吳 斌 王 紅 張 琳 肇慧君

(1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué),遼寧大連 116044)

快速檢測(cè)鯉春病毒血癥熒光RT-PCR方法的建立與應(yīng)用

吳 斌1王 紅2張 琳1肇慧君1

(1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué),遼寧大連 116044)

本文建立快速檢測(cè)鯉春病毒血癥的熒光RT-PCR方法。利用同一對(duì)引物和探針,以梯度稀釋的方法測(cè)定熒光RT-PCR法針對(duì)SVCV的靈敏性、特異性及重現(xiàn)性。熒光RT-PCR方法能夠檢測(cè)出104倍稀釋的SVCV,靈敏度性高。同時(shí),該方法的特異性很強(qiáng),對(duì)其他病毒,如傳染性胰腺壞死病毒(IPNV)、傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)、病毒性出血敗血病毒(VHSV)均未有擴(kuò)增反應(yīng)。方法的重現(xiàn)性也較好。熒光RT-PCR具有較高的靈敏度特異性和重現(xiàn)性,在魚類疫病的早期快速診斷方面具有重要作用。

鯉春病毒血癥(SVC);熒光RT-PCR;靈敏性;特異性;重現(xiàn)性

鯉春病毒血癥（Spring Viraemia of Carp，SVC）又稱鯉魚傳染性腹水癥，是一種急性、出血性、傳染性敗血病[1]。該病可以危害鯉魚、鯰魚、鯽魚、鰱魚、鳙魚等[2]，在歐、亞兩洲均有流行。鯉春病毒血癥是魚類口岸檢疫的第一類檢疫對(duì)象，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為需要向申報(bào)的疫病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部定為一類動(dòng)物疫病。熒光RT-PCR法能夠簡(jiǎn)單方便、特異性的、高靈敏性的定量病毒RNA，由于不用處理PCR產(chǎn)物，檢測(cè)過程中污染和假陽(yáng)性出現(xiàn)的概率得到了有效的降低，檢測(cè)效率得到了極大的提高，而且通過融解曲線、探針等方式還可以防止非特異性擴(kuò)增，故熒光RT-PCR法正在逐漸取代常規(guī)RT-PCR法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

實(shí)驗(yàn)所用的病料、細(xì)胞系（鯉魚上皮瘤細(xì)胞EPC等）、病毒（鯉春病毒SVCV、傳染性胰臟壞死病毒IPNV、傳染性造血器官壞死病毒IHNV、病毒性出血性敗血病毒VHSV）等均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 儀器和試劑

儀器：LC480Real-time RT-PCR System；

試劑：One step prime script RT-RT-PCR kit，購(gòu)自寶生物（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)

選取SVCV的糖蛋白基因，由寶生物（大連）有限公司合成，序列如表1所示。

1.2.2 RNA的提取

按照寶生物試劑盒提取。將提取的RNA作為原始模板，分別稀釋107，106，105，104，103，102，101倍，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 熒光RT-PCR試驗(yàn)

將SVCV稀釋模板107、106、105、104、103、102、101、NTC（H2O）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)四次，得到擴(kuò)增曲線及Ct值。

1.2.4 樣品檢測(cè)

通過飼料浸毒、1：5000飼養(yǎng)水投毒、人工注射背鰭三種方式進(jìn)行人工感染鯉魚魚苗，選取出現(xiàn)SVCV典型病癥的病魚兩條，進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用SDS軟件對(duì)建立的熒光RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，查看擴(kuò)增曲線及Ct值，在結(jié)果的判斷過程中，主要以擴(kuò)增曲線是否為“S”型和熒光值的大小作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將SVCV樣本進(jìn)行10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度做4個(gè)平行，進(jìn)行熒光RT-PCR試驗(yàn)。圖1表示SVCV各個(gè)稀釋度的擴(kuò)增曲線。其中X軸代表PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)，Y軸代表熒光信號(hào)強(qiáng)度。從圖1中可以看出，SVCV稀釋度107-101的7個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)的熒光RT-PCR均有“S”型擴(kuò)增曲線，反映了PCR的指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期、平臺(tái)期三個(gè)階段，并且陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增。同時(shí)，每個(gè)稀釋度的4個(gè)平行擴(kuò)增曲線基本吻合，表明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性很好。圖1表示SVCV的101CT值為32.48，有典型的擴(kuò)增曲線，因此可初步判定檢測(cè)低限大于101。

圖1 SVCV熒光RT-PCR的擴(kuò)增曲線

表1 SVCV引物和探針序列

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以SVCV、IPNV、VHSV、IHNV的核酸作為模板，進(jìn)行熒光RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)SVCV糖蛋白基因設(shè)計(jì)的引物和Tagman探針能夠特異性地檢測(cè)出SVCV，而不能檢測(cè)出其他三種病毒。

圖2 SVCV特異性檢測(cè)結(jié)果

2.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過8次重現(xiàn)試驗(yàn)得到熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，如表2所示。由表2可知，8次重復(fù)性試驗(yàn)得到Ct值的標(biāo)準(zhǔn)誤差在0.36～1.31之間，誤差較小，表明本文建立的熒光RT-PCR方法重現(xiàn)性較好。

表2 SVCV重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（mean±SE）

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

進(jìn)一步分析擴(kuò)增曲線，發(fā)現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)期的曲線平行，反映了PCR擴(kuò)增效率相近；而不同稀釋度之間的CP相差均勻，符合熒光RT-PCR的CP值與起始拷貝數(shù)之間嚴(yán)格的線性關(guān)系。根據(jù)拷貝數(shù)與CP值的相關(guān)性，由LightCycler480 Software1.5軟件直接得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3。橫坐標(biāo)代表質(zhì)粒稀釋度的對(duì)數(shù)值（X），縱坐標(biāo)為CP值。圖3為軟件生成的SVCV標(biāo)準(zhǔn)曲線，拷貝數(shù)（X）與CP（Y）值得關(guān)系為：CP=-3.33lgX+32.00，其擴(kuò)增效率為1.882，Error為0.0297。CP值與濃度的對(duì)數(shù)值均有非常好的線性關(guān)系，以4次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，主要是避免實(shí)驗(yàn)操作、設(shè)備等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

圖3 SVCV 熒光RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 樣品檢測(cè)

采用本文建立的熒光RT-PCR法對(duì)人工感染鯉魚進(jìn)行檢測(cè)。以質(zhì)粒、病毒RNA、人工感染鯉魚組織RNA、水，分別作為陽(yáng)性對(duì)照、樣本、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，防止出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)典型的“S”擴(kuò)增曲線，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照均沒有出現(xiàn)擴(kuò)增，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)均成立，可排除假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果。圖4中，人工感染鯉魚組織RNA均出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，其CP值分別為18.22、21.04，利用圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出人工感染的鯉魚中SVCV含量為104.14和103.29。

圖4 人工感染SVCV鯉魚檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

傳統(tǒng)的SVCV診斷方法是對(duì)病毒先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，再通過ELISA等方法進(jìn)行鑒定，這些方法往往耗時(shí)較長(zhǎng)，而SVCV難以制備高效價(jià)抗體[5]。開發(fā)快速靈敏、能夠定量檢測(cè)病毒的方法，不僅對(duì)疾病的診斷，也為在分子水平上研究病毒感染，包括流行病學(xué)，發(fā)病機(jī)制和宿主細(xì)胞相互作用等各個(gè)方面具有重要意義。本文中的熒光RT-PCR檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單、速度快、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、特異性高。該方法可在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大批量樣品的檢測(cè)，非常適合魚類病毒的快速檢測(cè)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，可以對(duì)SVCV進(jìn)行早期診斷，及時(shí)切斷其傳播途徑，從而保護(hù)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

[1]景宏麗，張昊，王娜，等.鯉春血癥病毒單克隆抗體建立及免疫學(xué)特性鑒定[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2014，（3）：55-59.

[2]Reschova S，Pokorova D，Nevorankova Z，et al.Detection of spring viraemia of carp virus（SVCV）with monoclonal antibodies[J].Veterinarni Medicina，2007，（7）：308-316.

[3]徐敏，向華.流感病毒核酸檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（1）：89-92.

[4]高隆英，史秀杰，劉葒，等.用RT-PCR法快速檢測(cè)鯉春病毒血癥病毒基因[J].水生生物學(xué)報(bào)，2002，（26）：452-456.

國(guó)家質(zhì)檢公益項(xiàng)目（201410059）

吳斌（1968—），女，遼寧大連人，博士研究生，研究員，主要從事水生動(dòng)物疫病研究。