李占巍　鄭杰　劉斐

【摘要】 目的 研究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及其受體在卵巢癌形成和轉(zhuǎn)化過(guò)程中的表達(dá)特點(diǎn)與卵巢癌的臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系。方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)39例卵巢癌及28例正常卵巢組織（正常對(duì)照）中VEGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1（VEGFR1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）的mRNA表達(dá)的差異及臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果 卵巢癌中VEGF、VEGFR1、VEGFR2的mRNA表述明顯高于正常卵巢組織， VEGF的mRNA表達(dá)差別倍數(shù)2-△△CT=1.34， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）；VEGFR1的mRNA表達(dá)差別倍數(shù)2-△△CT=3.11， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.01）；VEGFR2的mRNA表達(dá)差別倍數(shù)2-△△CT=2.34， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

結(jié)論 VEGF、VEGFR1、VEGFR2的mRNA在卵巢癌組織中表達(dá)明顯增高， 提示VEGF及其受體可能與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 卵巢癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.30.024

卵巢癌死亡率高， 嚴(yán)重威脅了婦女健康。由于無(wú)限制細(xì)胞增殖特性， 惡性腫瘤對(duì)于能量的需求是普通細(xì)胞的很多倍， 需要完善的供氧、供血體系， 血管的發(fā)生、成熟程度對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的重要性不言而喻。其中在血管發(fā)育構(gòu)成中， 受體酪氨酸激酶調(diào)控其生長(zhǎng)、移植分化過(guò)程。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）及其受體的研究在眾多影響腫瘤血管生成的因子中最受人們的關(guān)注。VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞激活其受體從而促進(jìn)血管和淋巴管網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)展[1]。VEGF是通過(guò)其特異性受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）介導(dǎo)， 發(fā)揮其促進(jìn)新血管生成和提高血管通透性的生物學(xué)效應(yīng)， 繼而在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生[2]。本文旨在通過(guò)對(duì)正常人卵巢組織和卵巢癌組織中VEGF和VEGF表達(dá)特點(diǎn)的檢測(cè)， 進(jìn)一步闡述腫瘤微血管生成機(jī)制與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的

關(guān)系。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料 組織材料選取2014年12月～2016年12月遼陽(yáng)市第五人民醫(yī)院手術(shù)切除并未經(jīng)治療且病理和臨床資料完整的卵巢癌組織標(biāo)本39例， 28例正常卵巢組織（正常對(duì)照）。將采集好的樣本放入液氮速凍， 之后再轉(zhuǎn)入-70℃冰箱待用。所有診斷均經(jīng)病理檢查證實(shí)。

1. 2 試劑 總RNA抽提試劑TRIZOL 美國(guó)Invitrogen公司（生產(chǎn)批號(hào)：15596-026）；RNAiso Plus Kit寶生物工程（大連）有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：BK3303）；PrimeScript RT reagent Kit寶生物工程（大連）有限公司（批號(hào)：BK503）；SYBR Premix Ex Taq II Kit 寶生物工程（大連）有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：BK402）；qRT-PCR儀德國(guó)JUIPITER儀器設(shè)備有限公司。

1. 3 研究方法 采用Trizol試劑盒提取癌組織以及癌旁組織總RNA， 反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA第一鏈合成， 利用按SYAR Drallex Bx CapⅡ試劑盒操作說(shuō)明書制備qRT-PCR， 采用FOLD CHANGE方法對(duì)qRT-PCR的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)以美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中基因?yàn)槟０鍋?lái)設(shè)計(jì)所需用到的基因引物及內(nèi)參基因， 運(yùn)用QIUKE GENE設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)篩選而成。PCR引物及堿基序列：VEGF正向引物， 5'-CTCGCGGCTCTCCTCCATCTGT-3'， 反向引物：5'-TTGGCCTGCATTCACACTTGGTG-3'；VEGFR1正向引物：5'-AGATAGCCAGCGGCCTTTTGTGA-3'， 反向引物：5'-TGGCGGATCCATTAGCCTTCTG-3'；VEGFR2正向引物：5'-CAGGCGAATACCGCTGCTTCTAT-3'， 反向引物：5'-CGCGGTGCAGTTGAGTATGAGTC-3'。PCR反應(yīng)條件如下：95℃， 30 s， 預(yù)變性40個(gè)循環(huán)；95℃， 5 s， 變性；55℃， 30 s， 退火；72℃， 30 s， 充分延伸， 采集熒光。β-actin 為內(nèi)參。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用 Depression2.1軟件進(jìn)行計(jì)算， 計(jì)算方法為2-△△CT法， 其中將對(duì)照組的2-△△CT 數(shù)值設(shè)為1。通過(guò)SPSS18.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析， P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 卵巢癌臨床特征 診斷時(shí)年齡36～75歲， 平均年齡61.28歲；家族史12例；腹水8例；周圍組織浸潤(rùn)24例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。漿液性囊腺癌19例， 粘液性囊腺癌10例， 子宮內(nèi)膜樣癌8例， 其他類型2例。卵巢癌組織分為三組：低分化（12例）、中分化（17例）、高分化（10例）， 按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)（FIGO）分為4期， Ⅰ期3例， Ⅱ期6例， Ⅲ期22例， Ⅳ期8例。

2. 2 VEGF基因、VEGFR1基因和VEGFR2基因表達(dá)情況的測(cè)定 qRT-PCR擴(kuò)增曲線均形態(tài)平滑， 復(fù)孔間平行性均好， 融解曲線均是單峰， 組間重復(fù)性均好。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)：與正常對(duì)照組織相比， VEGF的mRNA表達(dá)差別倍數(shù)2-△△CT=1.34， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）， 表明卵巢癌組織較正常組織VEGF基因表達(dá)水平發(fā)生了明顯上升；VEGFR1的mRNA表達(dá)差別倍數(shù)2-△△CT=3.11， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）， 表明卵巢癌組織較正常組織VEGFR1基因表達(dá)水平發(fā)生了非常顯著的增高；VEGFR2的mRNA表達(dá)差別倍數(shù)2-△△CT=2.34， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）， 表明卵巢癌組織較正常組織VEGFR2基因表達(dá)水平發(fā)生了非常顯著的增高。endprint

3 討論

實(shí)體瘤快速增長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移離不開血管生成， VEGF信號(hào)通路在血管的生成、功能完善、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的不同階段， 不同表達(dá)程度的VEGF受體及配體也都扮演著各自重要的角色。VEGF的生物學(xué)特性主要分為以下幾點(diǎn)：①引導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂并啟動(dòng)體內(nèi)形成血管；②具備明顯的腔化作用和增加血管通透性之作用；③有利于產(chǎn)生更多便于血管形成的組織因子；④具備免疫抑制作用[3]。VEGF特異性識(shí)別并結(jié)合VEGFR1后， 由于VEGFR1并不具有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域， 所以它缺乏細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能， 因而竟?fàn)幮缘匾种芕EGF的誘導(dǎo)形成新生血管[4]。近年來(lái)大量的研究表明， VEGF造成的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、通透性以及存活等相關(guān)生理或病理生理的改變， 主要是通過(guò)特異性識(shí)別VEGFR2來(lái)實(shí)現(xiàn)的[5]。VEGFR2介導(dǎo)的最主要信號(hào)通路是PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK， 經(jīng)此通路該通路可將信號(hào)有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)， 增強(qiáng)了相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞增殖[6-8]。

本研究通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)卵巢癌組織和正常卵巢組織中VEGF和VEGFR表達(dá)， 發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的mRNA表達(dá)量明顯高于正常卵巢組織， 這一結(jié)果表明VEGF在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要作用， 深入研究VEGF和VEGFR的生物學(xué)特性， 有助于加深腫瘤微血管生成的分子機(jī)制及其發(fā)生發(fā)展的了解， 從而有助于人們?cè)诼殉舶┑脑\斷治療和預(yù)后判斷方面尋找新的途徑[9-11]。尤其是以此發(fā)現(xiàn)一種新型有效卵巢癌治療的方法， 即通過(guò)在抑制腫瘤血管生成的抗VEGF抗體、VEGF拮抗劑、反義VEGF血管生成抑制物的使用上取得突出的進(jìn)展。

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[收稿日期：2017-08-04]endprint