楊幸文，路青山，楊霄鵬，陳夢茹，豐雪

(1鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450000；2鄭州市第一人民醫(yī)院)

不同劑量人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療MS效果觀察

楊幸文1，路青山2，楊霄鵬1，陳夢茹1，豐雪1

(1鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450000；2鄭州市第一人民醫(yī)院)

目的對比觀察不同劑量人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSC)移植治療多發(fā)性硬化(MS)的臨床效果。方法將60例MS患者隨機(jī)均分為A、B、C、D組。從足月健康新生兒臍帶中提取hUC-MSC；各組均采用BEAM方案(卡莫司汀、替尼泊苷、阿糖胞苷、美法侖)進(jìn)行預(yù)處理。A、B、C組采用腰椎穿刺術(shù)經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔分別注射hUC-MSC 1.5×106/kg、7.5×106/kg、15×106/kg，D組給予相同體積生理鹽水。每2周移植1次，共移植3次。治療前后采用擴(kuò)展致殘狀況評分量表(EDSS)對患者神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評分，采用MR檢查頭顱、脊髓病灶數(shù)量及病灶體積變化，統(tǒng)計(jì)患者治療期間發(fā)生的不良反應(yīng)。結(jié)果與治療前比較，治療后A、B、C組EDSS較D組低(P均<0.05)，且C組

多發(fā)性硬化；人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞；干細(xì)胞移植

多發(fā)性硬化(MS)是一種自身免疫性疾病，其主要病理特點(diǎn)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘病變，致殘率較高。大多數(shù)MS患者表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)功能障礙。目前MS的治療效果仍不樂觀。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSC)是一種具有自我更新、多向分化潛能的成體干細(xì)胞。研究表明，hUC-MSC移植能有效緩解MS的癥狀[1～3]。同時(shí)，由于hUC-MSC具有來源豐富、取材簡單、培養(yǎng)條件方便、能夠通過血-腦脊液屏障、避免出現(xiàn)倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，引起了臨床的關(guān)注。但hUC-MSC最佳移植劑量仍未見報(bào)道。目前認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)發(fā)揮有效免疫調(diào)節(jié)作用的輸注劑量為(1.0～2.0)×106/kg[4]。本研究對不同劑量hUC-MSC移植治療MS的效果進(jìn)行對比。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年6月～2017年3月于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院及鄭州市第一人民醫(yī)院就診的MS患者60例，均符合MS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。其中，男27例、女33例，年齡18～60歲、中位年齡36歲，病程12～130個(gè)月、中位病程37個(gè)月。納入標(biāo)準(zhǔn)：近2年行常規(guī)抗炎治療無效，病情最嚴(yán)重時(shí)EDSS 3.0～7.0分；無感染病灶；入院肺、肝、脾、心、腎功能檢查無明顯異常；女性患者均為非妊娠期?；颊呔炇鹬橥鈺?，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。將患者隨機(jī)均分為A、B、C、D組。四組臨床資料具有可比性。

1.2 hUC-MSC提取方法 在無菌條件下，取足月正常分娩、排除傳染性疾病及家族遺傳性疾病的新生兒臍帶。剝離臍帶動脈和靜脈后，將剩余的臍帶組織用去血清的F12培養(yǎng)基清洗殘留血液，用無菌剪刀剪成肉糜樣大小的組織塊。用PBS充分沖洗至組織塊發(fā)白后放入50 mL離心管中，離心去除組織塊表面的黏液，將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，加入雙抗的F12培養(yǎng)基和10%胎牛血清后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間重復(fù)上述清洗過程3遍以上，直至完全清除臍帶組織表面的黏液。待細(xì)胞從組織塊周圍游出進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第5代。用生理鹽水洗滌細(xì)胞3次，調(diào)至1.0×106/μL備用。

1.3 hUC-MSC移植方法 各組采用BEAM方案(卡莫司汀300 mg/m2、1 d，替尼泊苷150 mg/m2、1～4 d，阿糖胞苷200 mg/m2、1～4 d，美法侖140 mg/m2、1 d)進(jìn)行預(yù)處理。用腰椎穿刺術(shù)行蛛網(wǎng)膜下腔注射，穿刺成功后緩慢注入hUC-MSC懸液。A、B、C組每次注射劑量分別為1.5×106/kg、7.5×106/kg、15×106/kg[4]，D組每次給予相同體積的生理鹽水。術(shù)后去枕平臥6 h。每2周移植1次，共移植3次[1]。移植治療期間各組給予常規(guī)抗炎治療。

1.4 指標(biāo)觀察方法 ①治療前后采用擴(kuò)展致殘狀況評分量表(EDSS)[6]對患者各個(gè)系統(tǒng)(感覺、直腸和膀胱、小腦、腦干、大腦神經(jīng)功能及總體功能等)神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評價(jià)[7]，得分越高說明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。②治療前后采用MR檢查頭顱、脊髓病灶數(shù)量及病灶體積變化。③統(tǒng)計(jì)患者治療期間發(fā)生的不良反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 各組治療前后EDSS比較 治療前各組EDSS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后D組EDSS較治療前無明顯變化(P>0.05)，A、B、C組EDSS較D組低(P均<0.05)，且C組

表1 各組治療前后EDSS比較(分

2.2 各組頭顱和脊髓病灶數(shù)目、體積比較 治療前各組病灶數(shù)目及體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；治療后D組病灶數(shù)目及體積均較治療前增多，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；治療后A、B、C組病灶數(shù)目及體積均較D組小(P均<0.05)，且C組

表2 各組治療前后MR檢查結(jié)果比較

2.3 不良反應(yīng) 治療過程中B、D組各出現(xiàn)1例低等發(fā)熱，經(jīng)對癥處理后均于3 d內(nèi)恢復(fù)正常。

3 討論

MS主要特征是大腦與脊髓內(nèi)播散的脫髓鞘病變，并伴有軸索的損害。目前，公認(rèn)MS發(fā)病的重要因素是遺傳因素、自身免疫及感染等。其中，在免疫因素中T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞通過釋放多種細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)。細(xì)胞因子既可以參與髓鞘的損壞又可以參與調(diào)節(jié)異常的自身免疫反應(yīng)，從而在MS的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。近年來，多項(xiàng)研究證明，MSC移植促進(jìn)髓鞘再生，能有效治療MS[8～14]。其可能的作用機(jī)制：MSC的免疫調(diào)控功能可抑制與IL-15及IL-2相關(guān)的NK細(xì)胞增殖，從而抑制炎性因子前列腺素E2、TNF-γ等的分泌[15]；調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的增殖、趨化及抗體分泌；抑制DC的分化，削弱其對B淋巴細(xì)胞的刺激及DC的抗原遞呈作用；抑制T細(xì)胞增殖，但并不引起T淋巴細(xì)胞凋亡和耐受；同時(shí)在活化的T淋巴細(xì)胞或炎性因子TNF-γ存在下可增加吲哚胺-2,3雙加氧酶的催化反應(yīng)能力，進(jìn)而減弱T細(xì)胞的分裂增殖能力。另外研究表明，MSC還可通過分泌具有調(diào)節(jié)免疫及營養(yǎng)神經(jīng)的因子減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到促進(jìn)內(nèi)源性髓鞘再生及保護(hù)神經(jīng)的作用[16～18]。

hUC-MSC與其他MSC相比，免疫細(xì)胞幼稚、不易觸發(fā)免疫反應(yīng)及引起移植物的抗宿主病，易采集、易保存和運(yùn)輸，且采集時(shí)不會對產(chǎn)婦及新生兒產(chǎn)生危害及損傷，倫理學(xué)爭議少。目前hUC-MSC治療MS的小樣本臨床試驗(yàn)已陸續(xù)開展，并初步證實(shí)該方案可行、安全、有效。目前關(guān)于不同數(shù)量hUC-MSC移植治療MS的臨床試驗(yàn)還很少。本研究對比使用不同劑量hUC-MSC移植治療MS的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后A、B、C三組EDSS均較治療前、對照組降低，且hUC-MSC移植治療劑量越高DESS評分降低越顯著；治療后A、B、C三組病灶數(shù)量及病灶體積均較治療前、對照組減少，且hUC-MSC移植治療劑量越高病灶數(shù)量及病灶體積減少越顯著。因此，在最新公約[4]認(rèn)為的最佳移植劑量基礎(chǔ)上適當(dāng)增加hUC-MSC移植劑量，治療MS效果更優(yōu)。但由于本研究樣本小，未能探討求證達(dá)到最佳治療效果的移植劑量，尚需大樣本的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步探討求證。hUC-MSC移植治療可能產(chǎn)生不良反應(yīng)，常見的有發(fā)熱、中性粒細(xì)胞減少、注射部位疼痛、瘙癢等。本研究僅B、D組各出現(xiàn)1例低等發(fā)熱，其他兩組均無明顯不良反應(yīng)發(fā)生。

綜上所述，應(yīng)用hUC-MSC移植治療MS時(shí)，應(yīng)根據(jù)患者自身情況制定個(gè)體化治療方案，根據(jù)患者的耐受情況，在hUC-MSC≤15×106/kg范圍內(nèi)逐步增加其劑量，在盡可能降低并發(fā)癥發(fā)生率的同時(shí)達(dá)到更好的治療效果。

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河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(201503089)。

楊霄鵬(E-mail:yaxipe39@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.021

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B

1002-266X(2017)37-0062-03

2017-07-06)