盧 君，山其木格，李長文*，彭曉培，孟天毅，周欣樂

（1.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津 300410；2.貴州國臺酒業(yè)有限公司，貴州 仁懷 564501）

醬香型白酒酵母菌群快速鑒定及發(fā)酵性能初探

盧 君1，山其木格1，李長文1*，彭曉培1，孟天毅1，周欣樂1

（1.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津 300410；2.貴州國臺酒業(yè)有限公司，貴州 仁懷 564501）

為了研究醬香型白酒釀造過程中酵母菌群的生物多樣性及發(fā)酵性能，對前期建立的“國臺酒-酵母菌種庫”展開研究，利用十二烷基磺酸鈉（SDS）熱裂解法提取總DNA，進(jìn)而通過5.8S rDNA-ITS區(qū)域限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）的方法結(jié)合“Yeast-ID”數(shù)據(jù)庫比對，將酵母菌株鑒定到種的水平，再通過inter-δ PCR的方法將釀酒酵母菌株在種以下水平進(jìn)一步分類。最后，對每個類型的酵母菌株，進(jìn)行了發(fā)酵性能的初步研究。研究表明，醬香型白酒釀造過程中酵母菌群被分為7種，其中3種表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)酒功能，1種表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)乙酸乙酯能力；各菌種之間代謝產(chǎn)酸、產(chǎn)酯和微量物質(zhì)的能力各不相同。

醬香型白酒；酵母菌；分類鑒定；發(fā)酵性能

醬香型白酒以其獨特的發(fā)酵工藝和復(fù)雜的風(fēng)味成分聞名于海內(nèi)外。醬香型白酒釀造采用的高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵特殊工藝，形成了一系列具有特殊生理活性和發(fā)酵性能的微生物菌群[1]。酵母菌能夠在醬香型白酒生產(chǎn)過程中的制曲、堆積、入窖發(fā)酵、環(huán)境空氣、涼堂地面中檢測得到，是醬香型白酒釀造過程中非常重要的一類微生物[2-4]。醬香型白酒堆積過程，就是富集酵母菌的過程，起到“二次制曲”的作用[5]，如果不進(jìn)行堆積發(fā)酵，酵母菌群富集不夠，會極大影響下一個輪次的產(chǎn)酒，甚至不產(chǎn)酒[4]，這也說明了酵母菌的重要作用。酵母菌群分為產(chǎn)酒功能菌和產(chǎn)香功能菌，其生長和代謝情況直接影響著醬香白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量，與企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益直接相關(guān)。因此，對于醬香型白酒相關(guān)酵母菌群的研究，包括對菌群的多樣性、演變規(guī)律、發(fā)酵性能、代謝產(chǎn)物與風(fēng)格質(zhì)量的關(guān)系、優(yōu)良菌株的篩選與應(yīng)用將越來越被企業(yè)所重視[6]。

目前，對于醬香型白酒釀造過程中相關(guān)酵母菌的鑒定方法主要有傳統(tǒng)的分類鑒定方法，和基于分子生物學(xué)的方法。傳統(tǒng)的分類鑒定方法操作耗時費力，且準(zhǔn)確性不高；分子生物學(xué)的鑒定方法，應(yīng)用最多的就是免培養(yǎng)技術(shù)的梯度變性凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）[7]，以及序列分析技術(shù)[8]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，宏基因組技術(shù)也被應(yīng)用于白酒釀造過程中酵母菌群的研究[9-10]。這些菌種鑒定方法存在實驗周期長，鑒定成本高的特點，不適合大規(guī)模的菌群研究。為了解決這一問題，擬提供一種方便、快捷和低成本的酵母菌株鑒定方法，并研究醬香型白酒釀造過程酵母菌群的生物多樣性。

在研究醬香型白酒酵母菌群組成的基礎(chǔ)上，初步探索菌株的發(fā)酵特性，有助于探明酵母菌群在釀酒發(fā)酵中的機(jī)理，為篩選優(yōu)良性狀的菌株提供研究基礎(chǔ)，對于企業(yè)來說具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種來源：“國臺酒-酵母菌種庫”中保藏的酵母菌株，按照不同的菌落形態(tài)提前分類，每個形態(tài)的菌株保藏10株，共計70株。

TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）：大連TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶HinfⅠ、HaeⅢ和CfoⅠ：美國Promega公司；DNAMarker：BBI生命科學(xué)有限公司；酸、酯、醇、醛類標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：天津光復(fù)精細(xì)化工廠。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，115℃滅菌20 min。高粱汁培養(yǎng)基：取500 g粉碎后的高粱，粉碎，添加到2L的去離子水中，同時添加適量的耐高溫淀粉酶溶液，經(jīng)過2 h的蒸煮后，添加適量的糖化酶，在60℃的條件下糖化4 h；取上述混合液，8 000 r/min離心10 min，上清液即為高濃度的高粱汁培養(yǎng)液；加水稀釋調(diào)整糖度至10°Bx，然后分裝，121℃滅菌20 min后，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件：美國Bio-Rad公司；DYY-6C瓊脂糖電泳裝置：北京六一儀器廠；Agilent 7890A氣相色譜儀、HP-FFAP色譜柱（30 m×0.53 mm，1 μm）：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 SDS熱裂解法提取酵母菌基因組理

酵母菌基因組的提取采用十二烷基硫磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）熱裂解法[11]，該方法操作簡便、快速。具體步驟為：取30μL0.25%SDS于無菌離心管中，加入少許菌落，吹吸數(shù)次，振蕩30 s；93℃水浴4 min、冰浴5 min，為提高提取效果，可重復(fù)一次93℃水浴和冰浴過程。13000r/min離心1 min，吸取上清，即為酵母菌基因組。提取后基因組保存于-20℃冰箱，供PCR擴(kuò)增。

1.3.2 酵母菌快速鑒定方法

5.8 S rDNA-ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增：以酵母菌基因組為模板進(jìn)行5.8S rDNA-ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物序列分別為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）；ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性7 min，95℃變性1 min，52℃退火2 min，72℃延伸2 min，變性、退火和延伸循環(huán)30次，最后一次72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

5.8 S rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）分析：采用HinfⅠ、HaeⅢ和CfoⅠ三種內(nèi)切酶對酵母菌5.8S rDNAITS區(qū)進(jìn)行酶切，根據(jù)得到的不同酶切圖譜類型，對酵母菌株進(jìn)行分類。

Yeast-ID數(shù)據(jù)庫比對[12]：對酵母菌5.8S rDNA-ITS區(qū)及其3種酶切產(chǎn)物的片段大小結(jié)果，利用該數(shù)據(jù)庫比對標(biāo)準(zhǔn)模式圖譜，將國臺酒釀造過程中分離得到的酵母菌鑒定到種的水平。

inter-δ PCR分析[13]：以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因組為模板進(jìn)行δ12/δ21區(qū)和δ12/δ2區(qū)的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物序列分別為δ12（5′-TCAACAATGGAATCCCAAC-3′）；δ2（5′-GTGGATTTTTATTCCAACA-3′）；δ21（5′-CATCTTAACACCGTATATGA-3′）。inter-deltaPCR擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性6 min，94℃變性30 s，43℃退火1 min，72℃延伸2min，變性、退火和延伸循環(huán)30次，最后一次72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。利用inter-δ PCR的方法將釀酒酵母菌株在種以下水平進(jìn)一步分類。

1.3.3 酵母菌發(fā)酵性能初步分析

將菌株接種于YEPD培養(yǎng)基，在200 r/min、30℃條件下培養(yǎng)24 h后獲得種子液；將種子液接種于150 mL高粱汁培養(yǎng)基中，等量接種，初始菌體濃度均為1×106個/mL。安裝發(fā)酵栓封口膜密封并稱質(zhì)量，于28℃靜置培養(yǎng)，發(fā)酵終點以日減少量＜0.2 g為準(zhǔn)。發(fā)酵結(jié)束后，對發(fā)酵液進(jìn)行了酸度和還原糖的測定。同時，將發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，取蒸餾樣品進(jìn)行酒精度、總酸、總酯和微量代謝物質(zhì)檢測。

1.3.4 測定及數(shù)據(jù)分析方法

還原糖：參照國標(biāo)GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》[14]。

酒精度、總酯、總酸：參照國標(biāo)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。

微量代謝物質(zhì)的檢測利用氣相色譜法，色譜條件：HPFFAP色譜柱（30 m×0.53 mm，1 μm）；升溫程序：37℃保持9min，以3.5℃/min升溫至45℃，再以10℃/min升溫至100℃，保持4 min，再以22℃/min升溫至200℃，保持7 min；進(jìn)樣口溫度200℃；火焰離子檢測器（flameionizationdetector，F(xiàn)ID）溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比25∶1；氣體流速3.0mL/min（恒流模式）。

酵母菌株發(fā)酵后總酸、總酯及微量代謝成分含量數(shù)據(jù)利用Multi Experiment Viewer 4.9.0軟件進(jìn)行熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株分類鑒定結(jié)果

對于“國臺酒-酵母菌種庫”中的酵母菌株，利用SDS熱裂解法快速提取酵母菌基因組，然后進(jìn)行ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增，再利用HinfⅠ、HaeⅢ和CfoⅠ三種內(nèi)切酶分別進(jìn)行酶切，通過對內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物片段多樣性進(jìn)行綜合分析，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在醬香型白酒釀造過程中分離得到的酵母菌株能夠被分為7類，菌種庫中不同菌落形態(tài)的酵母菌株對應(yīng)著不同的5.8S rDNA-ITS-RFLP圖譜，這些圖譜中PCR產(chǎn)物的大小范圍在510～1 050 bp，酶切產(chǎn)物的大小范圍在70～1 050 bp，能夠說明醬香白酒釀造過程中酵母菌群種類的豐富性，也能夠作為檢測釀造過程中出現(xiàn)的特定酵母菌株的評價標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 醬香白酒釀造過程中酵母菌群5.8S rDNA-ITS-RFLP特征圖譜Fig.1 Fingerprints of 5.8S rDNA-ITS-RFLP of yeasts from sauce-flavorBaijiuduring brewing

通過得到的5.8S rDNA-ITS-RFLP圖譜，能夠?qū)⒔湍妇赀M(jìn)行分類，進(jìn)一步將電泳條帶產(chǎn)物大小輸入Yeast-ID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，能夠?qū)⑻卣鲌D譜類型和數(shù)據(jù)庫結(jié)果一一對應(yīng)，從而根據(jù)特征圖譜類型將酵母菌快速的鑒定到種的水平。特征圖譜類型和種屬鑒定結(jié)果見表1。

由表1可知，每個類型酵母對應(yīng)的特征圖譜的ITS區(qū)PCR產(chǎn)物大小和酶切產(chǎn)物大小，比對Yeast-ID數(shù)據(jù)庫后，能夠?qū)⑦@7類酵母鑒定為屬于5個屬的6個種的菌株。為了驗證以上結(jié)果的準(zhǔn)確性，還通過ITS區(qū)的序列分析進(jìn)行復(fù)核，發(fā)現(xiàn)Type1、Type2、Type3、Type4和Type7都被準(zhǔn)確鑒定到種的水平。而Type5的釀酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）和Type6的奇異釀酒酵母菌株（Saccharomyces paradoxus）則被鑒定為兩個不同的種，這是因為這兩個種的酵母屬于最近緣種[15]，利用HinfⅠ、HaeⅢ和CfoⅠ這三種內(nèi)切酶得到了完全一致的圖譜類型，導(dǎo)致查詢Yeast-ID數(shù)據(jù)庫后，這兩類酵母被鑒定為同一個種，發(fā)現(xiàn)如果利用HpaII和ScrfI這兩種內(nèi)切酶則能夠?qū)⑦@兩類酵母進(jìn)行區(qū)分，說明了Yeast-ID數(shù)據(jù)庫的有效性。最終，將這7類酵母鑒定為屬于5個屬的7個種的菌株。因此，仍然認(rèn)為5.8S rDNA-ITS-RFLP特征圖譜結(jié)合Yeast-ID數(shù)據(jù)庫對比的方法，是一種簡單、快速、準(zhǔn)確的酵母菌鑒定方法，對于種源關(guān)系非常接近的菌株，需要采用多種內(nèi)切酶來進(jìn)行區(qū)分和鑒定。

表1 醬香白酒酵母菌群5.8S rDNA-ITS-RFLP結(jié)合Yeast-ID數(shù)據(jù)庫鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of yeasts from sauce-flavorBaijiuduring brewing by 5.8S rDNA-ITS-RFLP fingerprints combining with"Yeast-ID"database

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是與酒精代謝直接相關(guān)的一種酵母，對于釀酒生產(chǎn)來說具有非常重要研究價值，產(chǎn)酒率的高低也直接決定這釀酒企業(yè)的效益。篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母菌株的需要對不同類型的釀酒酵母菌株進(jìn)行考察。因此，本研究利用inter-δ PCR的方法，進(jìn)一步將分離得到的釀酒酵母菌株進(jìn)行分類研究，釀酒酵母inter-δ PCR圖譜見圖2。

由圖2可知，利用σ12/σ2引物或σ12/σ21引物均能夠?qū)Σ煌尼劸平湍高M(jìn)行區(qū)分，從醬香型白酒釀造過程分離得到的釀酒酵母菌株與對照釀酒酵母菌株（安琪耐高溫活性干酵母菌株）具有不同的圖譜類型。釀酒酵母菌株在種以下水平進(jìn)一步分類具有重要意義，因為釀酒酵母菌株之間發(fā)酵性能往往差異較大，然而將釀酒酵母進(jìn)一步分類，分成若干相同的亞種，相同亞種的菌株一般發(fā)酵性能接近，這就減輕了菌株篩選工作的工作量，對于篩選得到優(yōu)良菌株具有積極意義。

綜上所述，本研究提供的酵母菌群分類鑒定方法，相比于其他方法，具有更加快速、成本更低的優(yōu)點。如本研究中的酵母菌DNA提取方法，采用物理破壁原理，操作簡單，提取時間在20 min以內(nèi)，無需試劑盒，適合大量菌株的操作。對比目前已報到的酵母菌群鑒定方法主要有序列分析、梯度變性凝膠電泳、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）等方法，這其中梯度變性凝膠電泳、RAPD、AFLP只能對酵母菌群進(jìn)行分類，不能鑒定到種的水平。序列分析的方法能夠鑒定到種的水平，但是這種方法從提取基因組，到PCR擴(kuò)增，再到測序和比對，最終得到結(jié)果的實驗時間最少2個工作日，并且單個樣品的成本至少在25元以上，而本研究提出的方法，從提取基因組到最終得到結(jié)果，可以在1個工作日內(nèi)完成，并且單個樣品的成本＜10元。另外，本文提供的酵母菌DNA提取方法簡便快捷，從而更適合大量樣品的研究，符合企業(yè)研發(fā)的需求。

5.8 S rDNA-ITS-RFLP結(jié)合Yeast-ID數(shù)據(jù)庫對比的方法無需序列分析過程，進(jìn)行查詢數(shù)據(jù)庫即可將酵母鑒定到種的水平，inter-δ PCR的方法僅需一步PCR，即可將釀酒酵母在種以下水平進(jìn)一步分類，同樣具有方便，快速，低成本的特點。本方法使得釀酒企業(yè)大規(guī)模酵母菌群分析變得可能，對于探索酵母菌群多樣性，篩選優(yōu)良菌株具有重要意義。

圖2 釀酒酵母inter-δ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of inter-δ PCR amplification products of Saccharomyces cerevisiae

2.2 酵母菌株發(fā)酵性能初步分析結(jié)果

本研究從經(jīng)過分子鑒定后的7類酵母菌群中各挑選出1株，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵實驗，考察不同種類的酵母菌株，在發(fā)酵產(chǎn)酒、總酸、總酯、微量代謝物質(zhì)等方面的能力。理化檢測結(jié)果見表2。

表2 醬香白酒酵母菌發(fā)酵性能測定結(jié)果Table 2 Determination results of fermentation performances of yeast strains from sauce-flavorBaijiu

由表2可知，醬香型白酒釀造過程中的7類酵母菌株，其中Type1、Type2、Type3、Type4產(chǎn)酒能力較弱，產(chǎn)酯能力較強(qiáng)，而Type5、Type6、Type7則產(chǎn)酒能力較強(qiáng)，產(chǎn)酯能力較弱。各個菌株代謝產(chǎn)酸能力接近。能夠看出Type5、Type6、Type7與醬香白酒出酒率直接相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)Saccharomyces paradoxus（Type6）和 Schizosaccharomyces pombe（Type7）雖然不屬于釀酒酵母種，但依然具有較高的產(chǎn)酒精能力。以上結(jié)果說明“國臺酒-酵母菌種庫”中保藏的酵母具有不同的產(chǎn)酒和產(chǎn)酯特性，這些發(fā)酵特性不同的菌株可作為強(qiáng)化功能菌株應(yīng)用于實際生產(chǎn)，有目的性的提高醬香白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量，具有較高的應(yīng)用潛力。

本研究還對以上酵母菌株代謝產(chǎn)生的微量風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了檢測，初步考察了各個菌株代謝產(chǎn)生揮發(fā)性成分的能力，檢測結(jié)果見圖3。

圖3 醬香白酒酵母菌發(fā)酵產(chǎn)微量成分熱圖分析Fig.3 Heatmap analysis of trace components-producing ability of yeast strains from sauce-flavorBaijiu

由圖3可知，根據(jù)酵母菌株代謝產(chǎn)物生成量的差異進(jìn)行熱圖分析，發(fā)現(xiàn)Type1、Type2、Type3、Type4發(fā)酵性能非常接近，歸為一類，這4類酵母的種屬分類分別是：德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、光滑假絲酵母（Candida glabrata），這與徐麗萍等[16]的報道結(jié)果基本一致；Type5和Type6歸為一類，原因是這兩類酵母種源關(guān)系非常接近，都是屬于酵母屬的酵母菌株；Type7自成一類。特別值得注意的是Type3相比于其他菌株具有非常高的產(chǎn)乙酸乙酯的能力，該菌株屬于Issatchenkia orientalis種。結(jié)合表2的結(jié)果可知，根據(jù)產(chǎn)酒能力不同而分為兩類的酵母，其代謝產(chǎn)生微量風(fēng)味成分的能力也有相似的分類。

3 結(jié)論

本研究建立了一套快速的酵母菌群分類鑒定方法，即利用SDS熱裂解法提取總DNA，進(jìn)而通過5.8S rDNA-ITS區(qū)域限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）的方法結(jié)合“Yeast-ID”數(shù)據(jù)庫比對，將酵母菌株鑒定到種的水平，再通過inter-δ PCR的方法將釀酒酵母菌株在種以下水平進(jìn)一步分類。該方法具有方便，快速，低成本的特點，適合釀酒企業(yè)的大規(guī)模酵母菌群分析工作。

醬香型白酒釀造過程的酵母菌群能夠被鑒定為屬于5個屬的7個種的菌種。分別為Torulaspora delbrueckii，Candida tropicalis，Issatchenkia orientalis，Candida glabrata，Saccharomyces cerevisiae，Saccharomyces paradoxus，Schizosaccharomyces pombe。

發(fā)酵性能初步分析發(fā)現(xiàn)，Saccharomyces paradoxus，Schizosaccharomyces pombe，Saccharomyces cerevisiae 具有較強(qiáng)的代謝產(chǎn)酒精能力；Torulaspora delbrueckii，Candida tropicalis，Issatchenkia orientalis，Candida glabrata具有較強(qiáng)的代謝產(chǎn)酯能力；其中Issatchenkia orientalis具有較強(qiáng)的代謝產(chǎn)乙酸乙酯能力。

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Rapid identification and functional characterization of yeasts from sauce-flavorBaijiuduring brewing

LU Jun1,SHAN Qimuge1,LI Changwen1*,PENG Xiaopei1,MENG Tianyi2,ZHOU Xinyue2
(1.Research Institute of Tasly Holding Group,Tianjin 300410,China;2.Guizhou Guotai Distillery Co.,Ltd.,Renhuai 564501,China)

In order to study the biodiversity and fermentation performance of yeasts from sauce-flavorBaijiuduring brewing,a study on"Guotai-yeast strains library"established in early stage was carried out.The total DNA was extracted by SDS thermal cracking method.Then the molecule method based on restriction fragment length polymorphism analysis(RFLP)of the 5.8S rDNA-ITS region combining the"Yeast-ID"database alignment were used and yeast strains were identified at the species level.Inter-δ PCR method was used to differentiate and identify at subspecies ofSaccharomyces cerevisiae.Finally,the fermentation performance of each type of yeast strain was studied.The research results showed that yeasts from sauce-flavor Baijiuduring brewing were divided into 7 types,and 3 of them showed higher ethyl alcohol-producing abilities,and one of them showed higher ethyl acetate-producing ability.Besides,the production ability of total acids,total esters and trace substances were different among strains.

sauce-flavorBaijiu;yeast strains;classification and identification;fermentation performance

TS261.1

0254-5071（2017）10-0082-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.018

2017-07-17

盧 君（1985-），男，工程師，博士，研究方向為酒類發(fā)酵技術(shù)和質(zhì)量控制。

*通訊作者：李長文（1966-），男，教授，博士，研究方向為食品與發(fā)酵工程。