龍曉琴，唐 杰，趙景芳，曾凡坤*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

紅油椿老葉中黃酮的酶法-超聲波提取及HPLC測定

龍曉琴，唐 杰，趙景芳，曾凡坤*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

為研究酶法-超聲波輔助提取紅油椿老葉總黃酮工藝參數(shù)，以總黃酮得率為指標(biāo)，經(jīng)單因素試驗篩選出影響總黃酮得率的4 個因素：酶添加量、pH值、超聲溫度、料液比，并采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取工藝條件，并建立紅油椿老葉中黃酮的高效液相色譜測定方法。結(jié)果表明，紅油椿老葉總黃酮提取最佳工藝為纖維素酶添加量0.6%、pH 4.6、45 ℃酶解120 m in，再經(jīng)60%乙醇溶液、料液比1∶25（g/m L），超聲功率140 W、超聲溫度62 ℃條件下提取40 min，連續(xù)提取2 次，紅油椿老葉總黃酮得率為14.98%。與酶法提取相比，酶法聯(lián)合超聲波法提取明顯提高了總黃酮得率。高效液相色譜法測定結(jié)果表明，紅油椿老葉總黃酮粗提物中含有蘆丁、槲皮素和山柰酚，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.16%、0.06%、0.03%。

紅油椿葉；響應(yīng)面；總黃酮；高效液相色譜法

香椿（Toona sinensis）又名椿芽樹、椿、椿樹，分為紫香椿和綠香椿兩大類，紅油椿則屬于紫香椿類。香椿是我國特有樹種，原產(chǎn)于我國中部地區(qū)，至今已有2 000多年的栽培歷史?，F(xiàn)今，廣泛分布于華北至華南和西南各省[1]，香椿嫩芽因其具有獨特的香氣和含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，備受人們青睞。因此，香椿樹的栽種面積從房前屋后的一兩棵，擴(kuò)展到田邊種植或成片規(guī)?；南愦涣?。但香椿芽生產(chǎn)期短，僅限于春季，采收期約2 個月，而香椿老葉作為香椿產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物，卻沒有得到很好地利用，大部分被遺棄成為枯葉[2]。近幾年來，對香椿的活性成分研究較多，文獻(xiàn)記載，香椿中主要活性成分為黃酮類化合物[3]，是廣泛存在于植物中的一類重要的天然有機(jī)化合物[4]，其具有降血脂、保護(hù)心肌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等多種藥理作用[5-9]。目前香椿葉黃酮提取方法有超聲波法、微波法、酶法、超臨界二氧化碳法等，其中酶法有反應(yīng)溫和、工藝簡單、對樣品破壞小等優(yōu)點[10-11]；超聲波法借助超聲波的空化作用加快目標(biāo)提取物溶出[12-13]。本實驗結(jié)合酶法和超聲波提取技術(shù)的優(yōu)點，研究提取過程中各因素對紅油椿老葉中黃酮得率的影響，采用Box-Behnken試驗設(shè)計，通過響應(yīng)面優(yōu)化，并用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析其黃酮單體成分含量，為香椿老葉在食品工業(yè)中的綜合利用、活性成分的深入分析及黃酮類化合物的工業(yè)化提取利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紅油椿老葉，2016年9月采摘于重慶江津區(qū)永興鎮(zhèn)，洗凈，烘房30 ℃烘干備用；蘆丁、山柰酚（標(biāo)準(zhǔn)品）中國食品藥品檢定研究院；槲皮素（標(biāo)準(zhǔn)品） 美國Chrom adex公司；纖維素酶（40 000 U/g）、果膠酶（30 000 U/g） 上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水醋酸鈉、冰醋酸（均為分析純），磷酸、甲醇（均為色譜純） 成都市科龍化工試劑廠。

FA2004A分析天平 上海精天電子儀器有限公司；FW 177中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；XH-C旋渦混合器 金壇市白塔新寶儀器廠；HWS 26電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV 1000紫外-可見分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LC-20A高校液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照李秀信等[14]的NaNO2-A l(NO3)3法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：Y=10.997X+0.012 8，R2=0.999 3。

1.2.2 紅油椿老葉總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取2.0 g紅油椿葉粉，于乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中與酶作用一段時間后，沸水滅酶30 s，加入乙醇，在設(shè)定的超聲條件下提取，抽濾，定容100 m L，得提取液。

1.2.3 紅油椿老葉總黃酮得率的計算

用相應(yīng)提取溶劑適當(dāng)稀釋提取液，準(zhǔn)確吸取2 m L稀釋液于10 m L刻度試管，按1.2.1節(jié)方法顯色，測定吸光度，按下式計算總黃酮得率。

式中：C為稀釋溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度/（g/L）；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積/L；m為紅油椿葉粉質(zhì)量/g；W為紅油椿葉粉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

1.2.4 紅油椿老葉粉碎時間的確定

將預(yù)先干燥的紅油椿葉放滿粉碎機(jī)容器，分別粉碎5、15、25、35、50 s，篩分法計算平均粒徑的范圍，取2.0 g于100 m L錐形瓶，加入料液比1∶20（g/m L）的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液，60 ℃水浴提取2 h。

1.2.5 酶種類的確定

選用纖維素酶（Ⅰ）、果膠酶（Ⅱ）及3 種復(fù)合酶（Ⅰ、Ⅱ質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、2∶1），研究不同組成的酶對紅油椿老葉總黃酮得率的影響，紅油椿葉粉在酶添加量0.6%、酶解時間120 m in、pH 5.0、酶解溫度45 ℃、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30（g/m L）條件下水浴提取1.5 h。

1.2.6 酶法-超聲波提取紅油椿老葉總黃酮得率的單因素試驗

分別考察纖維素酶添加量：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.3%、0.6%、1.0%、2.0%、3.0%；pH值：3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8；酶解溫度：30、35、40、45、50、55 ℃；酶解時間：30、60、90、120、150、180 m in；料液比：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40（g/m L）；乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)：40%、50%、60%、79%、80%；超聲溫度：40、50、60、70、80 ℃；超聲功率：100、120、140、160、180、200 W；超聲時間：10、20、30、40、50 m in。按提取方法，分別進(jìn)行單因素試驗。

1.2.7 酶法-超聲波提取紅油椿老葉總黃酮得率的響應(yīng)面試驗

對單因素試驗中的9 個因素進(jìn)行方差分析，得出酶添加量、pH值、超聲溫度、料液比對總黃酮得率有極顯著影響，其他因素?zé)o顯著性影響。為了優(yōu)化酶法-超聲波提取紅油椿老葉總黃酮提取工藝，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理[15-16]，以4 個極顯著影響因素作為變量，總黃酮得率作為響應(yīng)值，設(shè)計了四因素三水平響應(yīng)面試驗，見表1。

1.2.8 紅油椿老葉黃酮的HPLC分析

準(zhǔn)確稱取蘆丁、槲皮素、山柰酚各0.005 0 g，用甲醇分別定容于10 m L容量瓶中，0.45 μm濾膜過濾備用，用于確定各自的出峰時間。再準(zhǔn)確稱取各標(biāo)品0.005 0 g，用甲醇定容于10 m L容量瓶中，制得混合儲備液，甲醇稀釋儲備液制成不同質(zhì)量濃度梯度，0.45 μm濾膜過濾備用，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。用優(yōu)化后的方法提取紅油椿總黃酮，得提取液，蒸發(fā)后干燥至恒質(zhì)量得到粗提物，精密稱取0.05 g，甲醇溶解后定容10 m L，0.45 μm濾膜過濾備用[17]。

H PLC條件：色譜柱：C h rom p lu s TM C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸（60∶40，V/V）；柱溫30 ℃；檢測波長368 nm；流速1.0 m L/m in；進(jìn)樣量10 μL。重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.1軟件處理單因素數(shù)據(jù)和作圖，SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Tab le 1 Code and level of independent variables used in Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 紅油椿老葉粉碎時間的確定

表2 粉碎時間對平均粒徑范圍及總黃酮得率的影響Table 2 Effect of comm inution time on average particle size and total flavonoids yield

由表2可以看出，隨著粉碎時間的延長，粉體粒徑減小，黃酮得率先增加后減小，在粉碎時間為25 s時總黃酮得率最大。故選擇粉碎時間為25 s。

2.2 酶種類的確定

如圖1所示，經(jīng)纖維素酶（Ⅰ）和果膠酶（Ⅱ）酶解后，總黃酮得率都大于無酶組，且纖維素酶效果優(yōu)于果膠酶，而復(fù)合酶解總黃酮得率介于等質(zhì)量的纖維素酶和果膠酶之間，表明2 種酶無明顯協(xié)同作用，這與陳叢瑾[18]研究結(jié)論相同。因此，選擇單一纖維素酶。

圖1 酶種類對總黃酮得率的影響Fig. 1 Effect of enzyme type on total fl avonoid yield

2.3 酶法-超聲波提取紅油椿老葉總黃酮的單因素試驗結(jié)果

2.3.1 酶添加量對紅油椿老葉總黃酮得率的影響

圖2 酶添加量對總黃酮得率的影響Fig. 2 Effect of enzyme dosage on total flavonoid yield

如圖2所示，在酶添加量為1.0%時有最大得率。Acedo等[19]發(fā)現(xiàn)纖維素酶能破壞細(xì)胞壁，有助于總黃酮的溶出，但隨著添加量的增加，酶解的同時一部分纖維附著在顆粒表面，阻礙黃酮的部分溶出通道，使得率降低，故添加1%的纖維素酶效果較好。

2.3.2 pH值對紅油椿老葉總黃酮得率的影響

圖3 pH值對總黃酮得率的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis pH on total flavonoid yield

如圖3所示，當(dāng)pH 4.2時，總黃酮得率最高，之后得率明顯降低?？赡苡捎趐H值既對酶的構(gòu)象有影響，也對底物的解離狀態(tài)有影響，當(dāng)pH 4.2時，纖維素酶活力最大，提取效率最高[20]。

2.3.3 酶解溫度對紅油椿老葉總黃酮得率的影響

圖4 酶解溫度對總黃酮得率的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis temperatures on total flavonoid yield

酶在合適的溫度條件下，酶解底物更完全，總黃酮得率更高，由圖4可以看出，總黃酮得率在酶解溫度為45 ℃時最高，即45 ℃為較佳酶解溫度。

2.3.4 酶解時間對紅油椿老葉總黃酮得率的影響

圖5 酶解時間對總黃酮得率的影響Fig. 5 Effect of hydrolysis time on total fl avonoid yield

如圖5所示，隨酶解時間的延長得率增加，酶解120 m in時有最大黃酮得率，再繼續(xù)酶解使得率略有降低。石會軍等[21]利用酶法提取銀杏葉黃酮，酶解2 次，酶解時間為60 m in時有最大提取率，與本實驗結(jié)論相符。

2.3.5 料液比對紅油椿老葉總黃酮得率的影響

圖6 料液比對總黃酮得率的影響Fig. 6 Effect of solid to liquid ratio on total fl avonoid yield

由圖6可知，并不是料液比越大得率越高，當(dāng)料液比大于1∶25后得率呈顯著降低的趨勢。Li Chunhong等[22]用超聲溶劑提取香椿嫩葉黃酮得出，料液比1∶40最佳。本實驗因協(xié)同了酶法，可能使得乙醇用量在較少情況下也能獲得較佳得率。

2.3.6 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對紅油椿老葉總黃酮得率的影響

圖7 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響Fig. 7 Effect of ethanol concentration on total flavonoid yield

乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)不同，極性不同，從圖7可以看出，隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加總黃酮得率先增加后減少，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%時效果較佳。

2.3.7 超聲溫度對紅油椿老葉總黃酮得率的影響

圖8 超聲溫度對總黃酮得率的影響Fig. 8 Effect of extraction tem perature on total flavonoid yield

如圖8所示，隨著超聲溫度的升高，總黃酮得率增加，超聲溫度超過60 ℃時得率開始降低，故取60 ℃為最佳超聲溫度。

2.3.8 超聲功率對紅油椿老葉總黃酮得率的影響

圖9 超聲功率對總黃酮得率的影響Fig. 9 Effect of u ltrasonic power on total fl avonoid yield

如圖9所示，隨著超聲功率的增加，得率呈先增加后減小的趨勢，可能由于超聲功率小，空化效應(yīng)??；超聲功率大，提取劑流動加快，超聲波停留時間減小，使得率降低[23]。在140 W時得率最大。

2.3.9 超聲時間對紅油椿老葉總黃酮得率的影響

如圖10所示，超聲時間在10～40 min范圍內(nèi)，總黃酮得率隨時間延長而增加，40 min后變化趨于平緩，再延長提取時間將增加成本，故選取超聲時間40 min。

圖10 超聲時間對總黃酮得率的影響Fig. 10 Effect of ultrasonication time on total fl avonoid yield

2.4 酶法-超聲波提取紅油椿老葉總黃酮得率的響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.4.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對影響總黃酮得率顯著的因素（酶添加量、pH值、超聲溫度、料液比）進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗設(shè)計，結(jié)果見表3。以總黃酮得率為響應(yīng)值，建立影響因素和紅油椿老葉總黃酮得率間的數(shù)學(xué)模型[24]：Y1=13.08-0.32A-0.38B+0.24C+0.61D-0.45AB+0.13AC-0.015AD+0.15BC+0.017BD-0.60CD+0.041A2-1.08B2-0.27C2-1.13D2。經(jīng)回歸方程進(jìn)行方差分析見表4，通過比較F值大小可知，4 個因素對總黃酮得率的影響順序為D＞B＞A＞C。

對不顯著項進(jìn)行逐步回歸分析，得到優(yōu)化后的回歸方程為：Y2=13.10-0.32A-0.38B+0.24C+0.61D-0.46AB-0.60CD-1.08B2-0.28C2-1.14D2。通過對優(yōu)化后的回歸方程進(jìn)行方差分析，如表5所示，發(fā)現(xiàn)模型是極顯著的，而失擬項不顯著，表明模型不存在失擬因素，回歸模型各項的方差分析結(jié)果表明，一次項、二次項除A2外對總黃酮得率都有顯著影響，各因素之間的交互作用AB和CD對總黃酮得率影響顯著，R2為0.941 0，表明響應(yīng)值的變化有94.10%來自所選變量，即試驗設(shè)計所得的回歸方程式擬合性好[25-26]。

表4 優(yōu)化方程前的方差分析Table 4 Analysis of variance for unop tim ized regression model

表5 優(yōu)化方程后的方差分析Table 5 Analysis of variance for optim ized regression model

2.4.2 響應(yīng)面分析

從各因素方差分析結(jié)果可知，酶添加量、pH值、超聲溫度、料液比對總黃酮得率影響均為極顯著，如圖11所示，酶添加量與pH值、超聲溫度與料液比的等高線圖均為橢圓，表示交互作用顯著[27-28]。

圖11 交互作用對總黃酮得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 11 Response surface and contour p lots show ing the interactive effects of variab les on total flavonoids yield

2.4.3 驗證實驗結(jié)果

結(jié)合方程與響應(yīng)面圖得到4 個因素最優(yōu)參數(shù)為酶添加量0.6%、pH 4.61、超聲溫度62.04 ℃、料液比1∶26.07（g/m L），得到的總黃酮得率預(yù)測值為13.51%，為方便實驗進(jìn)行，取各因素值分別為酶添加量0.6%、pH 4.6、超聲溫度62 ℃、料液比1∶25（g/m L），重復(fù)3 次，進(jìn)行驗證實驗，總黃酮得率實際測得值為13.68%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.59%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有參考價值。

2.4.4 提取次數(shù)

取0.5 g紅油椿葉粉，按上述優(yōu)化條件連續(xù)提取4 次，分別測定吸光度，依次是1.42、0.139、0.059、0.021，第1次提取所占百分比為87.12%，前2 次提取總和所占百分比為95.64%，說明已經(jīng)提取出大部分總黃酮，故實驗確定提取次數(shù)為2 次。連續(xù)提取2 次，紅油椿老葉總黃酮得率為14.98%

2.4.5 與酶法提取比較

為了驗證超聲波聯(lián)合酶法提取的有效性，分別進(jìn)行酶法提取和超聲波聯(lián)合酶法提取，前者得率為11.56%，后者得率為12.98%，兩者差異顯著，說明超聲波聯(lián)合酶法提取紅油椿老葉總黃酮的效果明顯優(yōu)于酶法提取。

2.5 紅油椿老葉黃酮的HPLC檢測

根據(jù)蘆丁、槲皮素和山柰酚各自的標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC圖可知，蘆丁出峰時間4.648 m in，槲皮素出峰時間8.989 min，山柰酚出峰時間為14.160 m in，通過保留時間進(jìn)行定性，如圖12A所示，各峰依次為蘆丁、槲皮素和山柰酚。結(jié)合圖12A，對圖12B分析，可推斷紅油椿老葉總黃酮粗提物中含有蘆丁、槲皮素和山柰酚成分[29-30]。

圖12 混合對照品（A）和紅油椿老葉總黃酮樣品液（B）的HPLC圖譜Fig. 12 HPLC chromatogram of m ixed standards (A) and total flavonoids (B) from Toon sinensis

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，蘆丁質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程為Y＝27 338X-3 576.4，R2＝0.996 5，得到紅油椿老葉總黃酮粗提物中蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.16%；槲皮素質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程為Y＝63 611X-14 361，R2＝0.997 8，槲皮素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%；山柰酚質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程為Y＝71 778X-13 648，R2＝0.997 6，山柰酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%。

3 結(jié) 論

本實驗選用纖維素酶法聯(lián)合超聲波提取紅油椿老葉總黃酮，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后得到的最佳工藝為纖維素酶添加量0.6%、pH 4.6、45 ℃酶解120 m in，再經(jīng)60%乙醇溶液、料液比1∶25（g/m L），超聲功率140 W、62 ℃溫度條件下超聲波提取40 m in，連續(xù)提取2 次，紅油椿老葉總黃酮得率為14.98%。與酶法提取相比，酶法聯(lián)合超聲波提取總黃酮效率更好，得率明顯提高。

紅油椿老葉總黃酮粗提物的HPLC分析結(jié)果表明，含有蘆丁、槲皮素、山柰酚，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.16%、0.06%、0.03%，紅油椿中其他黃酮單體還有待進(jìn)一步研究。

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Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction and HPLC Analysis of Flavonoids from Old Leaves of Toona sinensis

LONG Xiaoqin, TANG Jie, ZHAO Jingfang, ZENG Fankun*
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The present study aimed to optim ize the process parameters for the ultrasonic-assisted enzymatic extraction of total flavonoids from old leaves of Toona sinensis. Using one-factor-at-a-time method, enzyme dosage, pH, temperature, and solid to liquid ratio were identified as important factors affecting the total flavonoid yield. These factors were by response surface methodology. An HPLC method to determine total flavoids in T. sinensis was established. The results showed that the optimum conditions were as follows: hydrolysis w ith 0.6% cellulose at pH 4.6 and 45 ℃ for 120 min, followed by two cycles of 40 m in extraction at 62 ℃ w ith 60% ethanol as the extraction solvent at a solid to liquid ratio of 1:25 (g/m L) under 140 W ultrasonic irradiation. Under these conditions, the total flavonoid yield was 14.98%, which was significantly increased compared w ith traditional enzymatic extraction. The results of HPLC showed that the flavonoids extracted contained 0.16%rutin, 0.06% quercetin and 0.03% kaempferol.

leaves of Toona sinensis; response surface methodology; total flavonoids; high performance liquid chromatography (HPLC)

10.7506/spkx1002-6630-201722038

TS209

A

1002-6630（2017）22-0256-07

龍曉琴, 唐杰, 趙景芳, 等. 紅油椿老葉中黃酮的酶法-超聲波提取及HPLC測定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22): 256-262.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722038. http://www.spkx.net.cn

LONG Xiaoqin, TANG Jie, ZHAO Jingfang, et al. Ultrasonic-assisted enzymatic extraction and HPLC analysis of flavonoids from old leaves of Toona sinensis[J]. Food Science, 2017, 38(22): 256-262. (in Chinese w ith English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722038. http://www.spkx.net.cn

2017-01-22

重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心能力提升項目（cstc2014pt-gc8001）

龍曉琴（1993—），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：1966619416@qq.com

*通信作者：曾凡坤（1963—），男，教授，碩士，研究方向為果蔬加工技術(shù)。E-mail： zengfankun@swu.edu.cn