黃華，姜欣，王衛(wèi)華

(九江市第三人民醫(yī)院，江西九江332000)

外周血T-SPOT.TB與胸腔積液ADA活性檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸腔積液的診斷價(jià)值

黃華，姜欣，王衛(wèi)華

(九江市第三人民醫(yī)院，江西九江332000)

目的探討外周血結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)與胸腔積液腺苷脫氨酶(ADA)活性單獨(dú)或聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸腔積液的診斷價(jià)值。方法選取結(jié)核性胸腔積液患者110例作為結(jié)核組、非結(jié)核性胸腔積液患者60例作為非結(jié)核組。兩組均于治療前采集外周靜脈血進(jìn)行T-SPOT.TB，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)；采集胸腔積液進(jìn)行ADA活性檢測(cè)。根據(jù)外周血T-SPOT.TB檢測(cè)的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)及ADA活性繪制ROC曲線，比較二者單獨(dú)檢測(cè)或聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸腔積液的診斷效能。結(jié)果結(jié)核組外周血T-SPOT.TB陽(yáng)性率、胸腔積液ADA陽(yáng)性率高于非結(jié)核組(P<0.05)；結(jié)核組外周血T-SPOT.TB陽(yáng)性率高于胸腔積液ADA陽(yáng)性率(P<0.05)。兩組外周血T-SPOT.TB的A、B孔斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)及胸腔積液ADA活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)核組外周血T-SPOT.T的ROC曲線下面積大于胸腔積液ADA活性檢測(cè)(P<0.05)，其敏感度高于胸腔積液ADA活性檢測(cè)(P<0.05)。二者聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)核性胸腔積液的敏感度高于單獨(dú)檢測(cè)(P均<0.05)。結(jié)論外周血T-SPOT.TB與胸腔積液ADA活性聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸腔積液的診斷效能高于二者單獨(dú)檢測(cè)。

結(jié)核性胸腔積液；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；腺苷脫氨酶活性檢測(cè)

結(jié)核性胸腔積液是臨床常見(jiàn)的肺外結(jié)核病，診斷與鑒別診斷較難，尤其是與惡性胸腔積液鑒別困難。其診斷主要通過(guò)病史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及胸腔積液常規(guī)檢查，準(zhǔn)確率低，易誤診漏診[1]。胸腔積液抗酸桿菌涂片陽(yáng)性率低；結(jié)核分枝桿菌(MTB)培養(yǎng)是診斷結(jié)核性胸腔積液的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)；胸膜病理學(xué)檢測(cè)特異度高，但有創(chuàng)傷[2]。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)是目前診斷結(jié)核病具有較高靈敏度與特異度的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)，其通過(guò)檢測(cè)因MTB抗原刺激而活化的效應(yīng)T細(xì)胞所釋放的干擾素，確認(rèn)是否存在MTB感染[3]。在臨床胸腔積液腺苷脫氨酶(ADA)檢測(cè)可用于結(jié)核性胸膜炎輔助診斷，但其敏感度略低[4]。本研究對(duì)外周血T-SPOT.TB與胸腔積液ADA活性檢測(cè)在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價(jià)值進(jìn)行探討，為臨床選擇高效診斷方法提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年10月～2017年4月本院治療的結(jié)核性胸腔積液患者110例為結(jié)核組，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，均未經(jīng)抗結(jié)核藥物治療。其中，男76例、女34例，年齡27～60(45.15±10.72)歲；經(jīng)菌型鑒定為MTB感染57例，經(jīng)胸膜病理檢查可見(jiàn)干酪性肉芽腫伴抗酸桿菌陽(yáng)性53例。同期選擇入院治療的非結(jié)核性胸腔積液患者60例為非結(jié)核組，均經(jīng)病理檢查證實(shí)。其中男39例、女21例，年齡36～62(46.90±8.85)歲，胸膜轉(zhuǎn)移癌47例、肺炎旁胸腔積液6例、原發(fā)性胸膜惡性病變7例。兩組性別、年齡具有可比性。兩組納入標(biāo)準(zhǔn)：入院后均經(jīng)胸腔積液常規(guī)生化、細(xì)胞學(xué)和涂片檢測(cè)，胸腔積液和胸膜組織中細(xì)菌、真菌培養(yǎng)及改良羅氏培養(yǎng)或胸腔鏡檢查；排除標(biāo)準(zhǔn)：胸腔積液性質(zhì)為漏出液，人免疫缺陷病毒和急性病毒感染、惡性腫瘤、合并其他嚴(yán)重感染及其他嚴(yán)重慢性疾病，有結(jié)核病史和結(jié)核病接觸史、免疫抑制劑用藥史，妊娠及哺乳期。

1.2 外周血T-SPOT.TB檢測(cè) 兩組均于治療前采集外周靜脈血5 mL，并于2 h內(nèi)用T-SPOT.TB試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。外周靜脈血離心，分離外周血單核細(xì)胞，制成濃度為2.5×106/mL的細(xì)胞懸液。取出微孔板條，加入單個(gè)核細(xì)胞懸液0.1 mL，設(shè)置4個(gè)孔，分別向4個(gè)孔內(nèi)加入陰性對(duì)照(無(wú)血清培養(yǎng)基)、抗原A(ESAT-6抗原)、抗原B(CFP-10抗原)和陽(yáng)性對(duì)照(植物血凝素)各50 μL，經(jīng)孵育、洗滌后加入標(biāo)記抗體工作液50 μL，孵育、洗滌后加入顯色液50 mL，繼續(xù)孵育7 min后終止反應(yīng)，干燥，用Elispot自動(dòng)分析儀計(jì)數(shù)。結(jié)果判定：在陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≤10個(gè)且陽(yáng)性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)>20個(gè)條件下，當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)時(shí)，抗原A或B斑點(diǎn)數(shù)-陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)≥5個(gè)為結(jié)果陽(yáng)性；或當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個(gè)，抗原A或B斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為結(jié)果陽(yáng)性。

1.3 胸腔積液ADA活性檢測(cè) 收集胸腔積液10 mL，離心(1 000 g、5 min)，取上清液，用酶法(全自動(dòng)生化分析儀)測(cè)定血清ADA活性。以ADA≥45 U/L為檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血T-SPOT.TB與胸腔積液ADA檢測(cè)結(jié)果比較 結(jié)核組外周血T-SPOT.TB陽(yáng)性率、胸腔積液ADA陽(yáng)性率高于非結(jié)核組(P均<0.05)；結(jié)核組外周血T-SPOT.TB陽(yáng)性率高于胸腔積液ADA陽(yáng)性率(P<0.05)。見(jiàn)表1。結(jié)核組A、B孔斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)分別為(20±3)、(7±1)/2.5×105個(gè)，非結(jié)核組均為0；結(jié)核組胸腔積液ADA活性為(50±4)U/L，非結(jié)核組為(12±1)U/L。兩組外周血T-SPOT.TB的A、B孔斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)及胸腔積液ADA活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。兩組外周血T-SPOT.TB的A、B孔斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)及胸腔積液ADA活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組外周血T-SPOT.TB、胸腔積液ADA檢測(cè)結(jié)果比較[例(%)]

2.2 外周血T-SPOT.TB與胸腔積液ADA檢測(cè)的診斷效能 建立ROC曲線。計(jì)算外周血T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸腔積液的曲線下面積為0.912(95%CI：0.847～0.956)，胸腔積液ADA活性檢測(cè)診斷結(jié)核性胸腔積液的曲線下面積為0.790(95%CI：0.748～0.950)，二者曲線下面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。外周血T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸腔積液的敏感度(89.09%，95%CI：76.14%～93.72%)高于胸腔積液ADA活性檢測(cè)(80.00%，95%CI：74.05%～92.16%)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，特異度(80.00%，95%CI：74.05%～92.16%)低于胸腔積液ADA活性檢測(cè)(95.45%，95%CI：82.11%～98.75%)，但二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。外周血T-SPOT.TB與胸腔積液ADA活性檢測(cè)任意一項(xiàng)結(jié)果陽(yáng)性診斷為陽(yáng)性，二者均為陰性診斷為陰性。二者聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)核性胸腔積液的敏感度為93.64%(103/110，95%CI：8:0.18%～98.27%)，特異度為83.33%(50/60，95%CI：70.04%～95.37%)。聯(lián)合檢測(cè)敏感度高于二者單獨(dú)檢測(cè)(P均<0.05)。

3 討論

T-SPOT.TB作為一種新型的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)用于結(jié)核病的診斷具有較高的敏感度與特異度[5]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)將其作為診斷結(jié)核的主要手段。T-SPOT.TB結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，可從細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的一種細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)?？菇Y(jié)核免疫分為天然免疫(NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)和獲得性免疫(體液免疫與細(xì)胞免疫)。NK細(xì)胞直接溶解MTB感染的單核細(xì)胞或MTB本身；而中性粒細(xì)胞則通過(guò)釋放防御素協(xié)助巨噬細(xì)胞的殺傷作用[6]。機(jī)體抗MTB主要依賴T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。MTB在體內(nèi)寄生的主要宿主細(xì)胞是肺泡巨噬細(xì)胞，可快速殺滅入侵的病原體。巨噬細(xì)胞可吞噬溶酶體的溶解作用，從而裂解、加工MTB抗原肽(ESAT-6、CPF-10)，且可聯(lián)合MHC類(lèi)分子遞呈ESAT-6、CPF-10給T細(xì)胞，從而致敏T淋巴細(xì)胞，使其成為記憶T淋巴細(xì)胞[7,8]。記憶T淋巴細(xì)胞在機(jī)體再次感染MTB時(shí)增殖為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞并釋放多種細(xì)胞因子。輔助T淋巴細(xì)胞激活后在結(jié)核特異性抗原(ESAT-6、CPF-10)刺激下產(chǎn)生γ-干擾素。γ-干擾素是抗結(jié)核感染免疫中的關(guān)鍵性細(xì)胞因子。經(jīng)ESAT-6、CPF-10刺激后效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌γ-干擾素，檢測(cè)該類(lèi)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的水平可作為結(jié)核感染的標(biāo)志[9]。T-SPOT.TB是目前檢測(cè)分泌γ-干擾素效應(yīng)T淋巴細(xì)胞水平的有效方法，靈敏度高。T-SPOT.TB用單克隆抗體可捕獲細(xì)胞分泌的因子，捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)核，再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合，加入顯色液后出現(xiàn)紫色斑點(diǎn)[10]，采用斑點(diǎn)分析系統(tǒng)分析結(jié)果。本研究結(jié)核組外周血T-SPOT.TB陽(yáng)性率高于非結(jié)核組；兩組外周血T-SPOT.TB的A、B孔斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明外周血T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核性胸腔積液的診斷準(zhǔn)確率較高。外周血T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸腔積液的曲線下面積為0.912，診斷價(jià)值高。

ADA是核酸分解代謝酶類(lèi)，可特異性催化腺嘌呤核苷產(chǎn)生不可逆脫氨反應(yīng)，生成次黃嘌呤，最終氧化為尿酸排出體外[11]。ADA在胸腺、脾臟和其他淋巴組織中含量較高。ADA在淋巴細(xì)胞分化和單核細(xì)胞成熟為巨噬細(xì)胞的過(guò)程中起一定作用，當(dāng)發(fā)生結(jié)核性胸膜炎時(shí)，宿主通過(guò)細(xì)胞免疫抵抗MTB感染，胸膜淋巴細(xì)胞增多、活性增強(qiáng)，故ADA在胸腔積液中含量增高[12]。目前，ADA在臨床已成為診斷結(jié)核性胸膜炎的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。但也有研究認(rèn)為ADA診斷敏感度或特異度偏低。本研究參照文獻(xiàn)以45 U/L為截點(diǎn)[13],結(jié)核組胸腔積液ADA陽(yáng)性率高于非結(jié)核組，胸腔積液ADA活性檢測(cè)診斷結(jié)核性胸腔積液的曲線下面積為0.834，說(shuō)明ADA檢測(cè)具有一定診斷價(jià)值。

本研究中結(jié)核組外周血T-SPOT.TB陽(yáng)性率高于胸腔積液ADA陽(yáng)性率，外周血T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸腔積液的曲線下面積高于胸腔積液ADA活性檢測(cè)，敏感度高于胸腔積液ADA活性檢測(cè)，說(shuō)明外周血T-SPOT.TB比胸腔積液ADA活性檢測(cè)準(zhǔn)確率更高、更靈敏。但胸腔積液ADA活性檢測(cè)診斷結(jié)核性胸腔積液的特異度高于外周血T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB與胸腔積液ADA聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能二者聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)核性胸腔積液的敏感度與特異度均升高。因此在臨床兩種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用，可進(jìn)一步提高結(jié)核性胸腔積液的診斷水平。

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