湯蓓 石鍵 周玲 沈紅衛(wèi) 吳慧平 胡佳元 鄭紹儉

線粒體Omi/HtrA2信號通路參與人腦挫裂傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究

湯蓓 石鍵 周玲 沈紅衛(wèi) 吳慧平 胡佳元 鄭紹儉

目的揭示人腦急性創(chuàng)傷性腦損傷后Omi/HtrA2介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡線粒體途徑的激活。方法選擇100例腦外傷開顱手術(shù)中獲得的腦挫裂傷腦組織作為外傷組，另外選擇100例腦出血患者手術(shù)徑路中獲得的正常腦組織作為對照組，采用流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡，采用Western-blot檢測Omi/HtrA2、X染色體連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）、pro-caspase 3、pro-caspase 9和剪切聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶（PARP）表達(dá)，采用四肽熒光底物法檢測caspase 3和caspase 9活性。結(jié)果外傷組腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例、Omi/HtrA2、pro-caspase 3、pro-caspase 9和剪切PARP表達(dá)及caspase 3和caspase 9活性較對照組顯著升高（均P＜0.01），外傷組腦組織XIAP表達(dá)較對照組顯著下降（P＜0.01）。外傷組腦組織Omi/HtrA2表達(dá)與凋亡神經(jīng)細(xì)胞比率、pro-caspase 3、pro-caspase 9和剪切PARP表達(dá)及caspase 3和caspase 9活性呈顯著正相關(guān)（均P＜0.01），與XIAP表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；外傷組腦組織XIAP表達(dá)與凋亡神經(jīng)細(xì)胞比率、pro-caspase 3、pro-caspase 9和剪切PARP表達(dá)及caspase 3和caspase 9活性呈顯著負(fù)相關(guān)（均P＜0.01）。結(jié)論Omi/HtrA2介導(dǎo)的線粒體途徑可能參與人急性創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程。

人類創(chuàng)傷性腦損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡Omi/HtrA2

線粒體凋亡途徑是急性創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的主要途徑之一[1-3]。Omi/HtrA2作為一種線粒體絲氨酸蛋白酶，可降解染色體連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP），解除對caspase蛋白的活性抑制，從而激發(fā)細(xì)胞凋亡[4-11]。動物實驗證實，Omi/HtrA2介導(dǎo)的線粒體信號通路參與了膿毒癥、癲癇和腦缺血/灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程[12-14]。本研究通過檢測人腦挫裂傷腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞，觀察Omi/HtrA2、XIAP、剪切聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶（PARP）、pro-caspase 3和pro-caspase 9等表達(dá)情況，揭示人腦急性腦損傷后Omi/HtrA2介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡線粒體信號途徑的激活，從而為臨床急性腦損傷病理生理機(jī)制和分子治療的研究提供新方向。

1 對象和方法

1.1 對象收集2013年1月至2016年6月建德市第一人民醫(yī)院經(jīng)開顱手術(shù)治療的腦挫裂傷患者共100例（外傷組），男60例，女40例，年齡18～78（44.7±14.8）歲。選擇同期開顱手術(shù)治療的高血壓性基底節(jié)區(qū)腦出血患者100例作為對照組，男56例，女44例，年齡41～78（58.0±11.4）歲。外傷組腦標(biāo)本為開顱手術(shù)中腦挫裂傷組織，對照組腦標(biāo)本為手術(shù)徑路中正常腦組織。兩組患者均未合并其他部位嚴(yán)重外傷、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重感染及免疫性疾病。兩組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)建德市第一人民醫(yī)院倫理委員會同意，所有家屬均簽署知情同意書。

1.2 神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測粉碎腦組織后，用尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞團(tuán)塊，離心后棄去上清液，然后用700ml/L乙醇固定，由杭州柯帝生物技術(shù)有限公司采用流式細(xì)胞儀（美國BD公司FACSCB flow cytometer）檢測凋亡神經(jīng)細(xì)胞。應(yīng)用Cell Quest軟件獲取細(xì)胞10 000個，進(jìn)行凋亡細(xì)胞計數(shù)。以Mod Fit軟件進(jìn)行凋亡峰擬合及細(xì)胞周期分析并繪制DNA分布圖，G1期前的G1亞峰（Ap）即為凋亡峰，結(jié)果以凋亡百分?jǐn)?shù)表示。

1.3 蛋白表達(dá)的檢測制作腦組織勻漿，由杭州柯帝生物技術(shù)有限公司采用Western-blot檢測腦組織Omi/HtrA2、XIAP、剪切PARP、pro-caspase 3和pro-caspase 9等表達(dá)情況。采用二辛可寧酸法測定蛋白濃度，50μg蛋白經(jīng)電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉Tris 0.9%氯化鈉溶液和吐溫20緩沖液（TBST）室溫封閉1h；加入相應(yīng)單克隆抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入HRP標(biāo)記的IgG二抗室溫?fù)u床孵育1h，TBST洗膜3次；化學(xué)發(fā)光試劑作用5min，X光膠片曝光。沖洗并掃描后結(jié)果用Quality one軟件分析雜交條帶灰度值，以β-actin水平為內(nèi)對照，計算相對灰度值，即為蛋白表達(dá)水平。

1.4 蛋白活性的檢測取腦組織制作勻漿，由杭州柯帝生物技術(shù)有限公司采用四肽熒光底物法檢測caspase-3和caspase-9蛋白活性。取腦組織勻漿100μl和caspase-3底物AC-DEVD-AMC或caspase-9底物ACLEHD-AFC 10μl，加入HEPES緩沖液至1ml，37℃孵育1 h。使用熒光分光光度計在激發(fā)波長400nm，釋放波長505nm處測定熒光強(qiáng)度，以未加腦組織時的熒光強(qiáng)度為參照值，計算熒光強(qiáng)度，結(jié)果以相對熒光強(qiáng)度表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關(guān)分析揭示各變量間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者腦組織各指標(biāo)的比較外傷組腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例、Omi/HtrA2、pro-caspase 3、pro-caspase 9和剪切PARP表達(dá)及caspase 3和caspase 9活性較對照組均明顯升高（均P＜0.01），外傷組腦組織XIAP表達(dá)較對照組明顯下降（P＜0.01），見圖1、表1。

圖1 兩組腦組織Omi/HtrA2、XIAP、pro-caspase 3、pro-caspase 9和剪切PARP表達(dá)的比較

2.2 外傷組各指標(biāo)的相關(guān)性分析外傷組腦組織Omi/HtrA2表達(dá)與凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例、pro-caspase 3、procaspase 9和剪切PARP表達(dá)及caspase 3和caspase 9活性均呈正相關(guān)性（r=0.533、0.529、0.583、0.601、0.621、0.541，均P＜0.01），與XIAP表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.568，P＜0.01）；外傷組腦組織XIAP表達(dá)與凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例、pro-caspase 3、pro-caspase 9和剪切PARP表達(dá)及caspase 3和caspase 9活性均呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.610、-0.494、-0.583、-0.611、-0.594、-0.550，均P＜0.01）。

表1 兩組患者腦組織各指標(biāo)的比較

3 討論

神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致顱腦損傷后神經(jīng)功能障礙的重要原因之一，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡可以明顯改善顱腦損傷動物的神經(jīng)功能[15-17]。pro-caspase 3、pro-caspase 9、PARP、caspase 3和caspase 9等在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中具有重要作用，這些蛋白表達(dá)的升高促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18-20]。正如本研究所發(fā)現(xiàn)，凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例、procaspase 3、pro-caspase 9和剪切PARP表達(dá)及caspase 3和caspase 9活性在顱腦損傷患者挫傷腦組織中明顯升高。這些數(shù)據(jù)說明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡確實在人類顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷中扮有重要的角色。

線粒體途徑是神經(jīng)細(xì)胞凋亡重要的信號通路之一。Omi/HtrA2是一種由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的絲氨酸蛋白酶，由MTS/MLS引導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體，通過自身蛋白酶解或者被線粒體加工肽酶降解形成成熟的Omi分子[4-8]。當(dāng)細(xì)胞受到刺激發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而線粒體膜通透性增加時，Omi/HtrA2分子從線粒體釋放并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而發(fā)揮作用[9-11]。XIAP是內(nèi)源性caspases抑制物，可結(jié)合和抑制活化的caspase 9。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，Omi/HtrA2分子被釋放到細(xì)胞質(zhì)，降解XIAP，解除了XIAP對caspase 9的抑制，導(dǎo)致下游caspase 3活化，進(jìn)而DNA斷裂而發(fā)生細(xì)胞凋亡[6，11]。目前動物實驗已經(jīng)證實，腦損傷大鼠皮層Omi/HtrA2表達(dá)增高，而XIAP表達(dá)降低[12-14]。本研究留取顱腦損傷患者腦挫傷皮層進(jìn)而檢測Omi/HtrA2和XIAP表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，Omi/HtrA2表達(dá)與凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例、pro-caspase 3、pro-caspase 9和剪切PARP表達(dá)及caspase 3和caspase 9活性呈正相關(guān)，與XIAP表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)；XIAP表達(dá)與凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例、pro-caspase 3、pro-caspase 9和剪切PARP表達(dá)及caspase 3和caspase 9活性均呈負(fù)相關(guān)。這些說明，Omi/HtrA2介導(dǎo)的線粒體途徑可能參與了人類外傷性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

目前已有研究揭示，Omi/HtrA2的特異性抑制劑（UCF-101）可明顯減少膿毒癥或腦缺血大鼠的神經(jīng)細(xì)

胞凋亡，一定程度上改善神經(jīng)功能[12-14]。這些研究結(jié)果也從另外一個方面說明，特異性地抑制Omi/HtrA2表達(dá)可能抑制顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞，從而改善顱腦損傷患者，這也為顱腦損傷治療提供了新思路。

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Mitochondrial Omi/HtrA2 signaling pathway involved in neuronal apoptosis after cerebral contusion and laceration

TANG Bei,SHI Jian，ZHOU Ling，et al.

Department of Intensive Care Unit,Jiande First People's Hospital,Jiande 311600,China

ObjectiveTo investigate the effect of Omi/HtrA2 mediated mitochondrial signaling pathway in neuronal apoptosis after acute traumatic brain injury.MethodsBrain tissue samples were collected during craniotomy from 100 patients with cerebral contusion and laceration(trauma group),and normal brain tissue samples were collected from 100 patients with intracerebral hemorrhage(control group).Flow cytometry was applied to determine apoptotic neuronal cells,Western-blotting was performed to test expressions of Omi/HtrA2,X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP),pro-caspase-3,pro-caspase-9 and cleaved poly ADP-ribose polymerase(PARP),and four peptide fluorescence substrate method was employed to detect activities of caspase 3 and caspase 9 proteins.Results Percentage of apoptotic nerve cells,expressions of Omi/HtrA2,pro-caspase 3,pro-caspase 9 and cleaved PARP as well as activities of caspase 3 and caspase 9 proteins were significantly higher and the expression of XIAP was significantly lower in brain tissues of trauma group than those in control group(allP＜0.01).In trauma group,expression of Omi/HtrA2 was positively correlated with percentage of apoptotic nerve cells,expressions of pro-caspase 3,pro-caspase 9 and cleaved PARP as well as activities of caspase 3 and caspase 9 proteins,and negatively correlation with the expression of XIAP.The expression of XIAP was negatively correlated with percentage of apoptotic nerve cells,expressions of Omi/HtrA2,pro-caspase 3,pro-caspase 9 and cleaved PARP as well as activities of caspase 3 and caspase 9 proteins.Conclusion Omi/HtrA2 mediated mitochondrial signaling pathway may be involved in neuronal apoptosis after acute traumatic brain injury.

Human Traumatic brain injury Neuronal apoptosisOmi/HtraA2

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.20.2017-377

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃平臺項目（2014ZDA019）

311600建德市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（湯蓓、周玲、沈紅衛(wèi)、吳慧平、胡佳元），腦外科（鄭紹儉）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腦外科（石鍵）

周玲，E-mail：95225410@qq.com

2017-02-27）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）