陳 松， 韓永麗， 吳 松△， 王 華， 梁鳳霞， 黃 偉，2， 陳 茜

1湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430061 2湖北省中醫(yī)院針灸科，武漢 430061

針刺“內關”預處理對大鼠缺血再灌注心肌的保護作用及機制研究*

陳 松1， 韓永麗1， 吳 松1△， 王 華1， 梁鳳霞1， 黃 偉1，2， 陳 茜1

1湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 4300612湖北省中醫(yī)院針灸科，武漢 430061

目的探討電針“內關”預處理是否通過p38 MAPK信號通路來影響心肌缺血再灌注損傷。方法選用3月齡Wistar雄性大鼠40只，體重(220±23) g，編號后按隨機數(shù)字表分入對照組(僅穿線，不結扎)、模型組、電針預處理組、電針預處理+SB230580組，每組10只。通過阻斷左冠狀動脈前降支缺血30 min，再灌注120 min，檢測心肌缺血再灌注損傷后各項心功能指標(舒張末期壓力、左室收縮期平均壓、短軸縮短率和射血分數(shù))，檢測心肌組織中活性氧(ROS)含量，超氧化物歧化酶SOD活性，丙二醛(MDA)含量及ATP含量，透射電鏡下觀察心肌超微結構的變化。結果與對照組比較，模型組各項心功能指標中舒張末期壓力升高，左室收縮期平均壓、短軸縮短率和射血分數(shù)均降低(均P<0.05)，梗死面積和梗死程度均升高(均P<0.01)，心肌肌纖維溶解、斷裂，間質增大，心肌細胞腫脹明顯，SOD活性及ATP含量明顯下降，ROS及MDA含量明顯上升(均P<0.05)，電針預處理可明顯減輕這種變化，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，SB230580抑制劑可減弱電針“內關”預處理的這種作用(均P<0.05)。結論電針“內關”預處理能顯著改善心肌缺血再灌注損傷后心功能及心肌細胞活性，降低心肌梗死面積，減輕線粒體的腫脹程度，保護線粒體的完整性。這種保護作用可能與改善心肌細胞的呼吸功能有關。

電針； 預處理； 缺血再灌注損傷； 線粒體； p38 MAPK通路

與冠狀動脈持續(xù)閉塞相比，心肌缺血后的及時再灌注能夠縮小心肌梗死范圍并改善左室收縮功能，而再灌注本身又能導致缺血期間并不存在的損傷并使已有損傷加重。這一過程包含大量交互式機制的級聯(lián)反應持續(xù)進展，最終導致心肌細胞功能代謝紊亂及細胞凋亡[1-2]。這種現(xiàn)象即是心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)。MIRI的發(fā)生機制非常復雜，常伴隨重度的無菌性炎癥反應，并通過多重信號通路，誘導炎性細胞因子和炎癥趨化因子的產生與聚集。p38 MAPK信號通路作為MAPK家族的重要成員，通過對胞內信號的傳遞參與細胞對外界環(huán)境改變的調節(jié)性反應，并且還可以與其他信號通路相互作用，是細胞內信號傳遞的交匯點[3]。前期研究表明，電針“內關”對缺血心肌細胞電活動有明顯的保護作用，其中既有中樞神經核團的參與，也與神經內分泌因子調節(jié)下游MAPK信號通路有關[4-8]。但是針刺“內關”預處理降低MIRI損傷，是否有p38 MAPK信號通路的參與，目前鮮見報道。本文旨在探討針刺“內關”預處理對MIRI的影響及其可能機制，為尋找更好的預處理方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

主要實驗儀器：BL-Newcentury 410生物信號及壓力測試系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，ALC-V系列動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技公司)，aquaplus2系列艾科浦超純水制成機(美國艾科浦國際有限公司)，WH-2型微型漩渦混勻器(上海滬西分析儀器廠)，Clark氧電極(英國Hansateach公司中國總部)，ST-360型酶標儀(上海旦鼎國際貿易有限公司)，601型超級恒溫水浴(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)，TGL-10B系列臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，HANS-200型電針治療儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司)。主要試劑：PBS緩沖液、ROS測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所，超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒和三磷酸腺苷(ATP)含量測試盒均購自南京建成生物工程研究所，p38 MAPK信號通路特異性阻斷劑SB203580購自美國Selleck生物科技有限公司。

1.2 實驗動物及分組

1.2.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠40只，3月齡，體重(220±23) g，由湖北省實驗動物研究中心提供，動物許可證號：SCXK(鄂)2015-0018，實驗動物質量合格證號：42000600008926。動物實驗在湖北中醫(yī)藥大學科研中心進行，實驗動物設施使用證編號：No.00133292。

1.2.2 實驗分組及處理方法 采用隨機數(shù)字表法，將40只大鼠隨機分為4組：對照組(S組)、模型組(M組)、電針預處理組(EA組)和電針預處理+SB230580組(EA+SB組)。對照組：常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理；缺血再灌注(模型)組：捆綁1次/d，20 min/次，第8天開胸后缺血20 min，再灌注40 min；電針預處理組和電針預處理+SB230580組：捆綁1次/d，同時進行電針刺操作，20 min/次，共7 d，SB230580采用頸背部皮下注射，0.3 mg/kg·d，共7 d，第8天開胸后缺血20 min，再灌注40 min。

1.3 心肌缺血再灌注模型的建立

方法參見文獻[9-10]。采用體內心肌缺血再灌注損傷模型，用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內注射進行麻醉，起效后將大鼠置于鼠臺上固定，心電圖監(jiān)測。將大鼠頸部濕潤剃毛消毒后橫行切開皮膚約1 cm，分層暴露氣管，于正中第3、4氣管軟骨環(huán)作倒“T”型切口，置入特制氣管導管，接呼吸機[呼吸頻率50次/min，呼吸功能比1∶1.5，壓力20 cmH2O(1 cmH2O=98 Pa)]。分離右側頸總動脈，將PE-50聚乙烯管插入頸外靜脈和頸動脈，用于心功能監(jiān)測。左側胸前濕潤剃毛消毒后于胸骨第3、4肋間橫切口切開皮膚，用止血鉗鈍性分離各肌層及胸膜并撐開，剪開心包膜，暴露心臟，在心大靜脈附件的左心耳下2～3 mm處用2×6帶線圓針6-0號醫(yī)用錦綸單絲線繞過前降支冠狀動脈，肺動脈圓錐旁溝出針，心電圖監(jiān)測顯示正常時，于絲線上方墊一PE管，打活結造成缺血模型，并采用推管法行左冠狀動脈缺血再灌注術。以左室前壁向外膨脹及心電ST段抬高為缺血標志；再灌注時左室前壁缺血區(qū)紫色消失，抬高的ST段下降1/2以上，局部可見反應性充血，有炎性水腫和滲出，即缺血再灌注模型復制成功。

1.4 電針預處理方法

參照《實驗動物穴位圖譜》[11]選取大鼠腧穴。內關位于大鼠前肢內側、離腕關節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間，雙側取穴。用0.30 mm×15 mm華佗牌毫針直刺，針刺深度約5 mm，接HANS-200型電針治療儀，選用連續(xù)波，頻率2 Hz，強度1 mA，通電治療20 min。

1.5 指標檢測

1.5.1 心肌標本梗死面積和梗死重量的測定 剖取大鼠全心，冰生理鹽水洗凈，濾紙吸干，液氮固定，浸入新鮮配制的NB-T磷酸緩沖液中染色。染色完全后取出，正常組織(缺血危險區(qū))染色呈藍色，梗死組織(即梗死區(qū))不染色，呈白色。用數(shù)碼相機記錄心肌標本，采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)分析，分別計算梗死面積占心肌切片總面積的百分比和梗死區(qū)占全心重量的百分比。

1.5.2 心功能的測定 造模成功后將已經插入頸動脈的PE-50聚乙烯管末端與生物信號及壓力測試系統(tǒng)相連，進入左心室，收集左心室的心功能指標：左室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室收縮期平均壓(left ventricular systolic mean presure，LVSP)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)和射血分數(shù)(ejection fraction，EF)。

1.5.3 心肌組織內ROS含量、SOD活性、MDA含量及ATP含量測定 在冰槽內切取心臟，并稱取100 mg心肌組織放入離心管。制備成10%的勻漿液。將離心管放置于高溫沸水浴箱中，10 min后取出搖勻，轉速為3 500 g的離心機中離心10 min，抽取上清液檢測。之后嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，采用黃嘌呤氧化法檢測心肌SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測心肌MDA含量，高效液相色譜法檢測心肌組織中ATP的含量。

1.5.4 心肌組織超微結構觀察 取大鼠心臟，濾紙吸干血跡，用4%多聚甲醛固定，再刀片切取心室部位，用2.5%戊二醛固定3 h、磷酸緩沖液漂洗，切片經脫水、包埋、固化、超薄切片，然后以3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在透射電鏡下觀察心肌細胞腫脹及損傷程度。

1.6 統(tǒng)計學方法

將實驗數(shù)據錄入IBM-SPSS 19.0軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差描述，采用K-S或S-W檢驗以驗證數(shù)據的正態(tài)性，采取Levene檢驗以驗證數(shù)據的方差齊性。組間均數(shù)差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌梗死情況比較

結果見表1。與S組相比較，M組的梗死面積和梗死程度均升高(均P<0.01)；EA組和EA+SB組的心肌損傷程度均較M組有顯著性差異(均P<0.01)，且EA組的各項指標優(yōu)于EA+SB組(均P<0.05)。

與M組比較，△△P<0.01；與EA組比較，*P<0.05

2.2 各組大鼠心功能比較

結果見表2。與S組相比較，M組、EA組和EA+SB組的LVEDP升高，LVSP、FS、EF均降低(均P<0.05)。同時，EA組、EA+SB組與M組之間各項指標的差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

2.3 大鼠心肌組織ROS含量、SOD活性、MDA含量及ATP含量

如表3所示，與S組比較，M組、EA組及EA+SB組大鼠心肌細胞SOD活性及ATP含量明顯下降，ROS及MDA含量明顯上升(均P<0.05);EA組及EA+SB組ROS、MDA、ATP含量及SOD活性，與M組比較，均有顯著性差異(均P<0.05)，其中EA組各項指標優(yōu)于EA+SB組(均P<0.05)。

表2 各組大鼠心功能指標Table 2 The indexes of rat cardiac function in each group(±s)

與S組比較，#P<0.01；與M組比較，△P<0.05

2.4 透射電鏡觀察各組大鼠心肌細胞內部結構

如圖1所示，S組正常心肌纖維排列規(guī)則，細胞結構完整，細胞核及線粒體形態(tài)和數(shù)量正常，線粒體嵴清晰，心肌間未見異常(圖1A)。M組(圖1B)心肌肌纖維出現(xiàn)溶解斷裂甚至壞死，間質增大，腫脹明顯；部分線粒體固縮變小，部分線粒體腫脹或外膜破損；線粒體嵴不規(guī)則、斷裂成絮狀、缺失。EA組(圖1C)及EA+SB組(圖1D)心肌肌纖維間隙輕度增寬，壞死灶減輕，心肌細胞輕微腫脹，細胞核及線粒體結構基本完整，小部分線粒體仍存在空泡樣病變。

表3 大鼠心肌組織ROS含量、SOD活性、MDA含量及ATP含量Table 3 The ROS content，SOD activity，MDA content and ATP content in myocardial tissues in each group(±s)

與S組比較，#P<0.01；與M組比較，△P<0.05；與EA組比較，*P<0.05

A：S組；B：M組；C：EA組；D：EA+SB組圖1 各組大鼠心肌細胞電鏡照片(×10 000)Fig.1 Electronic microscopy of rat myocardiocytes in each group(×10 000)

3 討論

預處理，即“未病先防”，屬于中醫(yī)學里“治未病”的理論范疇?！爸挝床　笔侵嗅t(yī)學的重要組成部分，并且有著悠久的文化內涵。如《道德經·七十一章》中說：“其安易持，其未兆易謀，其脆易泮，其微易散，為之于未有，治之于未亂”。《素問·刺熱論》中也說：“病雖未發(fā)，見赤色者刺之，名曰治未病?！薄Ｎ覈F(xiàn)行衛(wèi)生醫(yī)療服務體系主要包括由各級醫(yī)院構成的治病體系和疾病預防控制中心構成的防病體系兩部分組成，但是防病體系多重視傳染病的預防和公共衛(wèi)生的治理，對常見慢性病及病前亞健康狀態(tài)關注度不夠。在中醫(yī)防治一體的基本法則和健康理念下，針刺作為一項基本的中醫(yī)治療技術，在疾病的預防和康復領域，正受到越來越多的重視[12-14]。并且這種預處理的思想，將可與基因檢測手段相融合，做到有針對性地精準預防及治療[15]。本實驗中發(fā)現(xiàn)，針刺預處理確實能夠改善MIRI的心功能各項指標，降低心肌梗死程度，并且從信號通路水平證實了“未病先防”的合理性。

我們在前期研究中[4-5]，已經證實針刺“內關”穴可以通過p38 MAPK信號通路，抑制心肌細胞中TNF-α和IL-1β的表達，來保護心肌肥厚。并且針刺預處理可以有效保護缺血心肌，啟動機體內源性的自我保護機制，抵抗隨后可能發(fā)生的疾病損害。如針刺“內關”穴預處理能降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心電圖的STⅡ值，減少血漿中降鈣素基因相關肽、血清缺血修飾白蛋白含量，提高心肌細胞中縫隙蛋白Cx43的表達水平，參與缺血心肌的保護[16-18]。

活性氧(ROS)，在缺血再灌注時的破壞機制中發(fā)揮重要作用。在呼吸爆發(fā)狀態(tài)下，激活的中性粒細胞生成大量ROS，與ROS自身形成的“ROS觸發(fā)ROS”的大規(guī)模爆發(fā)。脂質過氧化導致細胞膜損傷及鈣超載，通透性增加，誘導細胞毒性的發(fā)生，導致自由基清除酶(SOD)的數(shù)量和活性降低，MDA、LDH等酶大量漏出，損害心肌細胞[19]。本實驗中發(fā)現(xiàn)，針刺預處理確實可以改善MIRI心肌細胞的活性和供能，抑制ROS的活性和MDA的生成。同時，ROS作為信號分子，可以介導如蛋白激酶C、MAPKs等信號通路的轉導，甚至直接激活p38 MAPK信號通路[20]。p38 MAPK采用高度保守的三級酶促級聯(lián)反應來進行信號傳遞，該通路可被多種應激刺激(如熱休克、高滲、缺血再灌注等)激活。作為經典的炎癥通路，進一步加重MIRI損傷，并且磷酸化p38 MAPK能夠進一步活化下游底物，通過核因子介導，啟動炎癥細胞釋放腫瘤壞死因子和白介素等致炎因子，最終導致細胞凋亡[21-22]。本研究也證實了針刺“內關”預處理對心肌的保護作用可能跟調控心肌細胞呼吸功能有關，說明電針“內關”預處理對MIRI心肌損傷的保護作用應該是多種途徑共同作用的結果。

電鏡下觀察到，M組的心肌肌纖維出現(xiàn)溶解斷裂甚至壞死，間隙增大，細胞及線粒體腫脹明顯。部分線粒體固縮變小，部分線粒體腫脹、或外膜破損。線粒體嵴不規(guī)則、斷裂成絮狀、缺失。EA組和EA+SB組均可以減輕MIRI心肌損傷，有效保護線粒體的完整性。

綜上所述，我們通過建立MIRI模型證實，電針“內關”預處理至少可以通過調控心肌細胞呼吸功能有效保護MIRI心肌損傷，也證實了電針對心肌的保護作用應該是多層次，多靶點。但其是否通過p38 MAPK信號通路進行調控，以及如何調控下游轉錄因子及與哪些功能性基因相關，還需體內、體外實驗進一步證實。

[1] 張雯，宋俊科，杜冠華.缺血再灌注損傷與細胞凋亡信號轉導通路[J].中國藥學雜志，2015，50(7)：565-569.

[2] 周鳳華，潘蕓蕓，崔小冰，等.ERK/2與p38信號通路介導三七皂苷R1抗H2O2致心肌細胞損傷作用[J].中藥藥理與臨床，2016，32(2)：17-20.

[3] 陳冰心，任澎.心肌缺血再灌注損傷信號分子p38 MAPK的研究進展，2010，29(1)：68-70.

[4] 吳松，李佳，洪亞群，等.電針“內關”對心肌肥厚模型大鼠TNF-α和IL-1β的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(9)：2287-2289.

[5] 吳松，李佳，洪亞群，等.電針“內關”對心肌肥厚模型大鼠p38絲裂原激活蛋白酶信號通路的影響[J].中國針灸，2012，32(2)：145-148.

[6] Li J，Wu S，Hong Y Q，et al.Effect of EA on Neiguan acupoint influencing cardiac hypertrophic model rats in catecholamine neurotransmitters[J].World J Acupunct Moxibustion，2011，21(4)：32-36.

[7] Li J，Li J，Liang F X，et al.Electroacupuncture at PC6(Neiguan)improves extracellular signal-regulated kinase signaling pathways through the regulation of neuroendocrine cytokines in myocardial hypertrophic rats[J].Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：792820.

[8] Li J，Li J，Chen Z B，et al.The influence of PC6(Neiguan)on cardiovascular disorders：A review of central neural mechanisms[J].Acupunct Med，2012，30(1)：47-50.

[9] 汪夢霞，廖錦華，馬達，等.大鼠在體心肌缺血再灌注模型的建立[J].臨床醫(yī)學工程，2013，20(5)：533-535.

[10] 來麗娜，張曉京，張曉一，等.蛋白激酶C在缺血預處理減輕大鼠心肌缺血再灌注時線粒體損傷中的作用[J].中華麻醉學雜志，2014，34(3)：359-362.

[11] 華興邦，李辭蓉，周浩良，等.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物和動物實驗，1991，1：1-5.

[12] 洪亞群，唐克樂，王靜芝，等.淺析針灸“治未病”內涵與外延[J].遼寧中醫(yī)雜志，2016，43(11)：2383-2384.

[13] 徐經世，李艷，趙進東，等.中醫(yī)“治未病”的理論溯源與實踐思考[J].中醫(yī)雜志，2016，57(16)：1351-1354.

[14] 袁尚華.“防治一體”的中醫(yī)健康醫(yī)學模式[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2016，22(4)：490-491，506.

[15] 葉健成.利用部分中醫(yī)思想結合現(xiàn)代科技應用闡釋“中醫(yī)西釋治未病”理念[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31(4)：1142-1145.

[16] 張松興，徐月英，邱澤玲.針刺預處理研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2007，9(5)：72-74.

[17] 林亞平，王曉順，易受鄉(xiāng)，等.不同頻率電針“內關”預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠血液內IMA及CGRP含量的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(8)：2152-2154.

[18] 周丹，李虹，高智穎.針灸預處理“內關”穴對心肌缺血再灌注兔心肌Cx43的影響[J].中國針灸，2013，33(11)：1013-1016.

[19] Pei H X，Hua R，Guan C X，et al.Ginkgolide-b reduces the degradation of menmbrane phospholipids to prevent ischemia/reperfusion myocardial injury in rats[J].Pharmacology，2015，96(5/6)：233-239.

[20] Kumphune S，Chattipakorn S，Chattipakorn N.Role of p38 inhibiton in cardiac ischemia/reperfusion injury[J].Eur J Clin Pharmacol，2012，68(5)：513-524.

[21] Li G，Qian W，Zhao C.Analyzing the anti-ischemia-reperfusion injury effects of ginsenoside Rb1 mediated through the inbibition of p38α MAPK[J].Can J Physiol，2016，94(1)：97-103.

[22] Gao X F，Zhou Y，Wang D Y，et al.urocortin-2 suppression of p38-MAPK signaling os an additional mechanism for ischemia cardioprotection[J].Mol cell Biochem，2015，398(1/2)：135-146.

ElectroacupuncturePreconditioningat“Neiguan”PreventsMyocardialIschemia-reperfusionInjuryinRatsbyActivatingp38-MAPKPathway

Chen Song，Han Yongli，Wu Song△et al

CollegeofAcupuncture-MoxibustionandOrthpaedics，HubeiUniversityofChineseMedicine；HubeiCollaborativeInnovationCenterofAcupunctureandMoxibustionforDiseasePrevention，Wuhan430061，China

ObjectiveTo investigate the protective mechanism of electroacupuncture preconditioning at “Neiguan” in preventing myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI)in rats.MethodsForty male Wistar rats，3 months old，weighting about (220±23) g，were randomly divided into four groups：sham operation group(sham group)，MIRI model group(model group)，electroacupuncture preconditioning group(EA group)and electroacupuncture preconditioning+SB203580 group(EA+SB group)，with 10 rats in each group.The MIRI model was achieved by the ligation of the left anterior descending artery to cause ischemia for 30 min and then deligation for 120-min reperfusion.Before the model establishment，rats in the EA group and EA+SB group

electric acupuncture for 20 min(1 mA，continuous wave).After MIRI，the cardiac function indexes including left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP)，left ventricular systolic mean pressure(LVSP)，fractional shortening(FS)and ejection fraction(EF)were evaluated.Myocardial tissues were later obtained，the contents of ROS，SOD，MDA and ATP were detected and the ultrastructures were observed.ResultsRats in the model group had increased infarction size when compared with those in the sham group.Their LVSP，F(xiàn)S and EF were much lower，and LVEDP much higher than those in the sham group(P<0.05).There were dissolved and necrotic muscle fibers，increased myocardial interstitial gap and edema in the model group.The contents of ROS and MDA were increased，and those of ATP and SOD activity decreased in the model group as compared with those in the sham group(P<0.05).These indexes were greatly improved in rats experiencing electroacupuncture preconditioning，whereas the effects were suppressed after addition of SB230580(P<0.05).ConclusionElectroacupuncture preconditioning at“Neiguan” significantly improves the cardiac function，increases the cell activity，decreases the infarction area，mitigates the mitochondrial swelling and protects the integrity of the mitochondria，which may be associated with the improvement of the respiratory function of myocardiocytes.

electroacupuncture； preconditioning； myocardial ischemia-reperfusion injury； mitochondrion； p38 MAPK signaling pathway

*國家自然科學基金青年基金資助項目(No.81403460)

陳 松，男，1986年生，講師，E-mail：362573836@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：119065124@qq.com

R245.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.05.006

(2016-08-15 收稿)