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(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.浙江省家蠶生物反應(yīng)器和生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)

抗PD-L1 CAR基因的構(gòu)建及CAR-T的功能活性研究

白靜a,b，張潔雯a,b，施煒星a，陳健a,b，呂正兵a,b

(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.浙江省家蠶生物反應(yīng)器和生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)

鑒于嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cells, CAR-T)療法應(yīng)用于腫瘤治療的臨床試驗(yàn)已取得很大突破，設(shè)計(jì)了程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1, PD-L1)特異性CAR-T細(xì)胞以體外殺傷肺癌細(xì)胞。通過克隆表達(dá)PD-L1(73-739)，并純化PD-L1蛋白以免疫BALB/c小鼠制備獲得PD-L1單克隆抗體；克隆PD-L1單克隆抗體單鏈可變區(qū)片段，與CD28、4-1BB、CD3-ζ鏈的基因體外融合構(gòu)建第三代CAR基因，并克隆于慢病毒載體pCDH-CMV-EF1-copGFP上，包裝成慢病毒。該慢病毒感染CD8+T細(xì)胞，擴(kuò)增5 d，測定CAR的表達(dá)，表達(dá)率可達(dá)到22%以上。PD-L1靶向的腫瘤細(xì)胞殺傷作用分析顯示，抗PD-L1 CAR-T細(xì)胞有一定的體外殺傷活性。

肺癌;程序性死亡配體-1;嵌合抗原受體;單克隆抗體;過繼細(xì)胞治療

0 引 言

腫瘤，尤其是惡性腫瘤，是目前威脅人類生命健康的最主要疾病之一。其中肺癌已成為比較常見的惡性腫瘤。在我國，無論是肺癌的發(fā)病率還是死亡率均高居首位[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腫瘤治療的手段不斷創(chuàng)新，免疫治療已成為繼手術(shù)、放療、化療后的第四種行之有效的治療手段，而它的臨床試驗(yàn)進(jìn)展更令人矚目，因此，腫瘤免疫治療在2013年被《Science》雜志評為年度十大科學(xué)突破第一位[2]。CAR-T細(xì)胞治療，是嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors，CAR)修飾的T細(xì)胞治療，是免疫治療一個(gè)重要方面，該技術(shù)是通過基因修飾的手段，將患者的T細(xì)胞在體外修飾，活化和擴(kuò)增后，再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)[3]。經(jīng)過不斷的研究與改進(jìn)，CAR基因已由第一代發(fā)展到第三代；第一代僅CD3復(fù)合物(ζ鏈)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合形成嵌合受體[4-5]，第二代引入一個(gè)共刺激因子(如CD28)[6]，第三代CAR又增加一個(gè)共刺激因子引入(如CD134(OX40)、CD137(4-1BB))[7]。Zhao等[8]通過應(yīng)用CD28和CD137兩個(gè)共刺激因子構(gòu)建第三代CAR，第三代CAR-T細(xì)胞展示出較強(qiáng)的殺腫瘤功能，并增強(qiáng)T細(xì)胞在體內(nèi)作用的持久性。

PD-L1分子，亦稱B7-H1、CD274[9-10]，是PD-1的主要配體，并在很多惡性腫瘤中高表達(dá)[11-17]，在免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。PD-1/PD-L1信號通路的激活，有助于形成腫瘤微環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和殺傷，而阻斷該信號通路，可以促進(jìn)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的增殖，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[18]。PD-1單克隆抗體與CAR-T技術(shù)結(jié)合，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，驗(yàn)證該聯(lián)合療法消除腫瘤的可行性[19]。PD-L1是PD-1的配體，PD-L1單克隆抗體優(yōu)勢也比較明顯，如特異性強(qiáng)，副作用低，腫瘤控制時(shí)間長等，它已成為治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)有效手段，并在臨床試驗(yàn)中取得突破性進(jìn)展[20-22]。本文設(shè)想將PD-L1作為CAR-T治療的靶抗原，抗PD-L1 CAR-T既能阻斷PD-1/PD-L1信號通路，提高T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫治療，又可以直接特異性地殺死腫瘤細(xì)胞，而且構(gòu)建的第三代CAR基因可以增加T細(xì)胞在體內(nèi)的存活時(shí)間，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性和持久性。本文提出把PD-L1作為CAR-T細(xì)胞的靶點(diǎn)，驗(yàn)證抗PD-L1 CAR-T細(xì)胞在體外對腫瘤細(xì)胞有殺傷活性，為后續(xù)的體內(nèi)試驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種TG1、BL21(DE3)，質(zhì)粒pcDAN3.1-PD-L1(73-739)、pETduet-His-SUMO、pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP、pLP1、pLP2、pLP-VSVG，細(xì)胞株293T、A549、NCL-H1048及小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0均由本實(shí)驗(yàn)室提供；小鼠采用SPF級BALB/c雌性小鼠(購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)；生物分子試劑非特殊說明均購于Takara；蛋白Marker(Thermo)；Anti-His6抗體(Roche)；BCA蛋白定量試劑盒(Biomiga)；TMB單組份顯色液(Solarbio)；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT、四甲基聯(lián)苯胺、PEG、8-N-鳥嘌呤均購于Sigma；CD8+T細(xì)胞分選磁珠(Miltenyi)；培養(yǎng)基RPMI-1640、DMEM，F(xiàn)BS，IL-2，均購于Gibco；Ficoll-Paque PREMIUM sterile solution(GE healthcare)、IFN-γ檢測試劑盒(Life technologies)。

1.2 pETduet-His-SUMO-PD-L1(73-739)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及PD-L1蛋白的表達(dá)與純化

1.2.1 pETduet-His-SUMO-PD-L1(73-739)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過限制性內(nèi)切酶EcoR I和NotI對含有pcDNA3.1-PD-L1(73-739)基因的質(zhì)粒和pETduet-His-SUMO載體分別進(jìn)行雙酶切獲得PD-L1(73-739)基因片段和載體片段，采用凝膠回收試劑盒(Axygen)回收目的片段，通過T4DNA Ligase將回收的酶切產(chǎn)物于16～24 ℃連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1感受態(tài)；轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)10 h。挑選單斑菌落，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)10 h，提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定獲得pETduet-PD-L1(73-739)，并送至上海生工生物工程有限公司測序驗(yàn)證。

1.2.2 PD-L1蛋白的表達(dá)與純化

將pETduet-PD-L1(73-739)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，使用蛋白割膠回收試劑盒(Sangon)純化，SDS-PAGE凝膠電泳檢測目的蛋白，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%，電泳時(shí)間1.5 h，考馬斯亮藍(lán)溶液染色2.0 h，脫色至目的條帶清晰后拍照記錄。隨后利用Western blotting驗(yàn)證，將SDS-PAGE凝膠上的PD-L1蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)脫脂奶粉封閉后，加入1∶5000倍稀釋的Anti-His6，孵育1.0 h，TBST洗膜3次，每次15 min，用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)采集圖像。

1.3 PD-L1單克隆抗體制備

1.3.1 動(dòng)物免疫

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[23-24]改進(jìn)，1 mg/mL的PD-L1純化蛋白與等體積弗氏完全佐劑混勻免疫BALB/c雌性小鼠，每隔兩周進(jìn)行一次免疫，進(jìn)行腹部或皮下注射，共免疫4次，一周后收集小鼠脾細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞融合

將1×106個(gè)脾臟細(xì)胞和1×105的SP2/0細(xì)胞充分混合，在1 mL的37 ℃預(yù)熱PEG溶液(pH值為8.0～8.2)作用下融合1 min，再加入RPMI-1640培養(yǎng)基終止PEG作用，1000 rpm離心3 min，重復(fù)洗滌兩次，細(xì)胞接種密度調(diào)至2.5×106/mL，50 μL/孔并接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4.0～6.0 h后每孔加入50 μL 2×HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)[23]。

1.3.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選

細(xì)胞融合后生長10 d左右，檢測克隆陽性孔，對陽性克隆的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過三輪有限稀釋法進(jìn)一步篩選，獲得5株雜交瘤細(xì)胞株，分別利用PD-L1蛋白和經(jīng)過固定處理NCL-H1048細(xì)胞(高表達(dá)PD-L1蛋白)作為包被抗原，篩選獲得一株最優(yōu)雜交瘤細(xì)胞株[25]。

1.3.4 腹水單克隆抗體制備與純化

提前一周將400 μL弗氏不完全佐劑注射到小鼠體內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)，擴(kuò)大培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度8×105個(gè)/mL，取1 mL腹腔注射小鼠體內(nèi)，一周后，收取腹水，8000 rpm離心10 min；ELISA法確定單克隆抗體的亞型，二抗羊抗鼠分型二抗1∶5000稀釋使用，確定抗體亞型，選擇Protein G填料(索萊寶)純化抗體，ELISA法檢測抗體效價(jià)，Western blotting技術(shù)鑒定。

1.4 PD-L1特異性CAR基因的構(gòu)建

表1 PCR引物設(shè)計(jì)

注：表中下劃線部分為EcoR I和NotI。

將輕鏈(κ鏈)編碼區(qū)和重鏈恒定區(qū)的序列由人源IgG編碼區(qū)輕鏈(κ鏈)和重鏈恒定區(qū)序列替換，將人源化單克隆抗體基因與CD28、4-1BB、CD3-ζ鏈的基因序列組合。PD-L1特異性CAR基因載體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如圖1所示，產(chǎn)生編碼嵌合抗原受體的CAR基因，由蘇州泓訊生物技術(shù)有限公司合成，克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體上。

圖1 PD-L1特異性CAR基因載體結(jié)構(gòu)簡圖注：pCMV為CMV啟動(dòng)子；pEF1為EF1啟動(dòng)子。

1.5 CAR-T細(xì)胞的制備

使用脂質(zhì)體3000將穿梭載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-CAR與pLP1、pLP2、pLP-VSVG參照試劑盒(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光細(xì)胞百分比，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集上清液，PEG法濃縮并純化慢病毒，感染293T細(xì)胞進(jìn)行滴度測定，滴度等于細(xì)胞數(shù)、感染率、稀釋倍數(shù)的乘積，病毒濃縮液按MOI為10感染CD8+T細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基使用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基(IL-2為60 U/mL，IL-7為30 U/mL)，培養(yǎng)5 d后，利用流式細(xì)胞儀檢測CAR的表達(dá)率。

1.6 CAR-T細(xì)胞的體外殺傷活性檢測

ELISA法檢測毒性殺傷上清液中IFN-γ的分泌量：A549細(xì)胞作為陰性對照細(xì)胞，NCL-H1048細(xì)胞作為陽性靶細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)效靶細(xì)胞比為1∶1，每個(gè)反應(yīng)孔各100 μL，細(xì)胞濃度1×106/mL，細(xì)胞板在37 ℃孵育10～20 h，1500 rpm離心4 min，檢測毒性殺傷后上清液中IFN-γ的分泌量，可參照產(chǎn)品使用說明書。

1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。p<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.001表示存在極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建的pETduet-PD-L1(73-739)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1，涂板，挑選pETduet-PD-L1(73-739)單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，目的條帶大小與預(yù)期的一致，因此重組質(zhì)粒pETduet-PD-L1(73-739)構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒的鑒定注：M：DL10000，泳道1：pETduet-PD-L1的雙酶切產(chǎn)物。

2.2 His-PD-L1融合蛋白純化產(chǎn)物的鑒定

收集擴(kuò)大培養(yǎng)的pETduet-PD-L1(73-739)菌體，采用切膠回收的方法純化His-PD-L1融合蛋白，并對回收產(chǎn)物進(jìn)行15% SDS-PAGE凝膠電泳檢測和Western blotting驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，目的條帶與預(yù)期相符。

圖3 PD-L1割膠回收產(chǎn)物鑒定注：圖(a)中電泳凝膠檢測M1：26610 marker，泳道1：割膠回收的蛋白純化產(chǎn)物；圖(b)中鑒定M2：26616 marker，泳道2：蛋白純化產(chǎn)物。

2.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選

免疫后小鼠，分離脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞融合技術(shù)獲得雜交瘤細(xì)胞株，三輪有限稀釋后，共得到五株穩(wěn)定表達(dá)PD-L1單克隆抗體的細(xì)胞株，分別為B10-8、B4-F3、B4-E1、B10-A4、A4-E6。ELISA檢測，結(jié)果如圖4(a)中所示，B10-8與B4-F3相對較高，其他三種也顯示相對較高的水平；圖4(b)是利用高表達(dá)PD-L1的NCL-H1048細(xì)胞株進(jìn)行處理作包被抗原，結(jié)果顯示B10-8與B10-A4兩株細(xì)胞株顯示出較高的水平。綜上所述，選擇細(xì)胞株B10-8進(jìn)行單克隆抗體腹水制備抗體。

圖4 雜交瘤細(xì)胞的篩選

2.4 單克隆抗體的制備與鑒定

將制備的雜交瘤細(xì)胞腹腔注射到小鼠體內(nèi)，一周后獲得腹水，將腹水按1∶200，1∶1000，1∶5000，1∶10000，1∶20000，1∶60000，1∶240000；用PBS等比例稀釋后，測定抗體效價(jià)。結(jié)果如圖5所示，B10-8的效價(jià)可達(dá)到1∶240000。

圖5 PD-L1單克隆抗體的腹水效價(jià)

利用ELISA，檢測雜交瘤細(xì)胞上清液中的抗體亞型，抗體使用羊抗鼠分型二抗，以及1∶5000稀釋的兔抗羊HRP，酶標(biāo)儀測定OD450nm讀數(shù)，結(jié)果如圖6所示。細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體IgG2b亞型，輕鏈為κ鏈，因此確定選用親和層析填料Protein G純化抗體。

圖6 B10-8單克隆抗體的亞型分析

利用原核表達(dá)純化的PD-L1蛋白與篩選得到的單克隆抗體腹水進(jìn)行Western blotting鑒定。樣品與PBS按1∶100稀釋，結(jié)果如圖7所示，純化后的單克隆抗體與PD-L1蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，目的條帶的顯示位置與預(yù)期相符。

圖7 PD-L1單克隆抗體Western blotting鑒定注：M：26616 marker；泳道1：B10-8單克隆抗體純化產(chǎn)物。

2.5 病毒包裝與滴度測定

將慢病毒質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-CAR與PLP1、PLP2、PLP-VSVG四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，培養(yǎng)3 d后，收集細(xì)胞并通過流式細(xì)胞儀測定綠色熒光細(xì)胞百分比，293T細(xì)胞的病毒感染率如圖8所示。從圖8中可以看出，可達(dá)到95.66%(R2區(qū)域所示)，攜帶目的基因的穿梭載體對293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率每板均能達(dá)到90%以上，四質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，滿足慢病毒包裝前提。

收集含有病毒上清液100 mL，經(jīng)PEG8000濃縮后得到病毒濃縮液300 μL，取適量病毒濃縮液，梯度稀釋至10倍、100倍、1000倍、2000倍用于感染293T細(xì)胞，未感染的293T細(xì)胞作為空白對照，用于感染CD8+T細(xì)胞。病毒濃縮液稀釋10倍的感染率為88%，稀釋100倍感染率為75.88%，稀釋1000倍感染率為40.53%，稀釋2000倍感染率為26.45%(圖9)。濃縮后病毒滴度約為5×107TU/mL。

圖8 293T細(xì)胞的病毒感染率

圖9 梯度稀釋病毒濃縮液對293T細(xì)胞的感染率

2.6 慢病毒感染T細(xì)胞CAR的表達(dá)率

選取數(shù)目為0.5×106個(gè)CD8+T細(xì)胞，作為初始細(xì)胞進(jìn)行激活誘導(dǎo)，誘導(dǎo)1～2 d后，加入病毒濃縮液感染，4 d后，測定感染率結(jié)果表明：表達(dá)率達(dá)到22%，隨著T細(xì)胞的不斷擴(kuò)增，培養(yǎng)20 d后，CAR的表達(dá)率僅達(dá)到不足10%，分析原因，可能為未感染病毒T細(xì)胞擴(kuò)增速度較快，CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增速度相對將慢，因此表達(dá)率有所降低。感染20 d后，對照組細(xì)胞擴(kuò)增近50倍，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞擴(kuò)增不足40倍，原因可能是在加入病毒感染后，病毒以及病毒液中混著的蛋白雜質(zhì)對T細(xì)胞的有影響，且在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，尤其在病毒感染4 d后，換液處理時(shí)觀察到CAR-T實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞有不同程度細(xì)胞死亡裂解存在。

圖10 CAR的表達(dá)率

2.7 CAR-T細(xì)胞體外毒性檢測

通過ELISA檢測效靶細(xì)胞上清液的IFN-γ的分泌量，分泌量越大，證明CAR-T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞作用越明顯。IFN-γ的分泌量如圖11所示，從圖中可以看出，在各組效靶細(xì)胞的殺傷過程中釋放的IFN-γ量有著很大的差距，其中以CAR-T細(xì)胞對NCL-H1048細(xì)胞的殺傷中分泌的IFN-γ量最大，證明殺傷力最強(qiáng)；CAR-T對A549細(xì)胞顯示一定殺傷活性，而T細(xì)胞對于兩種靶細(xì)胞顯示極微弱的殺傷活性，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，兩者的殺傷活性差異極其顯著。

圖11 IFN-γ的分泌量注：***，p<0.001。

3 討 論

在腫瘤的免疫治療中，解決腫瘤微環(huán)境免疫抑制的難題也越來越引起關(guān)注，目前，阻斷PD-1/PD-L1途徑的療法已成為重要的手段，并取得一定的進(jìn)展，PD-L1單克隆抗體在臨床試驗(yàn)中治療效果明顯，在NSCLC的治療中表現(xiàn)出良好的耐受性，對PD-L1陽性病患治療效果更顯著[21,26]。經(jīng)大量研究和臨床數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)階段，PD-L1仍為PD-1/PD-L1通路阻斷劑類藥物最有前景的生物標(biāo)志物之一。本文制備了PD-L1單克隆抗體，制備單克隆抗體的抗原選擇多樣，本文利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PD-L1蛋白作為免疫原，為提高融合蛋白的水溶性及表達(dá)量，促進(jìn)靶蛋白正確折疊等，在表達(dá)載體pETduet上插入了SUMO標(biāo)簽[27-28]，獲得質(zhì)量相對高的PD-L1蛋白。免疫小鼠后，利用細(xì)胞融合技術(shù)，融合小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，經(jīng)克隆、篩選獲得1株持續(xù)、穩(wěn)定分泌特異性抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株B10-8，腹水純化抗體效價(jià)達(dá)1∶240000，亞型分析屬IgG2b，輕鏈為κ鏈，并證實(shí)單克隆抗體與高表達(dá)PD-L1蛋白的肺癌細(xì)胞NCL-H1048有較強(qiáng)的親和力。然而，隨著臨床應(yīng)用的發(fā)展，鼠源單抗用于人體治療容易被人類免疫系統(tǒng)所識別，產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)[29]，因此，本文將單克隆抗體的基因片段在保留對特異抗原表位高親和力的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了人源化的改造，減少異源抗體的免疫原性，有效解決傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)所存在的問題。

隨著免疫治療策略的推進(jìn)，大量研究表明，聯(lián)合療法策略的開展為機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)獲得更好的療效[30-32]。本文將PD-L1單克隆抗體免疫檢查點(diǎn)抑制劑技術(shù)與CAR-T療法結(jié)合，應(yīng)用于肺癌的治療，構(gòu)建了PD-L1特異性的CAR基因，以CAR修飾T細(xì)胞增強(qiáng)了T細(xì)胞的靶向性、殺傷性和持久性。該基因中包含CD28和CD137共刺激因子結(jié)構(gòu)域，在腫瘤微環(huán)境中，激活T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，CD28可以使T細(xì)胞產(chǎn)生耐受，CD137可有效增強(qiáng)T細(xì)胞的繁殖，進(jìn)一步提高T細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞毒性和存活時(shí)間等[7,33]。CAR-T細(xì)胞的制備過程中，需要將抗體序列及T細(xì)胞受體信號途徑的編碼分子相關(guān)的序列導(dǎo)入至T細(xì)胞中，目前用于臨床試驗(yàn)導(dǎo)入外源基因的方式大致有逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、mRNA電轉(zhuǎn)入等方式。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的主要是分裂期細(xì)胞，對于非分裂細(xì)胞感染能力極弱。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出的慢病毒，則對分裂和非分裂細(xì)胞均具有較好的感染能力，采用傳統(tǒng)直接轉(zhuǎn)染的方式難以將外源基因?qū)胫罷淋巴細(xì)胞中，因此絕大部分CAR-T細(xì)胞制備時(shí)，采用的慢病毒系統(tǒng)[34]。本文選用慢病毒質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到95.66%，轉(zhuǎn)染效率很高。包裝后獲得慢病毒，感染T細(xì)胞效率達(dá)到22%，感染效率較低，在以后的研究中，應(yīng)對此改進(jìn)，提高CAR靶點(diǎn)的密度。CD8+T細(xì)胞，主要分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫功能，使T細(xì)胞分化成細(xì)胞毒性的T細(xì)胞，經(jīng)過ELISA檢測效靶細(xì)胞上清液的IFN-γ的分泌量，結(jié)果顯示CAR-T細(xì)胞對NCL-H1048細(xì)胞殺傷活性最強(qiáng)，與對照組相比，殺傷作用明顯，進(jìn)而說明，PD-L1特異性的CAR-T細(xì)胞對PD-L1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷力。

CAR-T療法是當(dāng)前過繼性淋巴細(xì)胞回輸治療最新的免疫技術(shù)，該技術(shù)受到廣泛的關(guān)注和研究，并從基礎(chǔ)免疫研究發(fā)展為臨床應(yīng)用，有望成為徹底治愈癌癥的免疫新療法。本文選擇PD-L1作為CAR-T細(xì)胞靶點(diǎn)可能會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，因?yàn)镻D-L1雖在腫瘤組織上高表達(dá)，但在一些正常組織上也有表達(dá)，存在T細(xì)胞在體內(nèi)攻擊正常組織的憂患。但隨著CAR-T研究的深入和技術(shù)的改進(jìn)，比如控制回輸CAR-T細(xì)胞的數(shù)量，引進(jìn)自殺基因，或在PD-L1CAR基因上引進(jìn)另一種腫瘤抗原基因形成特異性更強(qiáng)、無脫靶效應(yīng)的雙頭CAR-T等[35-36]，PD-L1 CAR-T細(xì)胞可能的副作用可以被控制或減少。本文制備PD-L1特異性的CAR-T細(xì)胞，可有效識別并殺傷肺癌細(xì)胞，為CAR-T細(xì)胞療法提供了很好的細(xì)胞模型，但尚需進(jìn)一步在動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證，為腫瘤的治療提供一種更有效的CAR-T細(xì)胞。

4 結(jié) 論

本文首先制備PD-L1單克隆抗體，運(yùn)用基因改造技術(shù)合成PD-L1特異性的第三代CAR基因，并制備PD-L1特異性的CAR-T細(xì)胞。PD-L1靶向的腫瘤細(xì)胞殺傷作用分析顯示，該CAR-T細(xì)胞能夠有效地識別并殺傷表達(dá)PD-L1蛋白的NCL-H1048肺癌細(xì)胞，為下一步構(gòu)建肺癌實(shí)體瘤小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)殺傷實(shí)驗(yàn)奠定研究基礎(chǔ)。

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ConstructionofPD-L1CARGeneandResearchofFunctionalActivityofCART-Cells

BAIJinga,b,ZHANGJiewena,b,SHIWeixinga,CHENJiana,b,LüZhengbinga,b

(a.College of Life Science; b.Key Laboratory of Silkworm Bioreactor and Biomedicine of Zhejiang Province, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

In view of that great breakthrough has made in clinical experiment of applying Chimeric antigen receptor T cells (CAR-T) therapy, programmed death ligand-1 (PD-L1) specific CAR-T cells were designed to realize killing lung cancer cells in vitro. PD-L1 monoclonal antibody was obtained by cloning and expression ofPD-L1(73-739)and purifying PD-L1 protein with immune BALA/c mice; the variable region fragmentation of PD-L1 monoclonal antibody was cloned, fused with genes ofCD28, 4-1BBandCD3-ζchains to construct the third generation ofCARgene, and cloned onto lentiviral vector pCDH-CMV-EF1-copGFP to package as lentivirus. The lentivirus was infected with CD8+T cells, amplified for 5 days, and determined CAR expression (the expression rate can reach up to 22%). The analysis of the function of PD-L1 target of killing tumor cells showed that anti-PD-L1 CAR-T cells are of certain in vitro cytotoxicity.

lung cancer； PD-L1； CAR； monoclonal antibody； adoptive cell therapy

10.3969/j.issn.1673-3851.2017.11.023

2017-03-03 網(wǎng)絡(luò)出版日期： 2017-10-10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012ZX09102301-009)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(13H090015)

白 靜(1990-)，女，河北滄州人，碩士研究生，主要從事細(xì)胞免疫療法方面的研究。

呂正兵，E-mail：zhengbingl@126.com

Q28

A

1673- 3851 (2017) 06- 0901- 08

(責(zé)任編輯：唐志榮)