楊正貴，季艷艷，何照慶

[貴州盤(pán)江投資控股（集團(tuán)）有限公司總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 六盤(pán)水 553536]

亞抑菌濃度慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌的影響

楊正貴，季艷艷，何照慶

[貴州盤(pán)江投資控股（集團(tuán)）有限公司總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 六盤(pán)水 553536]

目的 探討亞抑菌濃度慶大霉素（GEN）對(duì)銅綠假單胞菌（PAO1）浮游菌和生物膜的影響。方法 采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)PAO1對(duì)GEN的敏感性。采用96孔板比濁法檢測(cè)亞抑菌濃度GEN對(duì)PAO1浮游菌生長(zhǎng)的影響，并通過(guò)結(jié)晶紫染色法檢測(cè)亞抑菌濃度GEN對(duì)PAO1生物膜形成的影響。采用化學(xué)反應(yīng)比色法測(cè)定亞抑菌濃度GEN對(duì)PAO1毒力因子表達(dá)的影響。結(jié)果 GEN對(duì)PAO1的最低抑菌濃度為2 μg/ml；而當(dāng)GEN濃度≤0.250 μg/ml時(shí)，不影響PAO1浮游菌的增殖；當(dāng)GEN為0.125 μg/ml時(shí)，能促進(jìn)PAO1生物膜的形成（P＜0.05），且在一定范圍內(nèi)（0.125～0.250 μg/ml）隨著GEN濃度增高，其促進(jìn)生物膜形成的能力越強(qiáng)；0.125和0.250 μg/ml GEN能促進(jìn)群體密度信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)基因lasI、lasR、rhlI、rhlR、pqsC、pqsD和毒力因子青膿素、彈性蛋白酶、堿性蛋白酶的表達(dá)（P＜0.05），且呈一定的劑量依賴(lài)性。結(jié)論 亞抑菌濃度GEN在一定濃度范圍內(nèi)能促進(jìn)PAO1生物膜的形成，并進(jìn)一步促進(jìn)群體密度信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)基因和毒力因子的表達(dá)。

慶大霉素；壓抑菌濃度；銅綠假單胞菌；生物膜；青膿素；群體密度感應(yīng)

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PAO1）是院內(nèi)感染常見(jiàn)的一種革蘭陰性兼性厭氧菌，常導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染[1]。近年來(lái)，隨著抗生素的不合理應(yīng)用，其耐藥性不斷增強(qiáng)，給臨床治療帶來(lái)極大不便。

銅綠假單胞菌能黏附于物體或人體組織表面，形成生物膜[2]。因物理屏障、滯留菌形成、基因突變率增加等原因，使生物膜狀態(tài)下銅綠假單胞菌的耐藥性大大增強(qiáng)，傳統(tǒng)抗生素難以根治生物膜[3]。然而，殘留在體內(nèi)的亞抑菌濃度（sub-minimal inhibitory concentration，sub-MIC）抗生素對(duì)PAO1浮游菌及生物膜的影響尚未完全闡明。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源及培養(yǎng)條件 銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1由本實(shí)驗(yàn)室置入-20℃冰箱冷凍保存，使用前在羊血瓊脂平板上傳3代，以獲得生理狀態(tài)穩(wěn)定的菌株。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備 慶大霉素（Gentamycin，GEN）購(gòu)自上海阿拉丁試劑生物科技有限公司，Luria-Bertani肉湯和Muller-Hinton肉湯購(gòu)自北京陸橋有限公司，結(jié)晶紫顆粒購(gòu)自天津市化學(xué)試劑一廠，96孔板、二氧化碳CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀等設(shè)備均由貴州盤(pán)江投資控股（集團(tuán)）有限公司總醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.2 方法

1.2.1 PAO1對(duì)GEN的敏感性檢測(cè) 藥敏試驗(yàn)參考微量肉湯稀釋法進(jìn)行[4]。Muller-Hinton肉湯倍比稀釋GEN母液至100μl，加入96孔板。挑取平板上的單個(gè)菌落，用生理鹽水調(diào)為0.5麥?zhǔn)蠞岫?，再用生理鹽水按1∶20進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e向GEN備用96孔板中加入10μl已稀釋好的菌懸液，使最終實(shí)驗(yàn)菌濃度約為5×105集落形成單位（colony-forming units，CFU）/ml。置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育16～20 h，最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）終點(diǎn)即為肉眼所見(jiàn)，能完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗菌藥物濃度。

1.2.2 sub-MIC對(duì)PAO1浮游菌生長(zhǎng)的影響檢測(cè)挑取血瓊脂平板上過(guò)夜培養(yǎng)的單個(gè)菌落于Luria-Bertani肉湯中，37℃過(guò)夜搖菌孵育后，12 000 r/min離心1 min，去除上清液，用含不同亞抑菌濃度GEN的Luria-Bertani肉湯培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌沉淀至600 nm處，光密度（optical density，OD）值調(diào)節(jié)至 0.1，置于恒溫?fù)u床上37℃、180 r/min培養(yǎng)，每隔 4 h取200μl菌懸液于96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)600 nm處的OD值，監(jiān)測(cè)24 h，繪制時(shí)間-生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 sub-MIC對(duì)PAO1生物膜的影響檢測(cè) 挑取血平板上培養(yǎng)出的單個(gè)菌落，加入裝有Luria-Bertani肉湯的離心管，混勻后置于恒溫?fù)u床37℃、180 r/min搖菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用Luria-Bertani肉湯將各菌液600 nm處OD值調(diào)節(jié)至0.5，分別加入稀釋的測(cè)試濃度GEN，加入200μl GEN稀釋好的菌懸液于96孔板中，濕盒37℃靜置培養(yǎng)24 h。用生理鹽水漂洗，去除浮游菌后，分別加入0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫下染色10 min，去除未結(jié)合的結(jié)晶紫，并用生理鹽水漂洗，室溫晾干后分別加入200μl無(wú)水乙醇以洗脫與生物膜結(jié)合的結(jié)晶紫顆粒，在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。

1.2.4 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 參照E.Z.N.A.Total RNA KitⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟提取銅綠假單胞菌的總RNA，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。隨后參照Green One-Step qRT-PCR Super Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量，采用Light Cycler PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：45℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，94℃退火 5 s，60℃延伸 30 s，共45個(gè)循環(huán)。所用引物參考文獻(xiàn)[5]，見(jiàn)附表。

附表 PCR引物及相關(guān)參數(shù)

1.2.5 PAO1毒力因子的檢測(cè) ①青膿素的檢測(cè)：刮取單個(gè)菌落至Luria-Bertani肉湯中，搖床過(guò)夜后，5 210 r/min離心15 min取上清液，加入氯仿，充分振蕩混勻后取無(wú)機(jī)相于另一試管中，加入0.2 mol/L HCl溶液，混勻后靜置5min，至上層變紅。檢測(cè)540nm處的OD值；②彈性蛋白酶的檢測(cè)：搖菌過(guò)夜，離心取上清 750 μl，加入 250 μl 5 mg/ml彈性蛋白剛果紅溶液，37℃、200 r/min搖菌 16 h后，3 000 r/min離心10 min。檢測(cè)490 nm處的OD值，即為彈性蛋白酶的活性；③堿性蛋白酶的檢測(cè)：搖菌過(guò)夜，離心取上清后，按1∶1（v/v）比例與2%偶氮酪蛋白溶液配比，37℃靜置孵育1h，加入10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，檢測(cè)400 nm處OD值，即為堿性蛋白酶的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最低抑菌濃度

GEN對(duì)銅綠假單胞菌PAO1的最低抑菌濃度為 2 μg/ml。

2.2 亞抑菌濃度GEN對(duì)銅綠假單胞菌浮游菌的影響

當(dāng)GEN濃度≤0.250 μg/ml時(shí)，不影響PAO1浮游菌的增殖。而當(dāng)GEN濃度為0.500 μg/ml時(shí)，可部分抑制浮游菌的生長(zhǎng)，且呈濃度依賴(lài)性。隨著GEN的濃度升高至1.000 μg/ml時(shí)，可抑制PAO1浮游菌的生長(zhǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)600 nm處的OD值比未加藥的對(duì)照組低（F=5.017，P=0.001）。見(jiàn)圖 1。

圖1 亞抑菌濃度GEN對(duì)銅綠假單胞菌浮游菌的影響

2.3 一定范圍內(nèi)亞抑菌濃度GEN促進(jìn)銅綠假單胞菌生物膜的形成

亞抑菌濃度GEN對(duì)PAO1的影響呈現(xiàn)多樣性。當(dāng)GEN濃度≥0.125 μg/ml時(shí)，能促進(jìn)或抑制PAO1生物膜的形成，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=84.230，P=0.000）；當(dāng)GEN濃度為0.125和0.250μg/ml時(shí)，能促進(jìn)PAO1生物膜的形成，使OD570nm值從（2.43±0.05）分別增加到（2.98±0.26）和（3.57±0.10）（P＜0.05）；而當(dāng) GEN 的濃度上升至 0.5和1.0μg/ml時(shí)，能抑制生物膜的形成，與未加藥的對(duì)照組比較，可使PAO1的生物膜總量分別從（2.43±0.05）減少到（2.09±0.24）和（1.34±0.11）（P ＜0.05）（見(jiàn)圖2）。當(dāng)GEN濃度≥0.5 μg/ml時(shí)，開(kāi)始抑制PAO1浮游菌的生長(zhǎng)，這可能是0.5 μg/ml GEN抑制生物膜形成的原因之一（見(jiàn)圖1）。

圖2 亞抑菌濃度GEN對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成的影響

2.4 亞抑菌濃度GEN促進(jìn)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)

銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)相關(guān)組份主要包括lasI/R、rhlI/R及pqs系統(tǒng)。與未加抗生素的陰性對(duì)照組比較，0.125和0.250μg/ml GEN能促進(jìn)QS系統(tǒng)相關(guān)基因 lasI、lasR、rhlI、rhlR、pqsC、pqsD 的表達(dá)（F=30.790、23.182、56.874、32.330、150.705 和 61.193，P=0.001、0.001、0.000、0.001、0.000 和 0.000）。0.125 μg/ml GEN 可分別使 lasI、lasR、rhlI、rhlR、pqsC 及pqsD基因的相對(duì)表達(dá)量上升至（1.30±0.18）、（1.60±0.17）、（1.80 ±0.26）、（1.68±0.37）、（1.98±0.15）和（2.03±0.24），經(jīng) SNK-q 檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且隨著GEN濃度上升到0.250 μg/ml時(shí)，其促進(jìn)作用進(jìn)一步增強(qiáng)，可分別使其相對(duì)表達(dá)量上升至（2.30±0.32）、（2.01±0.27）、（2.45±0.13）、（2.76±0.29）、（2.78±0.16）和（2.95±0.29），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

2.5 亞抑菌濃度GEN促進(jìn)銅綠假單胞菌毒力因子的表達(dá)

銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)相關(guān)毒力因子主要包括青膿素、彈性蛋白酶及堿性蛋白酶（或蛋白酶）。0.125和0.250 μg/ml亞抑菌濃度的GEN能促進(jìn)青膿素的表達(dá)，并能增加彈性蛋白酶和堿性蛋白酶的活性（F=140.902、48.733 和 26.515，均 P=0.000）。0.125 μg/ml GEN可分別使青膿素、彈性蛋白酶、堿性蛋白酶毒力因子的相對(duì)表達(dá)量上升至對(duì)照組的（1.54±0.09）、（1.24±0.02）和（1.35±0.14），經(jīng) SNK-q檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且其促進(jìn)作用有一定的劑量依賴(lài)性，即當(dāng)GEN濃度上升到0.250μg/ml時(shí)，GEN抑制毒力因子的能力明顯增強(qiáng)，可分別使青膿素青膿素活性增高至對(duì)照組的（1.87±0.04）、（1.56±0.09）和（1.65±0.07），經(jīng) SNK-q 檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖 4。

圖3 亞抑菌濃度GEN對(duì)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)相關(guān)基因的影響

圖4 亞抑菌濃度GEN對(duì)銅綠假單胞菌毒力因子的影響

3 討論

近年來(lái)，呼吸道痰標(biāo)本銅綠假單胞菌的分離率及耐藥率在不斷增加。除了固有耐藥和基因水平獲得性耐藥，生物膜的出現(xiàn)進(jìn)一步給臨床診療帶來(lái)極大不便。而不合理抗生素的使用常不能根治體內(nèi)的細(xì)菌，殘留的細(xì)菌在殘留亞抑菌濃度抗生素的刺激下，耐藥性進(jìn)一步增加，甚至促進(jìn)生物膜的形成。因此，闡明亞抑菌濃度抗生素對(duì)生物膜的影響及其作用機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)臨床合理使用抗生素至關(guān)重要。

本研究通過(guò)96孔板構(gòu)建生物膜，檢測(cè)亞抑菌濃度GEN對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響。當(dāng)GEN濃度為0.125～0.250 μg/ml時(shí)，可促進(jìn)銅綠假單胞菌生物膜的形成；并進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR和化學(xué)反應(yīng)比色法發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度GEN能促進(jìn)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)相關(guān)基因和毒力因子的表達(dá)。

通過(guò)基因點(diǎn)陣分析發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度的氨基糖苷類(lèi)抗生素能觸發(fā)銅綠假單胞菌基因的廣泛突變，而誘導(dǎo)生物膜的形成。有研究顯示，亞抑菌濃度抗生素對(duì)銅綠假單胞菌的作用靶點(diǎn)是其內(nèi)膜的氨基糖苷反應(yīng)蛋白，該蛋白有環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸（c-di-GMP）二酯酶活性，可被亞抑菌濃度氨基糖苷類(lèi)抗生素所誘導(dǎo)，使第二信使c-di-GMP失活，從而促進(jìn)銅綠假單胞菌生物膜的形成[6]。

細(xì)菌群體密度感應(yīng)系統(tǒng)是生物膜群體之間進(jìn)行通訊的“語(yǔ)言系統(tǒng)”，調(diào)節(jié)整個(gè)生物膜形成的周期[7]。QS系統(tǒng)主要包括Las、Rhl及Pqs系統(tǒng)3個(gè)組份，主要由蛋白lasI/R、rhlI/R及pqsC/D蛋白構(gòu)成，且分別由相應(yīng)的基因編碼[8]。QS系統(tǒng)一方面調(diào)節(jié)生物膜的形成，另一方面還調(diào)控著生物膜毒力因子的表達(dá)，如青膿素、彈性蛋白酶[9]及堿性蛋白酶活性[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度的GEN不僅能促進(jìn)QS系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，而且能促進(jìn)銅綠假單胞菌毒力因子的分泌和活性，進(jìn)一步證明亞抑菌濃度GEN促進(jìn)QS系統(tǒng)的生理功能可能是其促進(jìn)生物膜形成的主要原因之一。

本研究通過(guò)微孔板法構(gòu)建銅綠假單胞菌生物膜，并結(jié)合結(jié)晶紫染色法發(fā)現(xiàn)一定范圍內(nèi)的亞抑菌濃度GEN可促進(jìn)銅綠假單胞菌生物膜的形成，且能促進(jìn)其相關(guān)毒力因子青膿素、彈性蛋白酶及蛋白酶的表達(dá)和活性。亞抑菌濃度GEN促進(jìn)QS系統(tǒng)的相關(guān)表達(dá)可能是導(dǎo)致這些效應(yīng)的主要原因。因此，臨床治療銅綠假單胞菌生物膜感染時(shí)，應(yīng)考慮到亞抑菌濃度GEN對(duì)生物膜的影響，合理使用抗生素才能達(dá)到事半功倍的效果。

[1]POBIEGA M,MACIAG J,CHMIELARCZYK A,et al.Molecular characterization of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains isolated from patientswith urinarytractinfectionsin Southern Poland[J].Diagn Micro Infect Dis,2015,83(3):295-297.

[2]GUPTA P,SARKAR S,DAS B,et al.Biofilm,Pathogenesis and prevention-a journey to break the wall:a review[J].Arch Microbiol,2016,198(1):1-15.

[3]TAYLOR P K,YEUNG A T,HANCOCK R E.Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms:towards the development of novel anti-biofilmtherapies[J].J Biotechnol,2014,191:121-130.

[4]Clinical and Laboratory Standards Institute.Clinical and laboratory standards institute(CLSI)Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].2013:1.

[5]KIM H S,LEE S H,BYUN Y,et al.6-Gingerol reduces Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and virulence via quorum sensing inhibition[J].Sci Rep,2015,5:8656.

[6]VALENTINI M,FILLOUX A.Biofilms and cyclic di-GMP(c-di-GMP)signaling:lessons from Pseudomonas aeruginosa and other bacteria[J].J Biol Chem,2016,291(24):12547-12555.

[7]BRACKMAN G,COENYE T.Quorum sensing inhibitors as anti-biofilm agents[J].Curr Pharm Des,2015,21(1):5-11.

[8]SOLANO C,ECHEVERZ M,LASA I.Biofilm dispersion and quorum sensing[J].Curr Opin Microbiol,2014,18:96-104.

[9]BEN HAJ KHALIFA A,MOISSENET D,VU THIEN H,et al.Virulence factors in Pseudomonas aeruginosa:mechanisms and modes of regulation[J].Ann Biol Clin(Paris),2011,69(4):393-403.

[10]AYBEY A,DEMIRKAN E.Inhibition of quorum sensing-controlled virulence factors in Pseudomonas aeruginosa by human serum paraoxonase[J].J Med Microbiol,2016,65(2):105-113.

Effet of sub-minimal inhibitory concentration of Gentamycin onPseudomonas aeruginosa

Zheng-gui Yang,Yan-yan Ji,Zhao-qing He
(Clinical Laboratory,General Hospital in Panjiang Investment Holding Co.Ltd.,Liupanshui,Guizhou 553536,China)

Objective To study the effect of Gentamycin of sub-minimal inhibitory concentration(sub-MIC)onPseudomonas aeruginosa.Methods Microdilution method was used to detect the sensitivity ofP.aeruginosa to Gentamycin.And the turbidity method was used to check the effect of sub-MIC of Gentamycin on the growth ofP.aeruginosaplanktonic bacteria.Then,crystal violet method was used to explore the effect of sub-MIC Gentamycin on the biofilm formation ofP.aeruginosa.Finally,chemical colorimetric method was utilized to test the effect of sub-MIC Gentamycin on the virulence factor production ofP.aeruginosa.Results The MIC of Gentamycin onP.aeruginosawas 2 μg/ml.Gentamycin ≤0.250 μg/ml had no influence on the growth ofplanktonic bacteria.Gentamycin could significantly enhance the biofilm formation at the concentration of 0.125-0.250 μg/ml and in a dose-dependent manner(P ＜ 0.05).At the same time,0.125 and 0.250 μg/ml Gentamycin could significantly promote the expressions of the quorum sensing system(QS)related geneslasI,lasR,rhlI,rhlR,pqsC andpqsD,and the virulence factors pyocyanin,elastase and alkaline protease in a dose-dependent manner(P＜0.05).Conclusions sub-MIC Gentamycin could enhance the biofilm formation and the expressions of QS related genes and virulence factors.

sub-MIC;Gentamycin;Pseudomonas aeruginosa;biofilm;pyocyanin;quorum sensing

R96

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.007

1005-8982（2017）26-0035-05

2016-09-20

（童穎丹 編輯）