謝 春(商丘醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南 商丘 476000)

苦參素對(duì)HeLa細(xì)胞自噬性死亡的影響

謝 春
(商丘醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南 商丘 476000)

目的探討苦參素對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬的影響，初步探討其作用機(jī)制。方法不同濃度(1.0、1.5、2.0 g·L-1)的苦參素作用于HSV-2感染的人宮頸癌HeLa細(xì)胞，RFP-GFP-LC3和HPV16 DNA共轉(zhuǎn)染后12 h和36 h收集細(xì)胞，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬活性的改變，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以及Western Blot檢測(cè)在HeLa細(xì)胞中HSV-2感染引起自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的變化。結(jié)果病毒感染組自噬小體明顯增多，多于對(duì)照組(P<0.05)；病毒感染組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ明顯升高，高于對(duì)照組(P<0.05)；與對(duì)照組比較，作用72 h 后, 1.0、1.5、2.0 g·L-1苦參素組均能不同程度提高HeLa細(xì)胞的自噬活性，均可見(jiàn)到自噬小體的增加，其自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，HSV-2釋放滴度明顯降低(P<0.05)。結(jié)論苦參素能通過(guò)增強(qiáng)HeLa細(xì)胞自噬活性，減少HSV-2感染后的釋放與產(chǎn)生。

HeLa細(xì)胞；宮頸癌；苦參素；細(xì)胞自噬；單純皰疹病毒2型

單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus 2 type, HSV-2)主要通過(guò)性接觸傳播,引起生殖器官的炎癥和皰疹。最近發(fā)現(xiàn)HSV-1和人類(lèi)巨細(xì)胞病毒(human giant cell virus，HCMV)可誘導(dǎo)自噬，進(jìn)一步證明病毒DNA能夠促進(jìn)自噬。有研究用透射電鏡發(fā)現(xiàn)HSV感染的交感神經(jīng)和鼠成纖維細(xì)胞樣品存在大量包裹有病毒粒子的自噬泡；隨后將病毒內(nèi)部的自噬抑制蛋白缺失發(fā)現(xiàn)病毒滴度顯著下降；如果將自噬形成的控制基因沉默后，病毒滴度會(huì)顯著上升，這表明自噬可能是通過(guò)自噬泡降解病毒從而有抗感染作用。

苦參素是以苦參堿為代表的骨架結(jié)構(gòu),對(duì)苦參素提純測(cè)定和藥效作用的深入研究發(fā)現(xiàn),苦參素具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎作用,還具有升高白細(xì)胞和Th細(xì)胞, 調(diào)節(jié)免疫等作用[1]。但關(guān)于苦參素對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬活性的影響國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究通過(guò)探討不同濃度苦參素對(duì)HeLa細(xì)胞自噬活性的影響, 為苦參素治療宮頸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料與細(xì)胞

1.1.1 主要材料 HeLa細(xì)胞株和HSV-2病毒株由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤病理研究室提供；苦參素(氧化苦參堿含量≥98%)購(gòu)自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物材料工程有限公司；所有實(shí)驗(yàn)用試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 細(xì)胞分組及處理方法 本研究將細(xì)胞分為HSV-2病毒感染組和空白對(duì)照組，并進(jìn)一步按照苦參素的不同濃度對(duì)病毒感染組進(jìn)行分組。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 HeLa細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和100 u·mL-1青霉素及100 mg·mL-1鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 HSV-2的CCID50滴定及感染 接種濃度為1×105·mL-1的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)，5 d后觀察并記錄全部孔的細(xì)胞病變?cè)俑鶕?jù)卡波氏公式計(jì)算出病毒滴度；在攻毒實(shí)驗(yàn)前測(cè)定病毒的CCID50，換算成空斑形成單位，在細(xì)胞傳代24 h后進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)，將病毒加入培養(yǎng)基中，十字交叉搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。

1.2.3 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬 用普通培養(yǎng)、RFP-GFP-LC3和HPV16 DNA共轉(zhuǎn)染后12 h和36 h后收集細(xì)胞，離心，細(xì)胞沉淀，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊二醛的0.1 mol·L-1PBS固定2 h。用PBS清洗之后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%四氧化鋨固定2 h，再用濃度梯度(50%～90%)的乙醇脫水，然后用丙酮進(jìn)一步脫水，用環(huán)氧樹(shù)脂包埋，浸透過(guò)夜，聚合，超薄切片機(jī)切片，然后用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對(duì)超薄切片進(jìn)行負(fù)染色。在透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.4 苦參素調(diào)控自噬活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞, 按1×105·mL-1的濃度接種于96 孔培養(yǎng)板, 每孔總反應(yīng)體系為200 μL。實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的苦參素, 使其終濃度達(dá)到工作濃度,分別為0.0、1.0、1.5、2.0 g·L-1。每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔, 用RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL設(shè)為調(diào)零點(diǎn), 加入不含苦參素的細(xì)胞培養(yǎng)基(細(xì)胞液、培養(yǎng)基各為100 μL)為空白對(duì)照組,將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h；然后進(jìn)行相關(guān)蛋白的測(cè)定。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以及Western Blot檢測(cè)在HeIa細(xì)胞中HSV-2感染引起自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的變化。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞自噬情況變化病毒感染組自噬小體明顯增多，多于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的變化HeIa細(xì)胞中HSV-2病毒感染引起自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的變化，發(fā)現(xiàn)病毒感染組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ明顯升高，高于對(duì)照組(P<0.05)，提示HeLa細(xì)胞中出現(xiàn)自噬活性增強(qiáng)現(xiàn)象。

2.3苦參素對(duì)Hela細(xì)胞自噬活性的影響與空白對(duì)照組比較，作用72 h 后, 1.0、1.5、2.0 g·L-1苦參素組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，而各濃度苦參素組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.4苦參素對(duì)Hela細(xì)胞病毒釋放表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，作用72 h 后, 1.0、1.5、2.0 g·L-1苦參素組HSV-2釋放滴度明顯降低(P<0.05)，而各濃度苦參素組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 苦參素對(duì)HeLa細(xì)胞自噬活性和HSV-2滴度的影響

3 討論

皰疹病毒是已知感染人類(lèi)病毒種類(lèi)最多的一類(lèi)病毒，為雙鏈DNA病毒。HSV-2主要通過(guò)性接觸傳播引起生殖器官的炎癥和皰疹。HSV-2感染機(jī)體后能否致病取決于HSV-2的毒力，即HSV-2在靶細(xì)胞的內(nèi)增殖及播散的能力。美國(guó)孕婦HSV-2感染率為35.17%，在發(fā)展中國(guó)家，HSV-2的感染率更高。該病毒與宮頸癌的發(fā)生有密切的關(guān)系。但目前尚無(wú)特效藥物控制HSV-2感染的發(fā)生和復(fù)發(fā)[2]。HSV-2具有很大的危害性，其感染已成為醫(yī)學(xué)上一個(gè)十分棘手的問(wèn)題。

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一, 嚴(yán)重威脅女性的生命健康。自噬是真核細(xì)胞普遍存在的生命現(xiàn)象,在自噬過(guò)程中,首先是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成雙層膜結(jié)構(gòu)包裹的成分(受損的、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器)稱(chēng)為自噬體。腫瘤細(xì)胞在放、化療過(guò)程中可活化自噬信號(hào),作為一種存活機(jī)制介導(dǎo)獲得性耐藥而保護(hù)細(xì)胞免遭死亡[3]。最近發(fā)現(xiàn)HSV-1和HCMV可誘導(dǎo)自噬，進(jìn)一步證明病毒DNA能夠促進(jìn)自噬。因此,通過(guò)抑制自噬信號(hào)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療治療的敏感性成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外抗腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一[4]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染組自噬小體明顯增多，說(shuō)明HeLa細(xì)胞被HSV-2感染后激活其自噬活性，進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。

病毒內(nèi)部的自噬抑制蛋白缺失可導(dǎo)致病毒滴度顯著下降；如果將自噬形成的控制基因沉默后，病毒滴度會(huì)顯著上升，這表明自噬可能是通過(guò)自噬泡降解病毒，從而有抗感染作用。自噬過(guò)程受一系列自噬相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控[5-6]。LC3-Ⅰ在正常情況下是彌散分布在細(xì)胞漿中的，轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ則特異結(jié)合在自噬泡的內(nèi)外膜上，因此LC3-Ⅱ成為檢測(cè)自噬的標(biāo)志物[3-4]。本研究還發(fā)現(xiàn)病毒感染組的自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ明顯增多。

苦參堿類(lèi)藥物具有抑制腫瘤增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡、抗腫瘤浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤新生血管形成、減輕腫瘤炎癥和抑制腫瘤耐藥性、減低化療不良反應(yīng)、增強(qiáng)腫瘤宿主免疫等功能[7-8]。本研究結(jié)果顯示,苦參素可以調(diào)節(jié)HeLa細(xì)胞自噬活性，不同濃度的苦參素對(duì)HeLa細(xì)胞的自噬活性改變并無(wú)明顯差異。進(jìn)一步分析其病毒釋放及產(chǎn)生發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較應(yīng)用苦參素的病毒感染組其病毒滴度明顯降低。

綜上所述,苦參素可能通過(guò)調(diào)控HeLa細(xì)胞的自噬活性，抑制被感染HSV-2的HeLa細(xì)胞釋放與產(chǎn)生病毒，降低病毒滴度。苦參素有望成為治療宮頸癌的一種藥物,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

[1] SCHULZE-BERGKAMEN H，KRAMMER PH.Apoptosis in cancer:implications for therapy[J].Semin Oncol， 2004， 31(1):90-119.

[2] ZHAN G LP,JIANG JK,TAM JW,et al.Effects of Matrine on proliferation and differentiation in K-562 cells[J].Leuk Res，2001，25(9):793-800.

[3] 胡向陽(yáng),孟剛,鮑揚(yáng)漪,等.紫杉醇誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡及其與凋亡相關(guān)蛋白的關(guān)系[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2004， 20(9):1063-1067.

[4] RAVINDRAN J，PRASAD S，AGGARWAL BB．Curcumin and cancer cells: how many ways can curry kill tumor cells selectively[J]．AAPS J，2009，11 ( 3) : 495-510.

[5] GREGORY RI，SHIEKHATTAR R． MicroRNA biogenesis and cancer[J]．Cancer Res，2005，65(9):3509-3512.

[6] Dweep H,Sticht C,Pandey P,et al.miRWalk--database: prediction of possible miRNA binding sites by "walking" the genes of three genomes[J].J Biomed Inform，2011，44(5):839-847.

[7] SHIRAKIK,FUJIKAWA K,SUGIMOTO K,et al.Cellular apoptosissusceptibility protein an d proliferation in human hepatocellularcarcinoma[J].Int J Mol Med, 2006, 18(1):77-81.

[8] 朱玉娟, 周愛(ài)玲, 茅家慧, 等.苦參素對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌PCNA、cyclinD1 、CDK4 表達(dá)的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2005，10(1):52-56.

ImpactofSophoraontheAutophagyofHeLaCells

XIE Chun
(ShangqiuMedicalCollege，Shangqiu476000，China)

ObjectiveTo explore the impact of sophora on human cervical cancer HeLa cell autophagy and to explore its action mechanism.MethodsDifferent concentrations (1.0, 1.5, 2.0 g·L-1) of sophora was used for human cervical cancer HeLa cells after HSV-2 infection, The cells were collected in a total of 12 hours and 36 hours after RFP-GFP-LC3 and HPV16 DNA transfection, the autophagy activity change was observed by using transmission electron microscopy, SDS polyacrylamide gel electrophoresis and Western Blot detection were used to detect the autophagy related protein LC3-Ⅱ changes in the HeLa cells after HSV-2 infection.ResultsThe autophagosome was obviously increased in the virus infection group, compared with the control group (P<0.05); the autophagy related proteins LC3-Ⅱ content was increased significantly in the virus infection group, compared with the control group (P<0.05).After 48 hours and 72 hours, compared with the control group, 1.0, 1.5, 2.0 g·L-1of sophora could improve the autophagy activity of HeLa cells (P<0.05); the autophagosome was significant increased (P<0.05); the autophagy related protein LC3-Ⅱ was significantly increased (P<0.05), the HSV-2 release drop degree was decreased obviously (P<0.05).ConclusionSophora can improve the autophagy activity of HeLa cells, reduce the release of HSV-2 after virus infection.

HeLa cells; cervical cancer; sophora; cellautophagy; herpes simplex virus 2 type

商丘市科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：153060)

謝春(1974-)，女，副教授，主要從事微生物與免疫研究。E-mail：674434085@qq.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.05.001

R737.33;R730.23

A

1673-5412(2017)05-0369-03

2017-01-23)