徐靖宇 ，帥張麗 ，謝遠(yuǎn) ，龍從風(fēng) ，石國慶

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 遵義 563003）

TGF-β1、BMP-7 及 Gremlin 在小鼠肝纖維化組織中的表達*

徐靖宇1，帥張麗1，謝遠(yuǎn)2，龍從風(fēng)2，石國慶1

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 遵義 563003）

目的研究四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)小鼠肝纖維化組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、骨形態(tài)發(fā)生蛋7（BMP-7）及Gremlin的表達，探討其在肝纖維化發(fā)生機制中的作用。方法 雄性C57小鼠40只，分為實驗組和對照組，每組20只。實驗組給予腹腔注射40%CCl4橄欖油溶液，10 ml/kg；對照組腹腔注射橄欖油溶液，10 ml/kg，2次/周，持續(xù)8周。蘇木精-伊紅染色后觀察肝纖維化程度，免疫組織化學(xué)法染色后分析TGF-β1、BMP-7及Gremlin在肝纖維中組織中的表達和分布，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和Western blot檢測TGF-β1、BMP-7及Gremlin在正常和纖維化肝組織中mRNA和蛋白的表達。結(jié)果 TGF-β1和Gremlin在肝纖維化組織中mRNA和蛋白表達增強（P＜0.05），而BMP-7在肝纖維化組織中表達降低（P＜0.05）。結(jié)論 TGF-β1、Gremlin的表達與肝纖維化呈正相關(guān)，BMP-7與肝纖維呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Gremlin可能通過下調(diào)BMP-7的表達，誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生。

轉(zhuǎn)化生長因子β1；骨形態(tài)發(fā)生蛋白7；Gremlin；肝纖維化

肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵是肝星狀細(xì)胞（hepatie stellate cells，HSC）的激活，產(chǎn)生大量間質(zhì)膠原，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluar matrix，ECM）過度沉積[1]。目前認(rèn)為，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是 HSC 激活最重要的細(xì)胞因子[2]。研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（Bone morphogenetic protein7，BMP-7）和BMP拮抗蛋白Gremlin參與肝纖維化的發(fā)生[3-4]，但其作用機制仍不清楚。本文通過研究四氯化碳CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化組織中TGF-β1、BMP-7及Gremlin的表達，進一步探討其在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用及其相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57小鼠，體質(zhì)量20～40 g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2012-2016。正常喂養(yǎng)，自由飲水，自然采光，室溫15～25℃，實驗前適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2 主要藥品與試劑

CCl4（濟南云翔化工有限公司），橄欖油（上海阿拉丁試劑公司），Gremlin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），BMP-7和TGF-β1多克隆抗體（美國Abcam公司），RIPA蛋白裂解液（北京索萊寶生物科技公司），BCA蛋白定量試劑盒（上海捷瑞生物工程公司），蛋白分子 Marker、Trans Zol Up、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴增酶均購自北京全式金公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型復(fù)制 健康雄性C57小鼠40只，隨機分為對照組和實驗組，每組20只，實驗組給予腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液，10 ml/kg，2次/周，模型復(fù)制8周；對照組腹腔注射橄欖油溶液，10 ml/kg。8周后處死動物，剖腹取肝組織2塊，用甲醛固定、石蠟包埋備用。其余肝組織于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蘇木精 -伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色 石蠟包埋的小鼠肝臟標(biāo)本連續(xù)切片，厚4 μm，常規(guī)脫蠟至水；蘇木精溶液染色數(shù)分鐘，酸水和氨水中分色各數(shù)秒鐘，流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻，70%和90%酒精中脫水各10 min，伊紅染色液染色2～3 min，純酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法染色 石蠟包埋的小鼠肝臟標(biāo)本連續(xù)切片，厚4 μm，常規(guī)脫蠟至水；3%過氧化氫溶液室溫培育10 min以封閉非特異性抗原，抗原修復(fù)；PBS液沖洗3次，3 min/次；滴加一抗，置37℃溫箱孵育1 h；PBS液沖洗3次，3 min/次；滴加二抗，置37℃溫箱孵育30 min；PBS液沖洗3次，3 min/次；滴加 DAB 顯色劑（1∶50），1～2 min；自來水沖洗，蘇木素復(fù)染；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。隨機選擇5個視野，使用Image J分析視野下的陽性部位面積，然后取平均值。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 采用qRT-PCR檢測小鼠正常肝組織和肝纖維化組織中TGF-β1、BMP-7及Gremlin mRNA的表達。取小鼠肝組織剪碎、研磨、離心，按Trizol試劑盒說明書抽取總RNA。PCR反應(yīng)體系為20μl，擴增條件：95℃預(yù)變性3 min，60℃變性30 s，共40個循環(huán)；65℃退火10 s，65℃延伸10 s，共61個循環(huán)，每次PCR反應(yīng)均以無菌雙蒸水代替cDNA模板作為陰性對照。擴增后的產(chǎn)物在4℃用于PCR瓊脂凝膠電泳。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.5 Western blot檢測 采用Western blot檢測小鼠正常肝組織和肝纖維化組織中TGF-β1、BMP-7及Gremlin蛋白的表達，取小鼠肝組織剪碎，經(jīng)勻漿、裂解、離心，提取蛋白質(zhì)，然后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別用 Gremlin（1∶100）、BMP-7（1∶200）、TGF-β1（1∶400）、β-actin（1∶5000）4℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫 1 h，ECL 曝光顯影，用 Quantity One軟件對印跡條帶進行灰度測定。以β-actin表達水平作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝組織病理觀察

HE染色證明CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型復(fù)制成功。鏡檢觀察顯示，對照組小鼠肝臟無異常病理改變，肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，大小均勻，且細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，細(xì)胞無壞死，水腫，無炎癥細(xì)胞浸潤（見圖1A）；實驗組小鼠肝臟炎癥明顯，肝細(xì)胞廣泛變性壞死，細(xì)胞腫脹，匯管區(qū)大量纖維組織增生，伴大量炎癥細(xì)胞浸潤（見圖1B）。

圖1 兩組小鼠肝臟組織病理形態(tài)改變（HE染色，標(biāo)尺50μm）

2.2 兩組小鼠肝組織中 TGF-β1、BMP-7及Gremlin蛋白表達

TGF-β1在對照組小鼠肝組織中呈弱表達，在實驗組中表達增強（P＜0.05）；Gremlin在對照組小鼠肝組織中無表達，在實驗組中表達增強（P＜0.05），在細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜均有表達；而BMP-7在對照組小鼠肝組織中表達較強，在實驗組中表達減弱（P＜0.05）。見表2和圖2。

表2 兩組小鼠肝組織中TGF-β1、BMP-7及Gremlin蛋白表達的比較 （n=20，±s）

表2 兩組小鼠肝組織中TGF-β1、BMP-7及Gremlin蛋白表達的比較 （n=20，±s）

組別 TGF-β1 BMP-7 Gremlin對照組 0.053±0.006 4.275±0.635 0.072±0.071實驗組 3.131±0.327 1.025±0.136 3.375±0.221 t值 4.132 4.423 4.578 P值 0.014 0.011 0.010

圖2 兩組小鼠肝組織中TGF-β1、BMP-7及Gremlin蛋白的表達 （免疫組織化學(xué)法染色，標(biāo)尺50μm）

2.3 兩組小鼠肝組織中 TGF-β1、BMP-7和Gremlin mRNA的表達

實驗組小鼠肝組織中TGF-β1mRNA表達量為（1.733±0.120），對照組為（1.006±0.0433），兩組小鼠肝組織中TGF-β1mRNA表達水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.500，P=0.005），實驗組較對照組升高。實驗組小鼠肝組織中Gremlin mRNA表達量為（1.950±0.180），對照組為（1.021±0.051），兩組小鼠肝組織中Gremlin mRNA表達水平比較，經(jīng) t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.019，P=0.007），實驗組較對照組升高。實驗組小鼠肝組織中BMP-7 mRNA 表達量為（0.533±0.120），對照組為（1.055±0.063），兩組小鼠肝組織中BMP-7 mRNA表達水平比較，經(jīng) t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.500，P=0.024），實驗組低于對照組。見圖3。

2.4 兩組小鼠肝組織中 TGF-β1、BMP-7及Gremlin蛋白表達的Western blot結(jié)果

實驗組小鼠肝組織中TGF-β1蛋白相對表達量為（1.610±0.201），對照組為（1.012±0.058），兩組小鼠肝組織中TGF-β1蛋白表達水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.916，P=0.043），實驗組較對照組升高。實驗組小鼠肝組織中Gremlin蛋白相對表達量為（1.833±0.260），對照組為（1.008±0.058），兩組小鼠肝組織中Gremlin蛋白表達水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.125，P=0.035），實驗組較對照組升高。實驗組小鼠肝組織中BMP-7蛋白相對表達量為（0.567±0.120），對照組為（1.021±0.050），兩組小鼠肝組織中BMP-7蛋白A表達水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.250，P=0.031），實驗組低于對照組。見圖4。

圖3 兩組小鼠肝組織中TGF-β1、BMP-7及Gremlin mRNA的表達

圖4 兩組小鼠肝組織中TGF-β1、BMP-7及Gremlin蛋白的表達 （Western blot）

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病損傷的共同結(jié)果，也是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的重要中間環(huán)節(jié)[5]。目前研究認(rèn)為，肝纖維化形成的重要誘因是肝組織損傷后分泌大量的促肝纖維化細(xì)胞因子，該促肝纖維化因子表達增強，最終誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生，但其具體機制仍不清楚。

TGF-β1分泌增多是誘發(fā)肝纖維化的一個重要誘因，肝臟中的TGF-β1合成主要通過自分泌和旁分泌2種方式。文獻報道，TGF-β1在肝纖維化時含量高，并促使成纖維細(xì)胞的活化、增生級表型轉(zhuǎn)化[6]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中TGF-β1mRNA和蛋白表達均增高。在肝纖維化形成過程中大量TGF-β1在胞外被激活，并與活化的HSC等細(xì)胞胞膜上特異受體Ⅰ、Ⅱ結(jié)合，繼而激活Smads，介導(dǎo)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使ECM等目的基因轉(zhuǎn)錄并高表達，導(dǎo)致纖維化形成[7]。同時本實驗結(jié)果進一步發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化組織中BMP-7的核酸及蛋白表達降低。BMP-7是一種分泌性多功能蛋白，是TGF-β超家族成員，在胚胎的發(fā)生、發(fā)育，組織及細(xì)胞的分化、增生等方面都發(fā)揮重要作用[8]。激活BMP-7能夠阻斷TGF-β1的信號通路，抑制纖維細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)化，逆轉(zhuǎn)TGF-β1的促肝纖維細(xì)胞纖維化[9]。BMP-7對肝臟有一定保護作用，該保護不僅取決于自身，也與在肝纖維形成過程中BMP-7激動劑和拮抗劑的平衡有關(guān)，TGF-β1和BMP-7在肝纖維化的過程中相互拮抗。研究證實，TGF-β誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化主要由于激活Smad-2/3發(fā)揮作用的過程中，BMP-7也通過激活Smad-1/5/8的磷酸化，抑制TGF-β/Smad信號通路的作用[10]。目前，BMP-7/Smads信號通路是公認(rèn)的抑制肝纖維化形成過程中的重要信號通路，但是TGF-β1本身并非BMP-7受體的配體，不具備調(diào)節(jié)BMP-7表達及其相關(guān)的信號傳導(dǎo)的作用。有文獻指出，TGF-β1是通過調(diào)節(jié)其下游信號因子Gremlin，并拮抗BMP-7的表達及活性，促使肝纖維化的形成[11]。Gremlin是一種分泌型蛋白，Gremlin基因最早從爪蟾中樞神經(jīng)脊中克隆出來，主要存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體管腔中，也存在于細(xì)胞表面，以非共價鍵形式與細(xì)胞膜相連[12]。在成骨細(xì)胞分化過程中，Gremlin作為BMP的拮抗劑在成骨細(xì)胞中表達，具有拮抗BMP對成骨細(xì)胞分化的功能[13]。免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)Gremlin可以與BMP2、BMP4、BMP7 等直接相互作用[14]。本實驗結(jié)果證實，在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化組織中Gremlin的核酸及蛋白表達升高，與TGF-β1表達呈正相關(guān)，該結(jié)果提示TGF-β1可以正向促進Gremlin的表達，拮抗BMP-7的抗纖維化作用。

綜上所述，本研究通過CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，同時檢測TGF-β1、BMP-7及Gremlin在小鼠肝纖維化和正常小鼠肝組織中的表達。結(jié)果顯示，TGF-β1和Gremlin在纖維化肝組織中的mRNA和蛋白表達均增強，而BMP-7在纖維化肝組織中的mRNA和蛋白表達均減弱。說明TGF-β1、BMP-7及Gremlin與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其機制可能是TGF-β1在肝纖維化組織中過表達，進而激活其下游的信號因子Gremlin，活化的Gremlin進一步拮抗BMP-7的生理功能，抑制BMP-7/Smad信號通路，從而誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生。

[1]MOREIRA R K.Hepatic stellate cells and liver fibrosis[J].Arch Pathol Lab Med,2007,131(11):1728-1734.

[2]DOOLEY S,DIJKE P T.TGF-β in progression of liver disease[J].Cell Tissue Res,2012,347(1):245-256.

[3]YANG T,CHEN S L,LU X J,et al.Bone morphogenetic protein 7 suppresses the progression of hepatic fibrosis and regulates the expression of gremlin and transforming growth factor β1[J].Mol Med Rep,2012,6(1):246-252.

[4]GUIMEI M,BADDOUR N,ELKAFFASH D,et al.Gremlin in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma complicating chronic hepatitis C:animmuno histochemical and PCR study of human liver biopsies[J].BMC Res Notes,2012,5:390.

[5]Ramón Bataller and David A.Brenner liver fibrosis[J].J Clin Invest,2005,115(2):209-218.

[6]CHEN Y L,LV J,YE X L,et al.Sorafenib inhibits transforming growth factor β1-mediated epithelial-mesenchymal transition and apoptosis in mouse hepatocytes[J].Hepatology,2011,53(5):1708-1718.

[7]XU F,LIU C,ZHOU D,et al.TGF-β/SMAD pathway and its regulation in hepatic fibrosis[J].J Histochem Cytochem,2016,64(3):157-167.

[8]WANG L P,DONG J Z,XIONG L J,et al.BMP-7 attenuates liver fibrosis via regulation of epidermal growth factor receptor[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(7):3537-3547.

[9]ZHAO Y L,ZHU R T,SUN Y L.Epithelial-mesenchymal transition in liver fibrosis[J].Biomed Rep,2016,4(3):269-274.

[10]HASEBE T,TANAKA H,SAWADA K,et al.Bone morphogenetic protein-binding endothelial regulator of liver sinusoidal endothelial cells induces iron overload in a fatty liver mouse model[J].J Gastroenterol,2017,52:341-351.

[11]ZHAO X K,CHENG M L,WU R M,et al.Effect of Danshao Huaxian capsule on Gremlin and bone morphogenetic protein-7 expression in hepaticfibrosis in rats[J].World J Gastroenterol,2014,20(40):14875-14883.

[12]HSU D R,ECONOMIDES A N,WANG X,et al.The Xenopus dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities[J].Mol Cell,1998,1(5):673-683.

[13]GAZZERRO E,PEREIRA R C,JORGETTI V,et al.Skeletal overex-pression of gremlin impairs bone formation and causes os-teopenia[J].Endocrinology,2005,146:655-665.

[14]MERINO R,RODRIGUEZ-LEON J,MACIAS D,et al.The BMP antagonist Gremlin regulates outgrowth,chondrogenesis and programmed cell death in the developing limb[J].Development,1999,126(23):5515-5522.

Expressions of TGF-β1,BMP-7 and Gremlin in CCl4-induced liver fibrosis tissue of mice*

Jing-yu Xu1,Zhang-li Shuai1,Yuan Xie2,Cong-feng Long2,Guo-qing Shi1
(1.Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563000,China;2.Department of Physiology,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563003,China)

Objective To study the expressions of transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1),bone morphogenetic protein 7 (BMP-7)and Gremlin in the liver fibrosis induced by carbon tetrachloride (CCl4)in mice,and to investigate their roles in the pathogenesis of hepatic fibrosis.Methods Forty male C57 mice were randomly divided into control group and experimental group.In the experimental group,acute liver injury of mice was induced by intraperitoneal injection of 40%CCl4olive oil solution,10 ml/kg,while the control group was injected with olive oil,twice a week for 8 weeks.After 8 weeks the mice were sacrificed,and the liver tissue was fixed.Hematoxylin-eosin (HE)staining was used to observe the degree of liver fibrosis.The expressions and distribution of TGF-β1,BMP-7 and Gremlin in the control and experimental groups were detected through immunohistochemical staining.qR-PCR detecting system and Western blot were utilized for detection of mRNA and protein expressions of TGF-β1,BMP-7 and Gremlin in the normal and fibrotic liver tissues.Results In the experimental group,both mRNA and protein expressions of TGF-β1and Gremlin in the liver fibrosis tissue were significantly enhanced (P＜0.05).However,the expression of BMP-7 in the liver fibrosis tissue was significantly decreased(P＜0.05).The expression levels of TGF-β1and Gremlin were positively related to hepatic fibrosis,while BMP-7 was negatively correlated to hepatic fibrosis(P＜0.05).Conclusions Gremlin may induce the occurrence of liver fibrosis by down-regulation of BMP-7 expression.

TGF-β1;BMP-7;Gremlin;hepatic fibrosis

R575.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.003

1005-8982（2017）26-0013-05

2016-09-21

貴州省科學(xué)技術(shù)基金[No：黔科合J字（2012）2359號]

石國慶，E-mail：sgqing973@sina.com；Tel：13885286069

（童穎丹 編輯）