韓 雪

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730030;2.清水鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站,甘肅岷縣 745400)

單味中草藥對仔豬致病性大腸桿菌體外抑菌試驗(yàn)

韓 雪

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730030;2.清水鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站,甘肅岷縣 745400)

為了篩選出對仔豬致病性大腸桿菌流行株體外抑菌活性強(qiáng)的單味中草藥,本實(shí)驗(yàn)用水提法制備復(fù)方中草藥藥液,濃度為1g/mL;利用平板打孔法和試管二倍稀釋法分別測定單味中草藥抑菌圈直徑大小和最小抑菌濃度(MIC)。

藥物;大腸桿菌

豬腹瀉是由具有特定血清型的大腸桿菌引起的。致病性大腸桿菌病因年齡的不同而表現(xiàn)出不同的差異，根據(jù)研究，這種差異與仔豬腸道黏膜上皮細(xì)胞的受體的表達(dá)水平有關(guān)，而這種差異的表現(xiàn)在豬發(fā)病日齡和發(fā)病特征上，例如 1 周齡以內(nèi)的仔豬易患仔豬黃痢，10～30 日齡的豬易患仔豬白痢，在斷奶前后的仔豬最易患水腫病。大腸桿菌引起豬腹瀉的機(jī)理還與致病性大腸桿菌的存在有一個或更多的菌毛有關(guān)，是導(dǎo)致仔豬腹瀉的一個前提條件就是菌毛與腸道內(nèi)的受體結(jié)合，所以，我們把菌毛也叫做粘附素（adh esin）或定居因子（Colonization factor，CF），菌毛的生物學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，是引起仔豬腹瀉主要的致病機(jī)理。

中草藥富含多種抑菌的化學(xué)活性物質(zhì)，不僅對E.coli具有直接或者間接的殺滅作用，還可以清除內(nèi)毒素和消除E.coli菌耐藥質(zhì)粒，降低其耐藥性，在國內(nèi)中草藥防治雞、豬源大腸桿菌病的研究相對較多，被廣泛應(yīng)用與豬源大腸桿菌病的防治中。

1 單味中草藥藥液的制備

用水提法提取中藥的有效成分，將12味中藥烘干，各取50g，加入5～10倍蒸餾水浸泡2h，煮開后慢火煮30min左右，12層紗布過濾，用同樣方法再煮一次，過濾，合并2次煮的藥液進(jìn)行濃縮，濃度的濃度為1g/mL，離心后，調(diào)整pH值為7.2～7.3，121℃高壓滅，15min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 大腸桿菌菌液的制備

取出仔豬致病性大腸桿菌的菌種，室溫解凍后，接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)12h后，挑單菌落，接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床震蕩培養(yǎng)12h，利用平板菌落計(jì)數(shù)法對該菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整仔豬致病性大腸桿菌終濃度為108CFU/ml。

3 單味中草藥抑菌圈直徑的測定與結(jié)果

利用平板打孔法測定中藥水提物抑菌圈直徑大小，取仔豬致病性大腸桿菌0.1ml（108CFU/ml）涂布在平板，在超凈工作臺中待完全吸收后，取無菌的牛津杯放在普通培養(yǎng)平板上，加滿藥液，靜置0.5h后，置37℃培養(yǎng)12h，每一種藥物做3個重復(fù)，取平均值；判定標(biāo)準(zhǔn)為：10mm＜抑菌直徑為低敏，10mm≤抑菌直徑＜15mm為中敏，15mm≤抑菌直徑＜20mm為高敏，20mm≤抑菌直徑為極敏。由表1可知，仔豬致病性大腸桿菌對金銀花、黃連、訶子、五味子、苦參5味單味中藥高度敏感，抑菌圈直徑分別為在19.2mm、17.1mm、18.5mm、18.9mm、18.1mm；對板藍(lán)根、白頭翁、連翹、五倍子4種3種藥物中度敏感，抑菌圈直徑分別為14.7 mm、13.6 mm、15.4 mm、12.1 mm；對秦皮、蒲公英2種藥物低敏，抑菌圈直徑在分別為8.5mm、9.2mm；仔豬致病性大腸桿菌對敗醬草無明顯作用。

4 單味中草藥體外抑菌MlC的測定與結(jié)果

利用試管二倍稀釋法測定中藥水提物的最小殺菌濃度（MBC）[8]，取12只編號的滅菌的試管，每個試管中加入無菌的營養(yǎng)肉湯2mL，在第1管中加2ml中藥水提物混勻，取出2ml混合藥液放入第2管，依此類推，稀釋到第10管，棄去2ml，第11管為陽性對照，第12管為陰性對照。在1～11只管中加入菌液20μl（108CFU/ml），每一種藥物3個重復(fù)，37℃培養(yǎng)18～24h后，將每個藥物不同濃度的培養(yǎng)物接種于普通培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18h。無細(xì)菌生長中藥水提物濃度梯度為該藥的MBC。由表2可知，仔豬致病性大腸桿菌對金銀花、黃連、訶子、五味子、苦參5味單味中藥高度敏感，體外抑菌MIC分別為7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、15.63 mg/ml、31.25 mg/ml；對板藍(lán)根、白頭翁、連翹、五倍子4種藥物中度敏感，體外抑菌MIC分別為62.5 mg/ml、62.5 mg/ml、125 mg/ml、125 mg/ml；對秦皮、蒲公英2種藥物低敏，體外抑菌MIC分別為分別為250mg/ml、250mg/ml仔豬致病性大腸桿菌對敗醬草無明顯作用。

5 小結(jié)

豬腹瀉是由具有特定血清型的大腸桿菌引起的，感染不同階段的仔豬，會引發(fā)同的癥狀，仔豬因年齡的不同而表現(xiàn)出不同的病候，1 周齡以內(nèi)的仔豬易患仔豬黃痢，10～30 日齡的豬易患仔豬白痢，在斷奶前后的仔豬最易患水腫病，這3種病均是由仔豬的致病性大腸桿菌引起的來，仔豬的致病性大腸桿菌發(fā)病率和感染率均較高，該菌易產(chǎn)生耐藥性。本文利用平板打孔法和試管二倍稀釋法分別測定單味中草藥抑菌圈直徑大小和最小抑菌濃度（MIC）。結(jié)果顯示，篩選出來了對豬致病性大腸桿菌流行株高度敏感的5種種草喲，金銀花、黃連、訶子、五味子、苦參；抑菌圈直徑分別為19.2mm、17.1mm、18.5mm、18.9mm、18.1mm；體外抑菌MIC分別為7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、15.63 mg/ml、31.25 mg/ml；為進(jìn)一步研制復(fù)方中草藥防治仔豬致病性大腸桿菌病和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

表1 單味中草藥對仔豬致病性E.coli抑菌圈直徑結(jié)果（單位：mm）注“-”無敏感性

表2 單味中草藥對仔豬致病性E.coli抑菌圈MlC結(jié)果（單位：mg/ml）注“-”無敏感性

[1]向雙云，周珍輝，李玉冰，等.8種中草藥對大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016，（5下）：167-169.