亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        烏司他丁對壞死性小腸結(jié)腸炎新生大鼠小腸結(jié)腸的保護作用研究

        2017-11-16 10:38:41賴盼建徐潔李小兵包云光
        浙江醫(yī)學 2017年20期
        關鍵詞:烏司小腸熒光

        賴盼建 徐潔 李小兵 包云光

        ●論著

        烏司他丁對壞死性小腸結(jié)腸炎新生大鼠小腸結(jié)腸的保護作用研究

        賴盼建 徐潔 李小兵 包云光

        目的探討烏司他丁對壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)新生大鼠小腸結(jié)腸的保護作用。方法將60只3日齡SD大鼠隨機分為正常對照組、NEC模型組、烏司他丁治療組、烏司他丁對照組,每組15只。先采用綜合應激法建模,即3日齡SD大鼠離開母鼠后,采用腸內(nèi)配方奶喂養(yǎng)、缺氧(100%CO2灌飼養(yǎng)箱10min)-高氧(97%O2灌飼養(yǎng)箱5min)暴露和冷應激(4℃環(huán)境中5min)的方法,2次/d,連續(xù)3d,并加腹膜腔注射0.9%氯化鈉溶液。造模成功后取腸管組織切片,HE染色光鏡下觀察并作Shiou評分,免疫熒光法檢測自噬因子(Beclin-1)和自噬相關蛋白(LC3A/B)表達水平,Elisa法檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平。結(jié)果NEC模型組和正常對照組相比較炎癥反應明顯改善,Shiou評分有統(tǒng)計學差異;Beclin-1和LC3A/B熒光強度顯著增強;TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。烏司他丁治療組和NEC模型組相比較炎癥反應明顯改善,Shiou評分有統(tǒng)計學差異;Beclin-1和LC3A/B水平可見熒光強度表達顯著下降;TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯下降,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。結(jié)論烏司他丁對NEC新生大鼠小腸結(jié)腸有保護與治療作用。

        壞死性小腸結(jié)腸炎烏司他丁Shiou評分自噬與凋亡炎性因子

        新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)具有高發(fā)病率、病死率及致殘率的特點[1]。其發(fā)病機制尚未完全闡明,早產(chǎn)兒免疫功能及調(diào)節(jié)能力低下,缺血再灌注、氧自由基、感染等所誘導的異常炎癥反應是共同損傷通路,最終導致胃腸道黏膜屏障功能障礙。烏司他丁為蛋白酶抑制劑(Ulinary trypsininhibitor,UTI),具有抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用[2]。動物實驗證明烏司他丁能減少膿毒性休克動物的死亡[3],但目前關于是否能保護腸黏膜細胞的報道甚少。筆者采用人工喂養(yǎng)、缺氧和冷刺激建立新生大鼠NEC模型,研究烏司他丁對NEC所致的腸道炎癥、壞死和細胞凋亡的保護作用,為探討NEC的發(fā)生機制,尋求有效預防和治療NEC的新策略提供依據(jù)。

        (正文見第1735 頁)

        圖1 各組大鼠腸道組織HE染色光鏡觀察(a:正常對照組;b:NEC模型組;c:烏司他丁治療組;d:烏司他丁對照組;HE染色,×200)

        圖2 大鼠腸道組織Beclin-1熒光強度表達(a:正常對照組;b:NEC模型組;c:烏司他丁治療組;d:烏司他丁對照組;免疫熒光法,×400)

        圖3 大鼠腸道組織LC3II熒光強度表達(a:正常對照組;b:NEC模型組;c:烏司他丁治療組;d:烏司他丁對照組;免疫熒光法,×400)

        1 材料和方法

        1.1 材料和儀器健康清潔級SD大鼠60只,雌雄不限,3日齡,購自浙江省實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號:scxk(浙)20140001],飼養(yǎng)及實驗環(huán)境為浙江省金華市實驗動物中心[動物使用許可證號:syxk(浙)20140008]SPF動物房。主要試劑:二甲苯(成都市科龍化工試劑廠);伊紅(上海邁坤化工有限公司);蘇木精(美國Sigma公司);Beclin-1抗體、LC3抗體(英國Abcam公司);驢抗兔二抗(Life Technology,激發(fā)/吸收波長:488nm/525nm);TNF-α Elisa試劑盒(武漢華美生物,貨號:CSB-E11987r);IL-1β Elisa試劑盒(武漢華美生物,貨號:CSB-E08055r);IL-6 Elisa試劑盒(武漢華美生物,貨號:CSB-E04640r)。主要儀器:輪轉(zhuǎn)式切片機(RM2235型,德國LEICA公司);病理組織漂烘儀(tec 2500型,常州市郝思琳儀器設備有限公司);顯微鏡(BX43型,日本OLYMPUS公司);隔水式恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS500BS-Ⅱ型,上海躍進醫(yī)療器械有限公司);酶標儀(BIO-RAD Model680);洗板機(Mindray MW-12A);恒溫箱(DHG-9140A型,揚州鴻都電子);高速離心機(Thermo ST16R)。

        1.2 方法

        1.2.1 分組及建模將SD大鼠隨機分為4組,每組15只:(1)正常對照組:常規(guī)喂養(yǎng),不給予任何干預與刺激;(2)NEC模型組:離開母鼠后,采用腸內(nèi)配方奶喂養(yǎng)、缺氧-高氧暴露和冷應激的方法,即新生大鼠在100%CO2中10min,4℃環(huán)境中5min,97%O2中5min,2次/d,連續(xù)3d,并在腹膜腔中注射0.9%氯化鈉注射液0.1ml;(3)烏司他丁治療組:在NEC模型成功基礎上,烏司他丁腹膜腔注射1次/d,劑量10 000U/(kg·d),連續(xù)3d;(4)烏司他丁對照組:新生大鼠離開母鼠后常規(guī)喂養(yǎng),烏司他丁腹膜腔注射1次/d,劑量10000 U/(kg·d),連續(xù)3d。第7天,處死4組所有大鼠,取胃腸道組織(十二指腸末端至回盲部腸管)。

        1.2.2 大鼠腸道組織HE染色病理學檢測取腸道頭端組織0.5cm,于4%甲醛溶液中固定3~5d,經(jīng)80%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅲ進行脫水處理,二甲苯2次各30min透明,浸蠟包埋,待蠟塊冷卻凝固后置于-20℃冷藏,行環(huán)狀切片(厚4μm);常規(guī)HE染色,細胞核呈藍色,細胞質(zhì)呈粉紅色,紅細胞呈較鮮艷的紅色。腸道病理組織采用Shiou等[4]新的標準雙盲法評分,即0分:腸黏膜絨毛完整,組織結(jié)構(gòu)正常;1分:輕微黏膜下和(或)固有層腫脹分離;2分:中度黏膜下和(或)固有層分離,黏膜下和(或)肌層水腫;3分:重度黏膜下和(或)固有層分離,黏膜下和(或)肌層水腫,局部絨毛脫落;4分:腸絨毛消失伴腸壞死。病理評分≥2分者視為NEC。

        1.2.3 免疫熒光法檢測自噬與凋亡腸道組織常規(guī)切片;免疫熒光檢測大鼠小腸組織Beclin-1和LC3A/B的表達:(1)二甲苯脫蠟,梯度乙醇復水;(2)抗原修復;(3)滴加一抗(Beclin-1抗體、LC3抗體),4℃孵育過夜,PBS水洗3×3min,并設PBS作為陰性對照;(4)滴加二抗(驢抗兔二抗),37℃孵育60min,PBS沖洗3×5min;(5)DAPI染核,室溫10min;(6)甘油PBS封片,熒光顯微鏡觀察。結(jié)果分析:綠色熒光所示為Beclin-1和LC3A/B,藍色為細胞核。

        1.2.4 Elisa法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平使用前將所有試劑和樣本平衡至室溫;根據(jù)試劑盒說明配制標準品;每孔依次加入100μl標準品和樣本,復孔,錫紙密封,37°孵育2h,吸棄孔內(nèi)液體,在干凈的紙上拍干;每孔依次加入100μl抗體,錫紙密封,37°孵育1h;使用洗板機洗滌,每孔洗滌液200μl,洗滌時間2min,總共洗滌3次;每孔依次加入100μl辣根過氧化物酶(HRP),錫紙密封,37°孵育1h;再次使用洗板機洗滌,每孔洗滌液200μl,洗滌時間2min,總共洗滌5次;每孔依次加入90μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB);錫紙密封,37°避光孵育30min;加終止液50μl,顯色;5min內(nèi)使用酶標儀在450nm讀數(shù),校正波長540nm或570nm。計算結(jié)果:標準品和樣本的OD值減去零標準的OD值,取2個復孔的均值;建立標準曲線和公式,根據(jù)所測OD值計算出各樣本的濃度。

        1.3 統(tǒng)計學處理應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件,計量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠腸道組織HE染色病理學檢測各組大鼠腸道組織HE染色在光鏡下可見:正常對照組:腸黏膜上皮完整、連續(xù),細胞與腺體排列規(guī)則,黏膜及黏膜下層無炎癥細胞浸潤;NEC模型組:腸絨毛水腫,黏膜固有層及黏膜下層大量炎癥細胞浸潤(以中性粒細胞和嗜酸性粒細胞為主),腸腔毛細血管充血,甚至可見腸上皮壞死。烏司他丁治療組:腸黏膜上皮完整、連續(xù),細胞與腺體排列規(guī)則,部分可見腸絨毛水腫和腸腔毛細血管充血,部分可見固有層少量炎細胞浸潤;烏司他丁對照組:未見明顯炎癥性病變,見圖1(見插頁)。烏司他丁治療組和正常對照組及烏司他丁對照組相比較無統(tǒng)計學差異,見表1。

        表1 腸道病理組織Shiou評分比較(分)

        2.2 免疫熒光法定性檢測LC3II和Beclin 1的熒光強度相同曝光時間下,可見NEC模型組Beclin-1和LC3A/B熒光強度表達較其他3組強,烏司他丁治療組和正常對照組及烏司他丁對照組相比熒光強度未見差異。見圖2、3(見插頁)。

        2.3 各組大鼠腸道組織炎性因子水平的比較給予烏司他丁治療的兩組炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著低于NEC模型組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。詳見表2。

        表2 各組大鼠腸道組織炎性因子水平的比較

        3 討論

        目前NEC的發(fā)病機制仍不清楚,其治療仍以對癥處理為主,療效不確切,急需尋求有效的防控措施。本研究采用人工喂養(yǎng)、缺氧和冷刺激建立新生大鼠NEC模型,探討NEC的發(fā)病可能機制,并尋求烏司他丁的干預效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),烏司他丁治療可明顯改善炎癥反應,炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯下降,Beclin-1和LC3A/B水平顯著下降;提示烏司他丁對NEC新生大鼠有保護與治療作用。

        NEC腸道損傷機制復雜,炎癥反應在其中發(fā)揮了重要作用。其中TNF-α、IL-1β及IL-6是重要的炎癥細胞因子,在全身性炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起著主導作用,不僅可以引起其他細胞因子的釋放,而且可以促進中性粒細胞和內(nèi)皮細胞之間的黏附以及中性粒細胞的移行,釋放的炎癥介質(zhì)增加,進一步加重組織臟器的損傷。本實驗發(fā)現(xiàn),與NEC組相比,烏司他丁干預組腸道組織炎癥反應較輕,炎細胞浸潤減少,炎性因子TNF-、IL-1β、IL-6水平亦顯著下降,提示烏司他丁可通過抑制TNF-α等細胞因子和氧自由基產(chǎn)生,穩(wěn)定溶酶體和細胞膜及調(diào)控細胞因子和炎癥介質(zhì)等而發(fā)生抑制炎癥反應和保護腸黏膜屏障的作用[4-5]。臨床Meta分析顯示,烏司他丁抑制與心臟手術相關的TNF-α、IL-8、IL-等水平增加,支持本研究結(jié)果[6]。同樣,動物實驗研究也證明,烏司他丁能顯著改善缺血再灌注及肺挫傷誘發(fā)的急性肺損傷中的炎癥和氧應激[4-5]。但鮮見有關烏司他丁對NEC腸黏膜保護的相關研究,僅在燒傷或膿毒血癥研究中發(fā)現(xiàn)烏司他丁對小腸免疫屏障沒有直接的保護作用,但能有效降低血漿炎癥因子水平,可能改善炎癥抑制治療的效果[6-7]。本實驗結(jié)果提示,烏司他丁對NEC大鼠的炎癥抑制是有價值的,具有潛在治療效應及應用前景,需要更多研究以提供烏司他丁的作用機制及效果的證據(jù)。

        細胞凋亡可能是最初腸黏膜細胞的主要死亡方式,已明確腸黏膜通透性增加是早產(chǎn)兒NEC發(fā)病的早期事件,且發(fā)現(xiàn)其過程存在細胞凋亡及自噬現(xiàn)象[8]。我們進一步研究也發(fā)現(xiàn),NEC模型組Beclin-1和LC3Ⅱ熒光強度表達較正常對照組及烏司他丁組強。提示烏司他丁可降低自噬與凋亡水平,從而表現(xiàn)出其腸道保護作用。細胞自噬與凋亡作為相互聯(lián)系的細胞過程,目前認為具有相同的誘導、調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導過程。在NEC臨床病例與實驗大鼠模型的回腸上皮細胞均有自噬的激活。自噬體由ATG12-Atg5的-Atg16復合體和微管相關蛋白輕鏈3(LC3Ⅰ)-磷脂綴合物(LC3Ⅱ)介導形成[9],因而LC3II被認為是自噬的標志。而Beclin-1為Ⅲ型PI3-激酶復合物的成分,參與自噬泡的成核過程,是另一種自噬標記物[10]。另一方面,細胞凋亡可能是最初腸黏膜細胞的主要死亡方式,這種細胞凋亡作用可能是通過TNF-α等因子誘導線粒體功能障礙和激活線粒體凋亡級聯(lián)反應來實現(xiàn)的。在實驗性NEC模型中證實,細胞自噬和凋亡均被活化,且細胞自噬先于細胞凋亡發(fā)生,繼而細胞凋亡后發(fā)生腸道組織的壞死,體外研究表明補充細胞生成素可顯著降低自噬和凋亡紅[8]。當然,烏司他丁的保護腸上皮細胞作用是否通過免受過度自噬和細胞凋亡而實現(xiàn)尚待進一步的研究。

        總之,烏司他丁可通過降低TNF-α、IL1-β、IL-6等炎癥介質(zhì)的表達來抑制腸道的炎癥級聯(lián)反應,并能抑制腸黏膜上皮細胞的自噬與凋亡,對NEC新生大鼠腸損傷起保護作用。

        [1] Kong X,Xu F,Wu R,et al.Neonatal mortality and morbidity among infants between 24 to 31 complete weeks:a multicenter survey in China from 2013 to 2014[J].BMC Pediatr,2016,16(1):174.

        [2] Cao YZ,Tu Y Y,Chen X,et al.Protective effect of Ulinastatin against murine models of sepsis:inhibition of TNF-α and IL-6 and augmentation of IL-10 and IL-13[J].Exp Toxicol Patho,2012,64(6):543-547.

        [3] Wang N,Liu X,Zheng X,et al.Ulinastatin is a novel candidate drug for sepsis and secondary acute lung injury,evidence from an optimized CLP rat model[J].Int Immunopharmacol,2013,17(3):799-807.

        [4] Wang S,Wang J,Chen X,et al.Does urinary trypsin inhibitor have a role in acute lung injury induced by pulmonary contusion:a basic research in a modelofrats[J].Am J Ther,2014,21(6):447-452.

        [5] Yu L,Luo Q,Fang H.Mechanism of ulinastatin protection against lung injury caused by lower limb ischemia-reperfusion[J].Panminerva Med,2014,56(1):49-55.

        [6] He Q L,Zhong F,Ye F,et al.Does intraoperative ulinastatin improve postoperative clinical outcomes in patients undergoing cardiac surgery:a meta-analysis of randomized controlled trials[J].Biomed Res Int,2014,2014:630835.

        [7] Jiang L,Yang L,Zhang M,et al.Beneficial effects of ulinastatin on gut barrier function in sepsis[J].Indian J Med Res,2013,138(6):904-11.

        [8] Yu Y,Shiou S R,Guo Y,et al.Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatalnecrotizing enterocolitis[J].PLoS One,2013,8(7):e69620.

        [9] Maynard AA,Dvorak K,Khailova L,et al.Epidermalgrowth factor reduces autophagy in intestinal epithelium and in the rat model of necrotizing enterocolitis[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2010,299(3):G614-622.

        [10] Walczak M,Martens S.Dissecting the role of the Atg12-Atg5-Atg16 complex during autophagosome formation[J].Autophagy,2013,9(3):424-425.

        [11] Myung Park J,Huang S,Wu T T,et al.Prognostic impact of Beclin 1,p62/sequestosome 1 and LC3 protein expression in colon carcinomas from patients receiving 5-fluorouracil as adjuvant chemotherapy[J].Cancer BiolTher,2013,14(2):100-107.

        Protective effects of ulinastatin on necrotic enterocolitis in neonatal rats

        LAI Panjian,XU Jie,LI Xiaobing,et al.

        Department of Pediatrics,Jinhua Central Hospital,Jinhua 321000,China

        Objective To investigate the effects of ulinastatin on necrotic enterocolitis(NEC)in neonatal rats.Methods Sixty Sprague-Dawley rats aged of 3 days were randomly divided into four groups with 15 in each group:control,NEC model,NEC+Ulinastatin,and Ulinastatin.When experiments completed the intestinal samples were harvested and stained with hematoxylin and eosin(HE),the samples were observed under light microscope and scored according to the method of Shiou et al.Immun of luorescence was used to detect beclin-1 and LC3A/B to evaluate the autophagy and apoptosis.The inflammatory factors TNF-α,IL-1β,and IL-6 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsHE staining revealed that the inflammatory response in NEC+Ulinastatin group was significantly attenuated compared with that in the NEC model group.The pathological examination showed a significant difference in Shiou scores among 4 groups.The expression of beclin-1 and LC3A/B levels in intestinal tissue of NEC+Ulinastatin group were significantly decreased;and the levels of inflammatory factors TNF-α,IL-1β,and IL-6 were also significantly decreased(P<0.05).Conclusion Ulinastatin exerted protective and therapeutic effects on NEC in neonatal rats.

        Necrotizing enterocolitis Ulinastatin Shiou score Autophagy and apoptosis In flammatory factors

        10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.20.2017-770

        浙江省科技計劃實驗動物項目(2014C37024);金華市科技計劃項目(2015-3-010)

        321000金華市中心醫(yī)院小兒科(賴盼建、徐潔、李小兵、包云光)

        李小兵,E-mail:327283825@qq.com

        2017-04-07)

        (本文編輯:嚴瑋雯)

        猜你喜歡
        烏司小腸熒光
        灌肉
        用好小腸經(jīng),可整腸除濕熱
        干式熒光發(fā)光法在HBV感染診療中應用價值
        烏司他丁對中暑急性肺損傷HIF-1α、MIF表達水平的影響
        一根小腸一頭豬
        故事會(2019年10期)2019-05-27 06:06:58
        高熒光量子產(chǎn)率BODIPY衍生物的熒光性能研究
        烏司他丁聯(lián)合胸腺肽α1治療AECOPD合并SIRS的療效研究
        烏司他丁治療老年缺血性結(jié)腸炎的效果觀察
        成人先天性小腸旋轉(zhuǎn)不良長期誤診1例
        國產(chǎn)奧曲肽聯(lián)合烏司他丁治療急性胰腺炎的臨床效果觀察
        一二三四在线视频社区3| 日韩麻豆视频在线观看| 最近免费中文字幕中文高清6 | 久久蜜桃一区二区三区| 国产精品无套一区二区久久| 欧美精品videosex极品| 国产精品对白交换视频| japanese色国产在线看视频| 国产在线一区二区三区香蕉| 国产中文三级全黄| 中文字幕一区二区三区精华液| 久久精品性无码一区二区爱爱| 中文字幕亚洲精品综合| 永久免费毛片在线播放| 亚洲自偷自拍熟女另类| 国产精品高潮av有码久久| 网址视频在线成人亚洲| 国产日韩精品suv| 牛鞭伸入女人下身的真视频| 天天射色综合| 日本人妻97中文字幕| av狠狠色丁香婷婷综合久久| 国产精品亚洲五月天高清| 人妻少妇喷水意淫诱惑| 精品女同一区二区三区免费战| 中字幕人妻一区二区三区| 亚洲一级黄色毛片| 色噜噜精品一区二区三区| 亚洲国产精品亚洲一区二区三区 | 亚洲国产精品免费一区| 看女人毛茸茸下面视频| 久久久久人妻精品一区蜜桃| 欧美午夜精品久久久久久浪潮 | 亚洲精品美女久久777777| 大学生被内谢粉嫩无套| 亚洲一区二区三区在线中文| 99国产精品久久一区二区三区| 亚洲中文久久精品无码| 日韩成人无码v清免费| 国产一区三区二区视频在线观看| 蜜桃日本免费观看mv|