癥(Spring Viraemia of Carp,SVC)又稱鯉魚傳染性腹水癥,是一種急性、出血性、傳染性敗血病[1]。該病可以危害鯉魚、鯰魚、鯽魚、鰱魚、鳙魚等[2],在歐、亞兩洲均有流行。鯉春病毒血癥是魚類口岸檢疫的第一類檢疫對象,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為需要向申報的疫病,我國農(nóng)業(yè)部定為一類動物疫病。熒光RT-PCR法能夠簡單方便、特異性的、高靈敏性的定量病毒RNA,由于不用處理PCR產(chǎn)物,檢測過程中污染和假陽性出現(xiàn)的概率得到了有效的降低,檢測效率得到了極大的提高,而且通過融解曲線、探針等方式還可以防止非特異性擴(kuò)增,故熒光RT-PCR法正在逐漸取代常規(guī)RT-PCR法。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 病毒

        實驗所用的病料、細(xì)胞系(鯉魚上皮瘤細(xì)胞EPC等)、病毒(鯉春病毒SVCV、傳染性胰臟壞死病毒IPNV、傳染性造血器官壞死病毒IHNV、病毒性出血性敗血病毒VHSV)等均為本實驗室保存。

        1.1.2 儀器和試劑

        儀器:LC480Real-time RT-PCR System;

        試劑:One step prime script RT-RT-PCR kit,購自寶生物(大連)有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 引物和探針的設(shè)計

        選取SVCV的糖蛋白基因,由寶生物(大連)有限公司合成,序列如表1所示。

        1.2.2 RNA的提取

        按照寶生物試劑盒提取。將提取的RNA作為原始模板,分別稀釋107,106,105,104,103,102,101倍,于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 熒光RT-PCR試驗

        將SVCV稀釋模板107、106、105、104、103、102、101、NTC(H2O)進(jìn)行實驗,重復(fù)四次,得到擴(kuò)增曲線及Ct值。

        1.2.4 樣品檢測

        通過飼料浸毒、1:5000飼養(yǎng)水投毒、人工注射背鰭三種方式進(jìn)行人工感染鯉魚魚苗,選取出現(xiàn)SVCV典型病癥的病魚兩條,進(jìn)行驗證。

        1.2.5 數(shù)據(jù)分析

        利用SDS軟件對建立的熒光RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,查看擴(kuò)增曲線及Ct值,在結(jié)果的判斷過程中,主要以擴(kuò)增曲線是否為“S”型和熒光值的大小作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 靈敏性實驗結(jié)果

        將SVCV樣本進(jìn)行10倍系列稀釋,每個稀釋度做4個平行,進(jìn)行熒光RT-PCR試驗。圖1表示SVCV各個稀釋度的擴(kuò)增曲線。其中X軸代表PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù),Y軸代表熒光信號強(qiáng)度。從圖1中可以看出,SVCV稀釋度107-101的7個數(shù)量級范圍內(nèi)的熒光RT-PCR均有“S”型擴(kuò)增曲線,反映了PCR的指數(shù)增長期、線性增長期、平臺期三個階段,并且陰性對照沒有擴(kuò)增。同時,每個稀釋度的4個平行擴(kuò)增曲線基本吻合,表明實驗的重復(fù)性很好。圖1表示SVCV的101CT值為32.48,有典型的擴(kuò)增曲線,因此可初步判定檢測低限大于101。

        圖1 SVCV熒光RT-PCR的擴(kuò)增曲線

        表1 SVCV引物和探針序列

        2.2 特異性實驗結(jié)果

        以SVCV、IPNV、VHSV、IHNV的核酸作為模板,進(jìn)行熒光RT-PCR檢測。結(jié)果如圖2所示,本實驗針對SVCV糖蛋白基因設(shè)計的引物和Tagman探針能夠特異性地檢測出SVCV,而不能檢測出其他三種病毒。

        圖2 SVCV特異性檢測結(jié)果

        2.3 重現(xiàn)性實驗結(jié)果

        經(jīng)過8次重現(xiàn)試驗得到熒光RT-PCR檢測結(jié)果,如表2所示。由表2可知,8次重復(fù)性試驗得到Ct值的標(biāo)準(zhǔn)誤差在0.36~1.31之間,誤差較小,表明本文建立的熒光RT-PCR方法重現(xiàn)性較好。

        表2 SVCV重現(xiàn)性實驗結(jié)果(mean±SE)

        2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

        進(jìn)一步分析擴(kuò)增曲線,發(fā)現(xiàn)指數(shù)增長期的曲線平行,反映了PCR擴(kuò)增效率相近;而不同稀釋度之間的CP相差均勻,符合熒光RT-PCR的CP值與起始拷貝數(shù)之間嚴(yán)格的線性關(guān)系。根據(jù)拷貝數(shù)與CP值的相關(guān)性,由LightCycler480 Software1.5軟件直接得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖3。橫坐標(biāo)代表質(zhì)粒稀釋度的對數(shù)值(X),縱坐標(biāo)為CP值。圖3為軟件生成的SVCV標(biāo)準(zhǔn)曲線,拷貝數(shù)(X)與CP(Y)值得關(guān)系為:CP=-3.33lgX+32.00,其擴(kuò)增效率為1.882,Error為0.0297。CP值與濃度的對數(shù)值均有非常好的線性關(guān)系,以4次重復(fù)性實驗結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,主要是避免實驗操作、設(shè)備等因素對實驗結(jié)果的影響。

        圖3 SVCV 熒光RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.5 樣品檢測

        采用本文建立的熒光RT-PCR法對人工感染鯉魚進(jìn)行檢測。以質(zhì)粒、病毒RNA、人工感染鯉魚組織RNA、水,分別作為陽性對照、樣本、陰性對照和空白對照,防止出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。結(jié)果表明,陽性對照出現(xiàn)典型的“S”擴(kuò)增曲線,而陰性對照和空白對照均沒有出現(xiàn)擴(kuò)增,對照組實驗均成立,可排除假陽性、假陰性結(jié)果。圖4中,人工感染鯉魚組織RNA均出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線,其CP值分別為18.22、21.04,利用圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線可計算出人工感染的鯉魚中SVCV含量為104.14和103.29。

        圖4 人工感染SVCV鯉魚檢測結(jié)果

        3 結(jié)論

        傳統(tǒng)的SVCV診斷方法是對病毒先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),再通過ELISA等方法進(jìn)行鑒定,這些方法往往耗時較長,而SVCV難以制備高效價抗體[5]。開發(fā)快速靈敏、能夠定量檢測病毒的方法,不僅對疾病的診斷,也為在分子水平上研究病毒感染,包括流行病學(xué),發(fā)病機(jī)制和宿主細(xì)胞相互作用等各個方面具有重要意義。本文中的熒光RT-PCR檢測方法,操作簡單、速度快、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、特異性高。該方法可在短時間內(nèi)進(jìn)行大批量樣品的檢測,非常適合魚類病毒的快速檢測。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,可以對SVCV進(jìn)行早期診斷,及時切斷其傳播途徑,從而保護(hù)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

        [1]景宏麗,張昊,王娜,等.鯉春血癥病毒單克隆抗體建立及免疫學(xué)特性鑒定[J].檢驗檢疫學(xué)刊,2014,(3):55-59.

        [2]Reschova S,Pokorova D,Nevorankova Z,et al.Detection of spring viraemia of carp virus(SVCV)with monoclonal antibodies[J].Veterinarni Medicina,2007,(7):308-316.

        [3]徐敏,向華.流感病毒核酸檢測方法研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(1):89-92.

        [4]高隆英,史秀杰,劉葒,等.用RT-PCR法快速檢測鯉春病毒血癥病毒基因[J].水生生物學(xué)報,2002,(26):452-456.

        國家質(zhì)檢公益項目(201410059)

        吳斌(1968—),女,遼寧大連人,博士研究生,研究員,主要從事水生動物疫病研究。

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