王乙安，宴玥，趙恒，陸琪，凡碟，者星煒

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650000)

·基礎(chǔ)研究·

腹膜纖維化大鼠模型構(gòu)建及其腹膜組織中熱休克蛋白的表達變化

王乙安，宴玥，趙恒，陸琪，凡碟，者星煒

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650000)

目的構(gòu)建腹膜纖維化大鼠模型，探討其腹膜組織中熱休克蛋白(HSP27、HSP70、HSP90)的表達變化。方法將40只SD大鼠隨機均分為空白對照組及造模2周組、造模4周組、造模6周組。模型組每日給予4.25%葡萄糖持續(xù)非臥床性腹膜透析液(100 mL/kg)腹腔注射，建立腹膜纖維化大鼠模型，空白對照組每日給予等量的生理鹽水腹腔注射。各組于末次腹膜透析后48 h行腹膜平衡試驗評估腹膜轉(zhuǎn)運功能(超濾量、小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率)；采集大鼠腹膜組織，用HE染色法和Masson染色法觀察其組織病理學(xué)變化；采用免疫組化法檢測大鼠腹膜組織TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達。結(jié)果隨腹膜透析時間延長，模型組大鼠腹膜超濾量逐漸降低，小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率逐漸升高(P均<0.05)；腹膜逐漸增厚，間質(zhì)有炎癥細胞浸潤伴水腫及毛細血管增生；腹膜基質(zhì)層增厚，膠原纖維增多，各組大鼠腸系膜組織厚度、腹膜組織厚度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。各組大鼠腹膜組織TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建腹膜纖維化大鼠模型；其腹膜組織中HSP27、HSP70、HSP90蛋白呈高表達，且透析時間越長，以上指標表達變化越明顯。

腹膜纖維化；腹膜透析；熱休克蛋白27；熱休克蛋白70；熱休克蛋白90；大鼠

持續(xù)非臥床性腹膜透析(CAPD)是目前終末期腎臟病的重要替代療法之一[1]。但腹膜組織在非生物相容性腹膜透析液的長期刺激下發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，引起腹膜纖維化[2]。腹膜纖維化致超濾喪失是CAPD患者退出腹膜透析治療的主要原因，限制了CAPD的臨床應(yīng)用。TGF-β/Smad信號蛋白的活化是多種器官和組織(腎、肝、肺、腹膜)纖維化發(fā)生發(fā)展最關(guān)鍵的信號通路[3]。熱休克蛋白(HSP)家族是機體應(yīng)激時表達的蛋白質(zhì),是膠原成熟的必要條件，可能在纖維化過程中發(fā)揮重要作用[4]。近年來研究顯示，HSP27[5]、HSP70[6]、HSP90[7]在多種組織纖維化中表達異常，但與腹膜纖維化的關(guān)系尚未見報道。2016年9月～2017年6月，本研究建立大鼠腹膜纖維化模型，觀察隨透析時間的延長大鼠腹膜形態(tài)學(xué)、功能的改變以及HSP27、HSP70、HSP90蛋白在大鼠腹膜組織中的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料來源 SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，每籠5只，于恒溫(22±2)℃、恒濕55%±5%條件下標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。4.25%葡萄糖透析液購自廣州百特醫(yī)療有限公司；兔抗大鼠TGF-β1、Smad2/3多克隆抗體購自Santa Cruze公司；兔抗大鼠HSP27、HSP70、HSP90多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；山羊血清封閉液購自Bioss公司；即用型快捷免疫組化二抗試劑盒購自邁新公司；陽離子防脫破片購自北京中杉金橋公司；其他生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 動物分組及模型制備 將40只大鼠隨機均分為空白對照組及造模2周組、造模4周組、造模6周組。模型組每日給予4.25%葡萄糖腹膜透析液(100 mL/kg)腹腔注射；空白對照組每日給予等量生理鹽水腹腔注射。大鼠取頭低位，以右下腹靠腹股溝中點處為穿刺點，朝左上方進針，針頭與腹平面呈30°。注射過程中留意有無刺到腹壁及觀察有無肛門、尿道漏液。

1.3 取材方法 造模組分別于末次腹膜透析后48 h、空白對照組于喂養(yǎng)6周肌內(nèi)注射10%水合氯醛進行麻醉，腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液25 mL，4 h后打開腹腔，抽取腹腔內(nèi)腹膜透析液2 mL作為4 h腹透液標本；從腹透液袋中抽取透析液2 mL作為0 h腹透液標本。用紗布吸干腹腔內(nèi)剩余液體，稱重，計算出液量。分別于腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液25 mL前(0 h)及4 h后從大鼠眼內(nèi)眥抽靜脈血2 mL。將透析液、靜脈血分別以1 500、3 000 r/min離心10 min取上清液，置入-80 ℃冰箱保存，進行后續(xù)血生化檢測。沿兩側(cè)腹中線上、中位置且避開穿刺部位取材，留取腹膜組織，用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，進行形態(tài)學(xué)分析及免疫組化檢測；取大鼠幽門下段5～20 cm腸系膜組織，平展于清潔的白色有機玻璃上，肉眼觀察腸系膜組織變化。

1.4 腹膜轉(zhuǎn)運功能評估 采用腹膜平衡試驗。取透析液、靜脈血上清液，采用全自動生化分析儀測定透析液、血漿葡萄糖(Glu)、白蛋白(Alb)、總蛋白(Tp)、肌酐(Cr)、尿素(Ure)水平。計算透析液與血漿Alb比值(D/Ptp)、Tp比值(D/Palb)、Cr比值(D/PCr)、Ure比值(D/Pure)，4 h透析液Glu濃度與0 h透析液Glu濃度比值(D4/D0)。超濾量=最后出水量-25 mL；葡萄糖轉(zhuǎn)運量(MTG)=(透析液初始葡萄糖濃度×注入透析液體積)-(透析末葡萄糖濃度×終末透析液出量)；透析液與血漿溶質(zhì)濃度之比(D/P)=透析液某時間點某溶質(zhì)濃度/血漿該時間點該溶質(zhì)濃度。

1.5 腹膜組織及腸系膜組織形態(tài)學(xué)變化觀察 將留取的腹膜組織及腸系膜組織用4%的多聚甲醛固定48～72 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(厚度4 μm)，脫蠟。采用HE染色法，蘇木素、伊紅染色，梯度脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察腹膜組織及腸系膜組織形態(tài)學(xué)變化。每組取6個樣本，每個樣本做3張切片，每張切片觀察10個視野，測量5個不同位點腸系膜組織厚度，取平均值。切片脫蠟后，采用Masson染色法，分別經(jīng)天青石蘭染液、Weiger鐵蘇木素液、麗春紅酸性品紅液染色，脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察膠原沉積情況并測量腹膜組織厚度。每張切片觀察10個高倍視野，測量5個不同位點腹膜組織厚度，取平均值。

1.6 腹膜組織中TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達檢測 采用免疫組化法。石蠟切片脫蠟后，檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，山羊血清封閉，滴加稀釋后的一抗(TGF-β11∶100、Smad2/3 1∶100、HSP27 1∶100、HSP70 1∶300、HSP90 1∶300)，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次后加二抗，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，陽性信號為棕黃色,信號越強，顏色越深，觀察棕褐色沉積的部位與深淺。每張切片隨機選擇10個高倍視野進行圖像采集，使用Image J圖像處理軟件對染色結(jié)果進行分析。有效測量面積范圍內(nèi)目標染色區(qū)累積光密度值(IOD)/有效測量區(qū)域面積累積IOD作為目標蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組腹膜轉(zhuǎn)運功能比較 超濾量、D4/D0各組比較：空白對照組>造模2周組>造模4周組>造模6周組；小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率(D/PCr、D/Pure、D/Ptp、D/Palb、MTG)各組比較：空白對照組<造模2周組<造模4周組<造模6周組。以上指標四組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腹膜轉(zhuǎn)運功能指標比較

2.2 各組大鼠腹膜及腸系膜組織病理變化比較

2.2.1 HE染色結(jié)果 壁層腹膜組織HE染色顯示，空白對照組壁層腹膜表面覆蓋一層連續(xù)的扁平間皮細胞，細胞完整呈多邊形，核扁圓形，位于細胞中央，間皮下基質(zhì)薄而致密；造模2周組腹膜間皮細胞腫脹變圓，間質(zhì)有炎細胞浸潤伴水腫；造模4周組腹膜增厚，間皮細胞腫脹變圓，部分脫落，間質(zhì)有炎細胞浸潤伴水腫，間皮下基質(zhì)增厚伴毛細血管增生；造模6周組腹膜明顯增厚，間皮細胞皺縮，脫落，纖維裸露，炎細胞減少。腸系膜HE染色結(jié)果顯示：隨造模時間延長，腸系膜組織厚度增厚、腸外縱肌層增厚。腸系膜肉眼可見隨著造模時間的延長，腸系膜透明度減低，系膜上小血管明顯增生，且腸系膜根部有白色纖維樣物質(zhì)沉積。各組大鼠腸系膜組織厚度兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

2.2.2 Masson染色結(jié)果 空白對照組腹膜組織薄而連續(xù)，致密光滑，隨著造模時間的延長，間皮下致密層增厚，膠原纖維增多，腹膜組織厚度增加；隨著腹膜透析時間延長，以上改變更加明顯。各組大鼠腹膜厚度兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腸系膜組織及腹膜組織厚度比較

2.3 各組大鼠腹膜組織TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達比較 各組大鼠腹膜組織TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白相對表達量兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

3 討論

國內(nèi)外大量研究表明，CAPD透析效率與血液透析相當，且對于心功能欠佳、血壓偏低、有出血傾向的患者效果更佳[1]。但透析過程中腹膜組織長期暴露在高滲、高糖的非生理性透析液中，引起腹膜形態(tài)學(xué)和功能的改變，繼而發(fā)生腹膜纖維化，導(dǎo)致小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率升高和超濾衰竭[2]。最終患者無法持續(xù)進行CAPD。腹膜透析時腹膜纖維化呈漸進性，過程隱匿，不易被察覺。目前，國內(nèi)外判別腹膜纖維化的主要方法是觀察腹膜組織形態(tài)變化及檢測間皮細胞和間充質(zhì)細胞標志物表達的變化。臨床上則采用定期行腹膜平衡試驗觀察小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率的變化來判斷患者腹膜情況及是否發(fā)生超濾衰竭，但該方法特異性不強，且與腹膜纖維化的嚴重程度無相關(guān)性。HSP因參與膠原的合成，近年來引起關(guān)注。

表3 各組大鼠腹膜組織TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達比較

CAPD患者腹膜功能的改變主要為腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率增高，超濾量下降，而腹膜溶質(zhì)高轉(zhuǎn)運以小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率增加為特征，其中小分子溶質(zhì)包括Glu、Alb、Tp、Cr、Ure等[8]。本研究通過采用4.25%葡萄糖透析液建立腹膜纖維化大鼠模型，發(fā)現(xiàn)從造模第2周起，大鼠腹膜形態(tài)開始發(fā)生改變，腹膜間皮細胞數(shù)量減少，大量新生血管形成，炎癥細胞浸潤，腹膜基質(zhì)層膠原堆積，超濾量降低，小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率增高。且隨著透析時間延長，以上指標改變更加明顯，至第6周達高峰。與相關(guān)文獻[9]結(jié)果一致，證明成功建立了大鼠腹膜纖維化模型。

多器官、組織的纖維化如腎、肝、肺等器官以及腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展均與TGF-β有關(guān)[3]。TGF-β主要通過激活下游信號蛋白Smads，促進成纖維細胞增殖和聚集，使上皮細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞。本研究結(jié)果顯示，透析組大鼠TGF-β1、Smad2/3的表達逐漸升高，且隨著腹膜纖維化的進展呈升高趨勢，與相關(guān)文獻[10]結(jié)果一致。

HSP是機體應(yīng)激時表達的一種蛋白質(zhì)，既能通過模式識別受體激活先天免疫系統(tǒng)啟動或促進炎癥反應(yīng)，也能作為前膠原的“分子伴侶”參與膠原合成及成熟，并調(diào)控膠原產(chǎn)量，進而促進纖維化進程[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HSP家族在肺、肝、腎等多種纖維化疾病中表達異常[5～7]。Vidyasagar等[11]研究發(fā)現(xiàn)，腎臟纖維化過程中HSP27的表達升高，且HSP27與纖維化相關(guān)因子TGF-β1、肌動蛋白、E-鈣黏蛋白相關(guān)。HSP70在纖維化中發(fā)揮不同的作用。Tanaka等[12]研究證實HSP70具有抗纖維化的作用，過表達HSP70的轉(zhuǎn)基因小鼠肺部炎癥和纖維化病變減輕；而抑制HSP70的表達可促進TGF-β1分泌及細胞外基質(zhì)的合成，進而促進纖維細胞向肌成纖維細胞分化和增生，加劇小鼠肺纖維化進程。與之相反，部分研究發(fā)現(xiàn)，HSP70可激活先天免疫系統(tǒng)及促進炎癥反應(yīng)，并促進膠原合成[6]。HSP70發(fā)揮的作用不同，可能是因為隨著造模時間的延長，機體度過恢復(fù)期，HSP70的保護作用逐漸減弱，促纖維化作用占主導(dǎo)地位，從而加重纖維化。故HSP70在纖維化中具體作用機制尚待進一步明確。抑制HSP90的表達可通過抑制肌成纖維細胞、纖維連接蛋白及膠原蛋白的表達來抑制腎臟纖維化與肝纖維化[13]。機制可能為：其低表達可阻遏TGF-β1靶基因的轉(zhuǎn)錄及磷酸化，從而抑制TGF-β1信號通路，阻止纖維化的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，造模2～4周組中HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達量不斷增加，說明HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達隨著腹膜纖維化進程而逐漸增加，提示在腹膜纖維化過程中，HSP27、HSP70、HSP90的主導(dǎo)作用為促進膠原的合成，參與腹膜纖維化的病理進展。

綜上所述，HSP27、HSP70、HSP90可能參與大鼠腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展。HSP可能成為早期診斷腹膜纖維化的新型分子標志物。因此深入探討HSP與腹膜纖維化的相關(guān)分子機制，對HSP家族分子進行調(diào)控，可能影響腹膜纖維化的進展，為臨床腹膜纖維化的診斷、治療及預(yù)后提供參考。

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