丁紅梅 ，劉建華 ，鄭芳 ，賈曙光 ，魏蔚 ，孫曉東 ，趙雁艷 ，孟海妹

（1.河北省唐山市第二醫(yī)院，河北 唐山 063000；2.天津醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，天津 300203；3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，天津 300050）

鈣網(wǎng)織蛋白在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷及活動(dòng)度評估中的作用*

丁紅梅1，劉建華1，鄭芳2，賈曙光1，魏蔚3，孫曉東1，趙雁艷1，孟海妹2

（1.河北省唐山市第二醫(yī)院，河北 唐山 063000；2.天津醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，天津 300203；3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，天津 300050）

目的 探討鈣網(wǎng)織蛋白（CRT）在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）早期診斷和疾病活動(dòng)度評估中的作用及臨床意義。方法 收集45例早期活動(dòng)性RA患者、35例骨性關(guān)節(jié)炎（OA）患者，以及30例正常對照者（HC）的血清標(biāo)本。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測3組患者血清CRT水平，魏氏法檢測紅細(xì)胞沉降率（ESR），免疫散射比濁法檢測C反應(yīng)蛋白（CRP）的水平。采用Spearman對血清CRT水平與疾病活動(dòng)度評分（DAS28）、ESR、CRP進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果RA組血清CRT水平[（6.7±2.5）μg/L]高于OA組[（3.9±0.9）μg/L]和HC組[（3.8±0.7）μg/L]（P＜0.05），OA組與HC組的血清CRT水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與OA組和HC組比較，RA組ESR、CRP水平升高（P＜0.05）；RA組血清CRT水平與DAS28評分、ESR及CRP呈正相關(guān)（rs=0.391、0.459和0.454，P=0.008、0.002和0.002）。結(jié)論 早期活動(dòng)性RA患者血清CRT水平增高，CRT與DAS28評分、ESR及CRP呈正相關(guān)，提示CRT可能成為早期診斷RA，以及輔助ESR、CRP評估RA疾病活動(dòng)度的潛在血清學(xué)指標(biāo)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；鈣網(wǎng)織蛋白；疾病活動(dòng)度；DAS28評分

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以外周關(guān)節(jié)慢性、侵襲性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的免疫介導(dǎo)的疾病，其致殘率在關(guān)節(jié)病中居首位。RA的患病率占世界總?cè)丝诘?.5%～1.0%，我國患病率為0.3%～0.4%，且呈上升趨勢[1-2]。早期診斷和治療、控制疾病活動(dòng)是改善RA患者預(yù)后及降低其致殘率的關(guān)鍵。RA的診斷主要依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查及血清學(xué)檢查等方法。早期RA患者臨床表現(xiàn)多不典型，當(dāng)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和影像學(xué)改變時(shí)，患者已經(jīng)出現(xiàn)骨質(zhì)破壞。因此，尋找更特異、靈敏的血清學(xué)指標(biāo)，指導(dǎo)RA的早期診斷和治療、預(yù)后評估和療效監(jiān)測是目前RA臨床研究的熱點(diǎn)[3-4]。本研究通過分析鈣網(wǎng)織蛋白（Calreticulin，CRT）在RA患者體內(nèi)的表達(dá)特點(diǎn)及其與28個(gè)關(guān)節(jié)病情活動(dòng)度評分（disease activity score for 28 joints，DAS28）、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）和 C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）等活動(dòng)度指標(biāo)的相關(guān)性，進(jìn)一步探討CRT在RA早期診斷及病情評估中的潛在價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年10月-2015年10月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染免疫科和唐山市第二醫(yī)院關(guān)節(jié)外科住院治療患者，其中早期活動(dòng)性RA患者45例，骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）患者35例。早期活動(dòng)性RA患者的納入標(biāo)準(zhǔn)為病程＜12個(gè)月，且未接受緩解病情抗風(fēng)濕藥物（disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs）治療[5]。選取同期收集的 30 例性別、年齡匹配的健康體檢者作為健康對照組（healthy control，HC）。RA和OA患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會（American College of Rheumatology，ACR）修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]和1995年ACR修訂的OA診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。本研究通過河北省唐山市第二醫(yī)院倫理會的審查，并取得受試者的知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

人CRT檢測試劑盒購自上海鑫樂生物科技有限公司，采用BioTek Synergy 2酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）進(jìn)行檢測。人全血CRP采用Nephstar Plus蛋白分析儀（深圳市國賽生物技術(shù)有限公司）及其配套試劑盒進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA） 采集所有受試對象的清晨空腹靜脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。血清CRT的含量應(yīng)用雙抗體夾心法96孔ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.2 魏氏法 應(yīng)用一次性血沉真空采血管（枸櫞酸鈉抗凝管）采集受試者的空腹靜脈血1.6 ml（靜脈血與抗凝劑的比例為4∶1），緩慢顛倒混勻8～10次。將混勻血吸取到魏氏血沉管至0刻度處。將血沉管垂直放置在血沉架上，室溫下靜止1 h，觀察上層血漿高度（mm），即為血沉結(jié)果。正常參考值：男性＜15 mm/h，女性 ＜20 mm/h。

1.3.3 免疫散射比濁法 采集受試者的EDTA抗凝血，吸取2 μl全血標(biāo)本加入預(yù)分裝處理緩沖液的測量杯中，輕搖10 s充分混勻。將量杯放進(jìn)Nephstar Plus蛋白分析儀的測量孔，儀器自動(dòng)檢測并顯示結(jié)果。正常參考值：CRP＜8 mg/L。

1.3.4 RA疾病活動(dòng)度檢測 RA疾病活動(dòng)度測定采用DAS28評分系統(tǒng)，其計(jì)算公式為：DAS28評分=0.56×sqrt（疼痛關(guān)節(jié)數(shù)）+0.28×sqrt（腫脹關(guān)節(jié)數(shù)）+0.7Ln（ESR）+0.014×sqrt（總體疼痛VAS評分）。DAS 28評分≤2.6提示病情緩解，2.6～3.2提示低度活動(dòng)，3.2～5.1提示中度活動(dòng)，＞5.1提示高度活動(dòng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman等級相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

各組在年齡、性別方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組ESR、CRP水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），RA組較OA組、HC組升高。見附表。

2.2 各組血清CRT水平比較

RA組、OA組及HC組的血清CRT濃度分別為（6.7±2.5）、（3.9±0.9）和（3.8±0.7）μg/L，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.409，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較，經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，RA組的血清CRT濃度高于OA組和HC組（P=0.000），而OA組與HC組的血清CRT濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.816）。

2.3 血清CRT與DAS28評分、ESR及CRP的相關(guān)性分析

CRT與DAS28評分呈正相關(guān)（rs=0.391，P=0.008）。ESR、CRP與DAS28評分呈正相關(guān)（rs=0.506和0.530，均P=0.000），且 CRT與 ESR、CRP呈正相關(guān)（rs=0.459和0.454，均P=0.002）。見附圖。

附表 3組患者的臨床資料比較

附圖 RA患者血清CRT水平與DAS28評分、ESR及CRP的相關(guān)分析散點(diǎn)圖

3 討論

RA是最常見的炎性關(guān)節(jié)病，具有較高的致殘率。RA治療的關(guān)鍵在于早期明確診斷和治療，控制疾病活動(dòng)度。因此，正確判斷RA病情的活動(dòng)性對臨床制定治療方案、監(jiān)測療效及預(yù)后評估具有十分重要的指導(dǎo)意義。目前，臨床上評估RA疾病活動(dòng)度的工具主要包括ACR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)、DAS28評分、簡化的疾病活動(dòng)性指數(shù)及臨床疾病活動(dòng)指數(shù)等。盡管DAS28評分是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的療效監(jiān)測及病情活動(dòng)性評估的綜合指標(biāo)，但該評價(jià)方法較為繁雜，限制其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。血清學(xué)指標(biāo)，如ESR和CRP等炎癥標(biāo)志物，常用來反映RA疾病活動(dòng)度。然而，該炎癥指標(biāo)缺乏特異性，而且一部分可能進(jìn)展的RA患者中，并未檢測到ESR和CRP升高。因此，臨床需要尋找更加特異的生物標(biāo)志物，用于開展RA患者的個(gè)性化診療及病情活動(dòng)性評估。近年研究表明，一些生物標(biāo)志物，如血清淀粉樣蛋白A[8]、白介素17[9]等可用來評估RA的病情活動(dòng)度。

CRT是一個(gè)具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，CRT的主要功能包括維持Ca2+穩(wěn)態(tài)、分子伴侶及調(diào)節(jié)MHC-Ⅰ類分子運(yùn)載抗原肽等。此外，CRT還表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜表面及胞外環(huán)境中，參與細(xì)胞的黏附和遷移、傷口愈合、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，以及抗腫瘤免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)活動(dòng)[10-12]。近年來，HONG等[13]發(fā)現(xiàn)，RA患者血清中可溶性CRT濃度高于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者。TARR等[14]研究顯示，CRT在RA患者血漿和滑膜液中表達(dá)升高，并且與疾病活動(dòng)度相關(guān)，CRT可能通過與凋亡蛋白FasL結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而參與RA的發(fā)病。LING等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CRT可作為RA共享表位的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，介導(dǎo)促炎癥信號的傳導(dǎo)。最新研究表明，CRT在RA患者體內(nèi)表達(dá)升高，其可能通過促進(jìn)新生血管形成，參與RA滑膜炎和血管翳形成的病理過程[16]。本研究結(jié)果顯示，RA患者血清CRT水平高于OA組和HC組。本研究納入的研究對象均為早期活動(dòng)性RA患者，初步結(jié)果表明CRT可能成為RA早期診斷及病情評估的潛在血清學(xué)指標(biāo)。

由于DAS28評分是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的評估RA活動(dòng)度及藥物治療效果的綜合指標(biāo)。因此，本研究通過分析CRT水平與DAS28評分的相關(guān)性，進(jìn)而分析CRT能否成為評估RA疾病活動(dòng)度的新的血清學(xué)指標(biāo)。結(jié)果顯示，RA患者血清CRT水平與DAS28評分呈正相關(guān)，提示CRT可作為RA活動(dòng)度評估的潛在指標(biāo)。ESR和CRP是臨床廣泛應(yīng)用的評估RA病情活動(dòng)度的重要血清學(xué)指標(biāo)，因此本研究進(jìn)一步分析CRT與兩者的相關(guān)性。結(jié)果表明，ESR、CRP與DAS28評分呈正相關(guān)，且CRT與ESR、CRP也呈正相關(guān)。以上結(jié)果均提示CRT可能成為輔助ESR、CRP評估RA病情活動(dòng)度的潛在指標(biāo)。本研究納入的樣本數(shù)較少，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，筆者將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

綜上所述，早期活動(dòng)性RA患者血清CRT的濃度升高，且與反映RA病情活動(dòng)度的指標(biāo)DAS28評分，以及血清學(xué)指標(biāo)ESR和CRP呈正相關(guān)，提示CRT可能成為早期診斷RA，以及輔助ESR、CRP評估RA疾病活動(dòng)度的潛在血清學(xué)指標(biāo)。

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Role of calreticulin in early diagnosis and activity assessment of rheumatoid arthritis*

Hong-mei Ding1,Jian-hua Liu1,Fang Zheng2,Shu-guang Jia1,Wei Wei3,Xiao-dong Sun1,Yan-yan Zhao1,Hai-mei Meng2
(1.The Second Hospital of Tangshan,Tangshan,Hebei 063000,China;2.School of Laboratory Medicine,Tianjin Medical University,Tianjin 300203,China;3.Department of Rheumatology and Immunology,General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300050,China)

Objective To investigate the role of calreticulin (CRT)in the diagnosis and assessment of disease activity in the patients with early rheumatoid arthritis(RA).Methods Serum CRT level was measured by ELISA in 45 patients with early RA,35 cases with osteoarthritis(OA)and 30 healthy controls(HC).ESR was measured by the Westergren method.Serum CRP level was measured by immunonephelometry.The correlations of CRT with Disease Activity Score for 28 joints (DAS28 score),ESR and CRP were assessed by Spearman's rank correlation coefficient.Results The serum concentration of CRT of the early RA patients[(6.7±2.5)μg/L]was higher than that of the OA patients and HC[(3.9±0.9)and(3.8±0.7)μg/L,P＜0.05],while there was no significant difference between the OA and HC groups(P＞0.05).Compared with the OA and HC groups,the ESR and CRP levels were elevated in the early RA group (P＜0.05).Serum CRT concentration in the early RA patients was positively correlated with DAS28 score,ESR and CRP (rs=0.391,0.459 and 0.454;P=0.008,0.002 and 0.002).Conclusions Together with ESR and CRP,CRT may be used as a potential biomarker for early diagnosis of RA and for assessment of disease activity.

rheumatoid arthritis;calreticulin;disease activity;DAS28 score

R446.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.010

1005-8982（2017）26-0052-04

2016-05-10

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No：152777157）

（童穎丹 編輯）