胡 朋 王 磊 何艷玲，2*

（1.北京陸橋技術股份有限公司 北京 100123；2.中國檢驗檢疫科學研究院）

4種含七葉苷培養(yǎng)基對單增李斯特菌檢測效果的比較研究

胡 朋1王 磊1何艷玲1，2*

（1.北京陸橋技術股份有限公司 北京 100123；2.中國檢驗檢疫科學研究院）

為了比較研究4種含七葉苷的單增李斯特菌選擇性分離培養(yǎng)基 （PALCAM、OXA、OXA和LPM）對單增李斯特菌的檢測效果，參考國標GB4789.28-2013的方法對4種選擇性分離培養(yǎng)基上目標菌的生長率和非目標菌的抑制性進行比較；通過人工污染樣品試驗比較4種分離培養(yǎng)基對單增李斯特菌的檢測效果。結果顯示目標菌在LMP上的生長率最低，其余3種分離培養(yǎng)基的生長率差異不大；綜合比較對非目標菌的抑制性，PALCAM最佳；樣品中添加陽性菌株實驗表明LMP的靈敏度最低；檢測雜菌較少的樣品時，PALCAM、OXA和MOX的選擇性靈敏度差異不大，而檢測雜菌較多的樣品時，PALCAM的選擇性靈敏度最高。

單增李斯特菌；分離培養(yǎng)基；生長率；靈敏度

1 前言

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）為重要的食源性致病菌，雖然當前有很多快速檢測方法已成功應用于該菌的檢測，但獲得活的細菌分離株仍然是流行病學調查和常規(guī)檢測中的關鍵步驟。為了獲得分離培養(yǎng)的單增李斯特菌，一般是先經過選擇性肉湯增菌，然后將肉湯培養(yǎng)物接種單增李斯特菌的選擇分離平板[1]。由于不同的選擇體系對單增李斯特菌的分離效果不同，國內外標準在檢測樣品中的單增李斯特菌時一般選用兩種不同選擇體系的分離培養(yǎng)基——李斯特菌顯色培養(yǎng)基和含七葉苷的分離培養(yǎng)基。含七葉苷的分離培養(yǎng)基有很多，如ISO標準以OXA和PALCAM為選擇性分離培養(yǎng)基[2]；美國FDA標準以OXA、PALCAM、LPM和MOX為選擇性分離培養(yǎng)基[3]；AOAC Official Method以OXA和LPM為選擇性分離培養(yǎng)基[4]；2016版食品安全國家標準GB4789.30-2016《單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》以PALCAM為選擇性分離培養(yǎng)基[5]。為了比較上述4種含七葉苷的分離培養(yǎng)基對單增李斯特菌檢測效果的影響，本研究通過培養(yǎng)基生長特性、選擇性以及人工污染樣品實驗對4種分離培養(yǎng)基進行比較，為廣大檢測工作者選擇合適的檢測方法提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 培養(yǎng)基

牛津瓊脂（OXA）、PALCAM培養(yǎng)基（PALCAM）、瓊脂（LPM）、改良牛津瓊脂（MOX）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、腦心浸液肉湯：以上培養(yǎng)基均由北京陸橋技術股份公司提供。

2.1.2 試驗菌株

單 增 李 斯 特 菌 （Listeria monocytogenes）（ATCC19111）、單增李斯特菌 （Listeria monocytogenes）（ATCC19115）、大腸埃希菌（Escherichia coli）（ATCC25922）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）（ATCC29212）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC6538）：以上菌株購于ATCC菌株保藏機構。

2.1.3 樣品

需冷藏的奶類（酸奶、巴氏消毒奶）、常溫儲存奶類（巴氏滅菌酸奶、利樂包純牛奶）、速凍包類（速凍餃子、包子）、肉餡類、生食蔬菜類、熟食類（涼拌菜、熟肉、真空包裝即食肉類）、蛋糕類（面包、蛋糕、餅干）、豆制品類（即食包裝豆腐、豆絲、豆干）、雪糕類（冰棍、冰激凌）：共9類101個樣品，均購于某大型超市。

2.2 方法

2.2.1 生長率試驗

采用定量方法進行，參考GB 4789.28-2013《食品微生物學檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質量要求》[6]。將上述菌株分別接種到腦心浸液肉湯，置36℃±1℃培養(yǎng)24 h；將肉湯進行10倍梯度稀釋，單增李斯特菌選取10-6～10-7濃度的菌懸液各0.1mL涂布于各選擇性分離培養(yǎng)基，同時接種參比培養(yǎng)基TSA-YE，每種培養(yǎng)基進行5個重復，于36℃±1℃培養(yǎng)24～48 h。

選擇菌落數適中的平板進行計數，按下列公式計算生長率PR。

式中：PR-生長率；NS-待測培養(yǎng)基平板上得到的平均菌落數；N0-參比培養(yǎng)基平板上獲得的平均菌落數

2.2.2 對非目標菌的抑制性試驗

采用半定量方法進行，參考GB 4789.28-2013。

2.2.3 選擇性靈敏度試驗

在食品樣品中分別添加10-8、10-9兩個濃度的單增李斯特菌（ATCC19111和ATCC19115），同時對添加的菌量以傾注法計數，經過LB1和LB2兩步增菌后，定性方法接種4種選擇性分離培養(yǎng)基。同時以無樣品添加的培養(yǎng)基為對照。

3 結果

3.1 4種分離培養(yǎng)基的生長率比較

生長率試驗結果見表1和表2。結果顯示，兩株單增李斯特菌 （ATCC19115和 ATCCA19111）在LMP培養(yǎng)基上的生長率最低，其余3種分離培養(yǎng)基的生長率比較接近，差異不大。

表1 單增李斯特菌ATCC19115在4種分離平板上的計數結果（培養(yǎng)48 h）

表2 單增李斯特菌ATCC19111在4種分離平板上的計數結果（培養(yǎng)48 h）

3.2 4種分離培養(yǎng)基對非目標菌的抑制性比較

試驗結果見表3。綜合考慮4種分離培養(yǎng)基對3種非目標菌的抑制性，PALCAM的抑制性最好。

表3 4種分離培養(yǎng)基對非目標菌的抑制性比較（G值）

3.3 4種分離培養(yǎng)基的選擇性靈敏度比較

試驗結果見表4、表5。

表4 4種分離培養(yǎng)基的選擇性靈敏度比較（樣品中添加單增李斯特菌ATCC19115）

表5 4種分離培養(yǎng)基的選擇性靈敏度比較（樣品中添加單增李斯特菌ATCC19111）

（1）4種分離培養(yǎng)基對樣品中添加單增李斯特菌ATCC19115和ATCC19111的選擇性分離效果無差別。

（2）LPM瓊脂的選擇性靈敏度最低，含雜菌較少的樣品與對照培養(yǎng)基一致，可分離得到少量的單增李斯特菌，而含雜菌較多的樣品，則無法分離得到單增李斯特菌。

（3）對于其余的3種分離培養(yǎng)基（PALCAM、OXA、MOX），含雜菌較少的樣品與對照培養(yǎng)基一致，3種分離培養(yǎng)基的選擇性靈敏度無差異；而對于含雜菌較多的樣品，PALCAM培養(yǎng)基的選擇性靈敏度最高，所含雜菌最少，分離得到的單增李斯特菌也最多。

（續(xù)表5）

4 結論

從生長率試驗可以得出，兩株單增李斯特菌的陽性菌在LMP的生長率均小于其他3個分離培養(yǎng)基，可能是由于LMP中的營養(yǎng)成分較少，只含有胰酪胨、蛋白胨和牛肉粉，且含量較少，不利于單增李斯特菌的生長。綜合評價4種分離培養(yǎng)基對非目標菌的抑制性可以得出，PALCAM的抑制性最好，可能與該培養(yǎng)基中的抑菌成分和抗生素用量有關。

4種分離培養(yǎng)基在人工污染樣品試驗中，對相對較干凈的樣品，由于含雜菌較少，對目標菌的干擾性較小，4種分離培養(yǎng)基的選擇性靈敏度與其對照試驗的結果一致，除了LPM靈敏度較差外，其余3種分離培養(yǎng)基無明顯差異；而對相對較臟的樣品，由于雜菌含量較多，與目標菌呈競爭生長的關系，從而影響目標菌的分離。綜合以上相對較臟樣品的分離結果，只有PALCAM對目標菌的分離效果與對照試驗保持一致，而OXA和MOX在檢測某些樣品時分離得到的目標菌很少，只在一區(qū)有培養(yǎng)基變黑的現象，難以得到單菌落，需要多次分純，說明OXA和MOX培養(yǎng)基受樣品中雜菌的影響較PALCAM大。綜上所述，PALCAM是單增李斯特菌選擇性分離的理想培養(yǎng)基。

[1] 程潔，張曉峰.單增李斯特菌選擇性增菌培養(yǎng)和分離方法的比較研究[J].檢驗檢疫科學，2003，13（6）：36-38.

[2] ISO 11290-1：1996 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for thedetection and enumeration of Listeria monocytogenes-part1：Detection method[S].

[3] Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes in Foods// Bacteriological Analytical Manual，2016，Chapter 10.

[4] Listeria monocytogenes in Milk and Dairy Products[S].AOAC Official Method 993.12，1993.

[5] GB4789.30-2016單核細胞增生李斯特氏菌檢驗[S].

[6] GB 4789.28-2013食品微生物學檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質量要求[S].

Comparative Study on the Effect of Four Kinds of Aescin-Containing Cultures on the Detection of Listeria monocytogenes

HU Peng1，WANG Lei1，HE Yanling1，2*
（1.Beijing Landbridge Technology Co.，Ltd.，Beijing，100123；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine）

In order to study the effects of fourdifferent seizures ofListeria monocytogenes（PALCAM，OXA，OXA and LPM）onListeria monocytogenes，the results with GB4789.28-2013 method was used to compare the growth rate of target bacteria and the inhibition of non-target bacteria on four selective isolation medium.And the testing effects of four mediums toListeria monocytogenesby artificially polluted samples were compared.The results showed that the growth rate of target bacteria was the lowest in LMP，the other three kinds of mediums were notdifferent.Comparing with the inhibition on non-target bacteria，PALCAM was the best.The positive strains added experiment showed that the selective sensitivity of PALCAM，OXA and OXA was not verydifferent when samples with less bacteriadetected. And the selective sensitivity of OXA/MOX was not as good as that of PALCAM when samples with more bacteriadetected.

Listeria monocytogenes；Isolate Medium；Growth Rate；Selective Sensitivity

TS207.4

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2017-03-13