(瀘州市江陽區(qū)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，四川瀘州，646000)

分析與測試

柱前衍生化法結(jié)合HPLC測定2-哌啶乙醇對映體光學(xué)純度

張君筠
(瀘州市江陽區(qū)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，四川瀘州，646000)

用3，5-二硝基苯甲酸對2-哌啶乙醇進(jìn)行柱前衍生，將其衍生物在Chiralcel OD-H手性固定相上拆分，建立了一種拆分2-哌啶乙醇消旋體、測定2-哌啶乙醇光學(xué)純度的新方法。以正己烷與乙醇或異丙醇為流動(dòng)相，在Chiralcel OD-H手性固定相上對2-哌啶乙醇衍生物進(jìn)行了拆分，并考察了流動(dòng)相組成、柱溫和流速對該對映體分離的影響，獲得較優(yōu)分析條件，分析時(shí)間在15分鐘內(nèi)，分離度大于1.7。結(jié)果表明，2-哌啶乙醇衍生物對映體在正己烷-乙醇(體積比85:15)為流動(dòng)相、流速為1.0 mL min-1、柱溫為 30℃時(shí)，分離效果最佳。本方法操作簡單、重現(xiàn)性好，可用于2-哌啶乙醇對映體的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法 2-哌啶乙醇 柱前衍生化 對映體拆分

2-哌啶乙醇分子中含有氨基和羥基等活性官能團(tuán)，因此在分子多樣化構(gòu)建方面具有巨大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。Scalacci等人以2-哌啶乙醇為原料合成出了一系列具有對抗耐藥結(jié)核活性的新型硫利達(dá)嗪衍生物[1]；Kwon等人用2-哌啶乙醇合成了一系列具有抗腫瘤活性的磺胺類藥化合物[2]；Chausset-Boissarie等人應(yīng)用不對稱合成反應(yīng)合成出了(+)-vertine和(+)-lythrine[3]。此外，2-哌啶乙醇其哌啶環(huán)上有一個(gè)不對稱碳原子因而具有兩種對映體構(gòu)型。2-哌啶乙醇單一對映體在藥物合成中有著廣泛應(yīng)用，如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶SCH727965的合成就是采用(S)-2-哌啶乙醇作為原料[4]；Zanka等人使用(R)-2-哌啶乙醇作為原料合成了一系列新型的非嘌呤腺苷A1受體拮抗劑[5]。隨著2-哌啶乙醇單一對映體需求量的增加，在2-哌啶乙醇不對稱反應(yīng)研究及藥物生產(chǎn)的質(zhì)量監(jiān)控中，對其進(jìn)行有效的手性拆分和準(zhǔn)確光學(xué)純度測定具有非常重要的意義。目前國內(nèi)外對2-哌啶乙醇的高效液相色譜拆分還未見報(bào)道。因此，探索其對映體純度分析檢測方法具有重要意義。手性固定相 HPLC法具有專屬性強(qiáng)、分離效率高、測定靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，可以準(zhǔn)確測定手性對映體光學(xué)純度[6,7]。前期研究表明2-哌啶乙醇在傳統(tǒng)手性固定相無法直接拆分，且其紫外吸收較弱，因此本文將2-哌啶乙醇對映體進(jìn)行非手性試劑衍生化處理。本研究采用Chiralcel OD-H手性色譜柱，建立了2-哌啶乙醇對映體純度的檢測方法，該方法快速、重復(fù)性好，適用于生產(chǎn)上的質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT型高效液相色譜儀、SPD-M20A檢測器(日本島津公司)；ClassVP色譜工作站、HCT-360型柱溫箱(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；KQ5200型超聲脫氣機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。正己烷、異丙醇、乙醇(色譜純)購買于美國Fisher試劑公司；(±)-2-哌啶乙醇、(R)-2-哌啶乙醇購買于薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；3,5-二硝基苯甲酸、N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)均購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Chiralcel OD-H、Chiralpak AD-H、Chiralcel OJ-H(250mm×4.6mm，Daicel Chemical Industries，LTD公司)；流動(dòng)相使用前用0.45μm濾膜過濾并超聲脫氣30min；流速均為1.0 mL min-1；檢測波長254nm；柱溫20～40℃。測定樣品用流動(dòng)相溶解；進(jìn)樣量為10μL；死時(shí)間以乙醇測定。

1.3 樣品衍生化處理

用3,5-二硝基苯甲酸將2-哌啶乙醇衍生化：稱取0.13mL(1mmol)2-哌啶乙醇于10mL二氯甲烷中，稱取0.247g(1.2mmol)DCC溶于上述二氯甲烷中，此混合物在室溫下攪拌反應(yīng)5分鐘。最后加入0.212g(1mmol)3,5-二硝基苯甲酸進(jìn)行反應(yīng)，溫度30℃，反應(yīng)式見圖1。將反應(yīng)得到的粗品，依次用1mol/L的鹽酸、1mol/L的氫氧化鈉，水洗滌后用無水硫酸鈉干燥，過濾，再濃縮得產(chǎn)品。

圖1 2-哌啶乙醇的衍生化反應(yīng)

2 結(jié)果與討論

2.1 手性固定相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了三種手性色譜柱對2-哌啶乙醇衍生物對映體分離效果，在流動(dòng)相組分比例為正己烷：異丙醇=80：20(V/V)的條件下，采用Chiralcel OD-H、Chiralpak AD-H、Chiralcel OJ-H對2-哌啶乙醇衍生物進(jìn)行拆分，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有Chiralcel OD-H色譜柱可以實(shí)現(xiàn)2-哌啶乙醇衍生物對映體的分離。故本實(shí)驗(yàn)采用Chiralcel OD-H對2-哌啶乙醇衍生物對映體拆分，并進(jìn)一步考察流動(dòng)相組分、溫度、流速對分離效果的影響，優(yōu)選出最佳分離條件。

2.2 流動(dòng)相組成對分離的影響

以正己烷作為流動(dòng)相分別加入異丙醇和乙醇調(diào)節(jié)極性強(qiáng)度，以獲得最佳峰間距和分離效果。使用Chiralcel OD-H測定不同流動(dòng)相極性下2-哌啶乙醇衍生物的拆分情況，其中流速為1.0mL min-1，柱溫為30℃的結(jié)果列于表1。流動(dòng)相極性的微小變化，對于對映體保留時(shí)間有較大的影響。實(shí)驗(yàn)表明，乙醇做流動(dòng)相極性調(diào)節(jié)劑時(shí)，分離效果比異丙醇做流動(dòng)相極性調(diào)節(jié)劑要好。從表1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)正己烷：乙醇=85：15(V/V)時(shí)，兩個(gè)峰既實(shí)現(xiàn)了基線分離、出峰時(shí)間較短、總的分析時(shí)間小于15分鐘，分離度也較高，這是最適合分析使用的條件。在流動(dòng)相為正己烷：乙醇=85：15(V/V)，流速為1.0mL min-1，柱溫為30℃的HPLC條件下，Chiralcel OD-H對2-哌啶乙醇衍生物對映體的分離情況見圖2。從圖2可以看出，兩個(gè)對映體峰分別檢測出，且R構(gòu)型衍生物被優(yōu)先洗脫下來。

表1 流動(dòng)相組成對分離效果的影響

Hex代表正己烷；IPA代表異丙醇；EtOH代表乙醇。t1為第一個(gè)峰的保留時(shí)間；t2為第二個(gè)峰的保留時(shí)間；k1為第一個(gè)峰的保留因子；k2為第二個(gè)峰的保留因子。

2.3 柱溫對分離度的影響

流動(dòng)相為正己烷：乙醇=85：15(V/V)，流速為1.0mL min-1下，考察了不同柱溫對保留時(shí)間、分離因子、分離度的影響，結(jié)果顯示：隨著柱溫升高，保留時(shí)間縮短，分離因子無顯著變化，而分離度有所降低。但考慮到低溫時(shí)保留時(shí)間較長，延長了分析時(shí)間。因此，選擇溫度為30℃，是適合于分析所使用的條件。

圖2 2-哌啶乙醇衍生物色譜圖

2.4 流速對分離的影響

流動(dòng)相為正己烷：乙醇=85：15(V/V)，柱溫為30℃條件下，考察了不同流速對保留時(shí)間、分離因子以及分離度的影響。結(jié)果表明：當(dāng)流速從0.6mL min-1升至1.2mL min-1時(shí)，該對映體的分離度、保留時(shí)間相應(yīng)減小，但分離因子幾乎不變。結(jié)果表明改變流速不能顯著提高手性選擇性，但是降低流速導(dǎo)致了分離度的增加，這是因?yàn)樵搶τ丑w的分配系數(shù)比較接近，較小的流速促使對映體在固定相和流動(dòng)相之間的分配作用次數(shù)增多，使得該對映體分離效果更好。從分離度數(shù)值來看，在所選的各流速下均達(dá)到了較好分離，過大的流速會(huì)導(dǎo)致柱壓過高，致使色譜柱的使用壽命縮短。過小的流速會(huì)使峰展寬增大，分析時(shí)間過長。因此我們選擇1.0mL min-1為最佳流速。

2.5 線性關(guān)系、檢出限和精密度

2-哌啶乙醇衍生物濃度在40～500 μg/mL的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y1=142156x1+1471和y2=134756x2+1247 (y1為R-構(gòu)型衍生物峰面積，x1為R-構(gòu)型衍生物濃度；y2為S-構(gòu)型衍生物峰面積，x2為S-構(gòu)型衍生物濃度)，回歸系數(shù)分別為0.9996和0.9994。逐漸稀釋至色譜峰信噪比接近3時(shí)，得到2-哌啶乙醇衍生物的檢測限分別為147μg/mL(R-構(gòu)型衍生物)和134μg/mL(S-構(gòu)型衍生物)。連續(xù)9次進(jìn)行平行測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.28%以內(nèi)，說明精密度很好。

2.6 樣品穩(wěn)定性

樣品溶解在正己烷：乙醇=85：15(V/V)的流動(dòng)相中，在室溫下保存。分別于0、2、4、6、8、24h取樣檢測并記錄色譜圖，圖中未發(fā)現(xiàn)有其他雜質(zhì)峰，作為目標(biāo)組分的對映體的保留時(shí)間、分離度基本保持不變，峰面積的RSD分別為0.35%和0.71%。24h內(nèi)該溶液一直保持澄清透明，且無沉淀等析出。說明該樣品在室溫條件下及選定的色譜條件下穩(wěn)定性好。

3 結(jié)論

本文使用柱前衍生結(jié)合手性固定相法實(shí)現(xiàn)了2-哌啶乙醇對映體的分離，并考察了流動(dòng)相組成、柱溫、流速等因素對拆分效果的影響，得到了以下最優(yōu)分離條件：正己烷：乙醇=85：15(V/V)為流動(dòng)相，在流速為1.0mL min-1, 柱溫30℃，檢測波長為254nm的條件下，2-哌啶乙醇衍生物對映體的分離度達(dá)1.71。本文建立的分析方法簡便快速、重復(fù)性好，可為手性2-哌啶乙醇的合成及質(zhì)量控制提供準(zhǔn)確可靠的檢測方法。

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DeterminationofEnantiomericPurityfor2-PiperidineethanolbyHPLCCombiningwithPre-ColumnDerivation

ZhangJunjun
(EnvironmentalProtectionMonitoringStationOfJiangyangDistrictLuzhou,Luzhou646000,Sichuan,China)

The 2-piperidineethanol was derivatized with 3,5-dinitrobenzoic acid that was the reagent of pre-colume derivatization of high performance liquid chromatography, and the derivative was separated by Chiralcel OD-H chiral stationary phase. A method for separating the racemate and determining the enantiomeric purity of 2-piperidineethanol was established. Chromatographic model was employed for enantiomeric separation of 2-piperidineethanol derivatives on the Chiralcel OD-H chiral colume in hexane/alcohol (ethanol or isopropyl alcohol) mobile phase. The effects of chromatography conditions, such as mobile phase, temperature and flow rate to chiral recognition, had been investigated. A better condition of analysis was obtained within a short run time of less 15 min. The resolution were more than 1.7. The results indicated that a good separation was obtained at 30℃ by using hexane-ethanol (85:15, V/V) as the mobile phase with a flow rate of 1.0 mL min-1. The presented study provided a simple and reproducible method for the enantiomeric quality control of 2-piperidineethanol.

high performance liquid chromatography; 2-piperidineethanol; pre-colume derivatization; enantioseparation