張延杰，王靜雪*，牟海津

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌Virgibacillus sp. P-4的篩選鑒定及其特性分析

張延杰，王靜雪*，牟海津

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

利用酪蛋白瓊脂平板從傳統(tǒng)蝦醬中分離嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌，經(jīng)形態(tài)學、生理生化和分子生物學鑒定，確定該菌隸屬于枝芽孢桿菌屬Virgibacillus sp. P-4，并用此菌為后續(xù)研究菌株。結(jié)果表明，該菌最適生長溫度為30～37 ℃，最適生長NaCl質(zhì)量分數(shù)為5%～15%；所產(chǎn)胞外蛋白酶在20～50 ℃條件下酶活力較高且保持穩(wěn)定，最適反應溫度為40 ℃，當NaCl質(zhì)量分數(shù)為15%時酶活力達到最高，并且所產(chǎn)胞外蛋白酶種類可能不只一種，但不包含巰基蛋白酶；通過分析酶解液中游離氨基酸釋放速率，預測其酶切位點為Phe-、Tyr-、Lys-、His-、Pro-及Leu-。

蛋白酶產(chǎn)生菌；嗜鹽菌；蝦醬；性質(zhì)

傳統(tǒng)蝦醬是以蝦為原料，在高鹽條件下，經(jīng)自然發(fā)酵而成的一種風味獨特的黏稠狀紫紅色調(diào)味料，富含不飽和脂肪酸以及游離氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，深受我國以及東南亞各國人民的喜愛[1]。然而目前我國蝦醬產(chǎn)業(yè)存在發(fā)酵周期長、鹽度過高（30%～35%）等問題，制約了其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展[2]。許多學者嘗試通過減少鹽用量和降低pH值[3]、提高發(fā)酵溫度[4]、外加蛋白酶[5]等加速蛋白質(zhì)降解的方式來縮短發(fā)酵周期。但是這些方法也存在缺陷，如低鹽會促進致病菌的滋生，高溫則會使必要的蛋白酶變性并且還會增加投資成本，外加酶發(fā)酵的產(chǎn)品風味不及自然發(fā)酵[6]。

近年來，以微生物為啟動子，通過純培養(yǎng)的方式來發(fā)酵水產(chǎn)品，受到越來越多學者的關(guān)注，這種方式對提高加工速率、穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量、改善產(chǎn)品感官品質(zhì)以及縮短發(fā)酵周期等方面都有積極作用[7]，Speranza等[8]利用3 株片球菌（Pediococcus）在實驗室條件下發(fā)酵魚露，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種發(fā)酵方式不僅可以縮短發(fā)酵時間，并且還能夠改善產(chǎn)品質(zhì)量。自然發(fā)酵方式不受人為控制，產(chǎn)品質(zhì)量總是參差不齊，選擇合適的嗜鹽菌作為啟動子，優(yōu)化和控制發(fā)酵過程，就成為研究熱點。段杉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，蝦醬在發(fā)酵過程中內(nèi)源性蛋白酶活力不斷降低，細菌蛋白酶活力逐漸增加，細菌蛋白酶對發(fā)酵風味的形成有極大貢獻。呂欣然等[10]研究表明，蝦醬中產(chǎn)蛋白酶的嗜鹽性葡萄球菌和枝芽孢桿菌是導致蝦醬中蛋白質(zhì)降解的主體微生物類群。鑒于嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌在蝦醬發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用，因此一些學者將目光集中于此，例如，Tanasupaw at等[11]從泰國蝦醬中分離到一株鹽脫氮枝芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans TKNR13-3），它的嗜鹽嗜熱特性將在食品發(fā)酵方面有巨大的應用潛力；連鑫等[12]從傳統(tǒng)蝦醬中分離出一株具有水解蛋白質(zhì)能力的黑曲霉（Aspergillus niger），而霉菌在發(fā)酵食品中往往會產(chǎn)生良好的風味。綜上所述，有針對性地分離嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌，對它的生長特性、酶學性質(zhì)進行研究，這對于將來用其進行蝦醬的標準化生產(chǎn)有重要意義。

本研究主要是通過分離篩選傳統(tǒng)蝦醬中的嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌，并對其特性進行分析，以期為蝦醬的分步發(fā)酵提供優(yōu)良的微生物菌株，最終達到縮短發(fā)酵周期、降低鹽度、穩(wěn)定生產(chǎn)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦醬采購于山東青島。

酪蛋白、瓊脂 北京索萊寶科技有限公司；酵母膏北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；氯化鈉、三氯乙酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基及蛋白酶制劑 北京路橋技術(shù)有限公司；聚合酶鏈式反應中所用試劑均購自上海生物工程技術(shù)有限公司。

酪蛋白液體培養(yǎng)基：酪蛋白10 g/L，酵母膏1 g/L，NaCl 100 g/L，pH 7.2±0.2。

酪蛋白固體培養(yǎng)基：酪蛋白10 g/L，酵母膏1 g/L，NaCl 100 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.2±0.2。

1.2 儀器與設備

HH-1恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；M LS-3750全自動滅菌鍋 日本三洋電子公司；WPG-350隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司；HZQ-F恒溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 菌株的篩選及鑒定

1.3.1 菌株的初篩

稱取1 g蝦醬置于酪蛋白液體培養(yǎng)基中進行多次富集培養(yǎng)，吸取100 μL富集培養(yǎng)液進行梯度稀釋后涂布于酪蛋白固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)6 d，選取菌落周圍有透明圈的菌株進行純化，然后點種于酪蛋白固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)6 d后，在平板上加0.4 mol/L三氯乙酸觀察透明圈的大小。

1.3.2 菌株的復篩

挑取一環(huán)菌株接種于50 m L酪蛋白液體培養(yǎng)基中（250 m L錐形瓶），37 ℃、150 r/m in振蕩培養(yǎng)7 d。吸取1、3、5、7 d的適量培養(yǎng)液進行蛋白酶活力測定。參考GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[13]采用Folin-酚法，利用酶標儀分別測定菌株的酸性、中性、堿性蛋白酶活力。對于酸性、中性、堿性蛋白酶的活力測定需分別使用pH 3.0乳酸-乳酸鈉緩沖液、pH 7.5磷酸鹽緩沖液和pH 10.0硼酸-硼酸鈉緩沖液進行適當稀釋。一般認為，在40 ℃適當pH值條件下，1 m in水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為1 個蛋白酶活力單位。

1.3.3 分子生物學鑒定[14]

挑取一環(huán)單菌落置于500 μL無菌水中，置于95 ℃水浴加熱5 m in后作聚合酶鏈式反應（polymerase chain reac tion，PCR）模板。PCR體系為50 μL，其中：PCR M aster M ix（2×）25 μL，16S Primer Up 1 μL，16S Primer Down 1 μL，模板2 μL，加RNase-Free Water補至50 μL。PCR條件：94 ℃預變性10 m in；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 m in，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 m in。最后將PCR擴增產(chǎn)物交由上海生物工程技術(shù)有限公司測序。將測得的序列登錄EzTaxon數(shù)據(jù)庫進行比對，應用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.4 形態(tài)學及生理生化鑒定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]和《伯杰細菌鑒定手冊》[16]進行形態(tài)學及生理生化鑒定。

1.3.5 生長特性

挑取一環(huán)待測菌株接種于50 m L營養(yǎng)肉湯中，37 ℃、150 r/m in振蕩培養(yǎng)24 h，而后按2%（體積分數(shù)）接種量接種于營養(yǎng)肉湯中，將其分別設置為不同的培養(yǎng)時間（自0 h開始，每隔4 h測定一次）、培養(yǎng)溫度（10、20、30、35、37、45 ℃）、pH值（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5）、NaCl質(zhì)量分數(shù)（0%、5%、10%、15%、20%、25%）的培養(yǎng)基，在適宜溫度振蕩培養(yǎng)48 h后測定OD600nm，每個梯度設置3 個平行。

1.3.6 酶學性質(zhì)測定

1.3.6.1 最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性

取適量經(jīng)緩沖液適當稀釋的粗酶液，將其分別置于20、30、40、50、60、70 ℃條件下測定中性蛋白酶活力，計算相對酶活力。

取經(jīng)緩沖液適當稀釋的粗酶液，分別置于20、30、40、50、60、70 ℃條件下保溫30 m in，待恢復到室溫后在最適反應溫度測定中性蛋白酶活力，計算相對酶活力。

1.3.6.2 NaCl質(zhì)量分數(shù)對酶活力的影響

將待測菌株置于不同質(zhì)量分數(shù)的NaCl（0%、5%、10%、15%、20%）酪蛋白液體培養(yǎng)基中，取適量粗酶液測定中性蛋白酶活力，計算相對酶活力。

1.3.6.3 金屬離子對酶活力的影響

向粗酶液中分別加入A gNO3、A lC l3、CaC l2、COCl2、CuSO4、Fe2(SO4)3、MgSO4、MnSO4和ZnSO4至最終濃度為5 mmol/L，室溫靜置30 m in，在最適條件下測定中性蛋白酶活力，以不加金屬離子的粗酶液作對照酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.3.6.4 抑制劑對酶活力的影響

向粗酶液中分別加入不同的蛋白酶抑制劑：碘乙酰胺（iodoacetam ide，IAM，巰基蛋白酶抑制劑）、乙二胺四乙酸（ethylenediam inetetraacetic acid，EDTA，金屬蛋白酶抑制劑）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF，絲氨酸蛋白酶抑制劑）、胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）使抑制劑濃度達到1 mmol/L，在室溫靜置30 m in，在相同條件下測定中性蛋白酶活力，未經(jīng)處理的粗酶液作對照，酶活力為100%，計算加入抑制劑后的相對酶活力。

1.3.7 酶解特異性分析[17]

向經(jīng)過滅菌處理的100 m L南極磷蝦勻漿液中加入5 m L粗酶液，以不加粗酶液酶解的樣品為空白。在最適溫度條件下，于恒溫振蕩搖床中振蕩酶解1～21 h。酶解結(jié)束后，將酶解產(chǎn)物置于沸水中15 min滅酶，冷卻后8 000 r/min離心30 m in，收集上清液即為酶解液，采用氨基酸自動分析儀測定酶解液中游離氨基酸，同時設置空白對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用軟件Origin 8.5對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選

據(jù)報道，水產(chǎn)品中存在多樣且復雜的微生物群體[18]，在發(fā)酵過程中嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌起著主導作用[19]，它的主要作用是在高鹽環(huán)境下仍具有蛋白酶活力，降解水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)。一般來說，當鹽質(zhì)量分數(shù)范圍1%～10%逐步遞增時，就會明顯影響微生物的生長、發(fā)酵的速率、產(chǎn)品的感官質(zhì)量等。因此，從發(fā)酵水產(chǎn)品中分離出固有的嗜鹽性微生物，可能會擁有更理想的特性，可以重現(xiàn)原產(chǎn)品的風味甚至提高原產(chǎn)品的質(zhì)量[8,20]。

圖1 嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌在酪蛋白平板上的透明圈Fig. 1 Transparent zones around colonies on casein agar p lates

從蝦醬樣品中初篩得到11 株嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌，將這11 株菌在酪蛋白平板上點種培養(yǎng)6 d后，添加0.4 mol/L三氯乙酸，結(jié)果如圖1所示。然后對圖1中這11 株菌進行酸性、中性、堿性蛋白酶活力測定，結(jié)果如圖2所示。綜合以上結(jié)果表明，這11 株菌以產(chǎn)中性蛋白酶為主，尤其以P-4所產(chǎn)中性蛋白酶活力最為突出。此外，P-2雖然在酪蛋白平板上透明圈較小，但是其蛋白酶活力卻比大多數(shù)測定菌株都高，這一結(jié)果表明透明圈的大小并不能十分準確地反映蛋白酶的活力。此外，連鑫等[12]采用與本實驗相同的篩選方法，在中性酪蛋白瓊脂平板上篩選到一株黑曲霉，采用Folin-酚法測定其蛋白酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這株黑曲霉的酸性蛋白酶活力最高。

圖2 11 株嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌酶活力Fig. 2 Protease activities of 11 selected isolates

2.2 基于16S rDNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序結(jié)果與Ez Taxon數(shù)據(jù)庫（h ttp://w w w.ezbiocloud.net/）進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P-4與模式菌株V. halodenitrificans DSM 10037T具有最大相似度，可達99.39%。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，如圖3所示，P-4與V. ha lodenitrificans DSM 10037T最接近，隸屬于同一分支，因此，初步確定P-4屬于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）。為進一步比較分析P-4與枝芽孢桿菌屬已知種相互之間的差異，需要對其進行形態(tài)學及生理生化特征的鑒定。

圖3 嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌P-4的建樹結(jié)果Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree for strain P-4 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 表型鑒定

圖4 嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌P-4的透射電鏡照片（×25 000）Fig. 4 Transm ission electron m icrographs of strain P-4 (× 25 000)

將菌株P(guān)-4分別接種在NA平板上觀察菌落形態(tài)，用顯微鏡觀察細胞形態(tài)及染色特征。P-4在NA平板上長出的菌落為圓形，乳白色，表面光滑不透明，革蘭氏染色可變，菌體呈桿狀，周生鞭毛。圖4即為P-4在NA平板上培養(yǎng)3 d后的透射電鏡照片。

經(jīng)過16S rDNA鑒定之后，認定P-4隸屬于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）。以不產(chǎn)生色素、能降解酪蛋白為標準，目前為止符合上述標準，可供選取的枝芽孢桿菌屬已知種有8 個，表1列出了P-4與這8個枝芽孢桿菌屬已知種在生理生化特征上的異同。可以看出，P-4擁有大量枝芽孢桿菌屬的特征，如生長范圍、氧化酶活性、V-P實驗、吲哚實驗、精氨酸雙水解酶及鳥氨酸脫羧酶活性等都基本一致；但是也有部分不同于枝芽孢桿菌屬已知種的特征，如革蘭氏染色、硝酸鹽還原性、H2S產(chǎn)氣、賴氨酸脫羧酶活性等。

表1 P-4區(qū)別于枝芽孢桿菌屬其他種細菌的不同特征Tab le 1 Differential characteristics between strain P-4 and related species of the genus Virgibacillus

通過以上對各項實驗結(jié)果的分析，初步認定菌株P(guān)-4可能為芽孢桿菌科枝芽孢桿菌屬的一個新種，命名為Virgibacillus sp. P-4。

2.4 Virgibacillus sp. P-4的生長特性

由圖5可知，該菌在經(jīng)過液體培養(yǎng)之后，20 h之后即可進入生長穩(wěn)定期；最適生長溫度為30～37 ℃；當pH值小于6.5時，菌體幾乎不生長或生長緩慢，當pH 6.5～7.5時，隨著pH值的升高，菌體呈對數(shù)生長；當pH值大于7.5時，菌體生長速率減緩，但仍舊繼續(xù)生長；最適生長NaCl質(zhì)量分數(shù)為5%～15%，當NaCl質(zhì)量分數(shù)超過20%，菌體幾乎不再生長。從生長特性來看，該菌對NaCl有一定的耐受性和依賴性，這也為今后將其應用于高鹽發(fā)酵提供了可能性。

2.5 Virgibacillus sp. P-4的酶學性質(zhì)

由圖6可知，Virgibacillus sp. P-4的粗酶液受溫度、NaCl質(zhì)量分數(shù)、金屬離子及添加劑的影響。圖6A表明，Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶的最適反應溫度是40 ℃，并且在20～50 ℃處理30 m in后，仍保持較高且比較穩(wěn)定的酶活力，這表明Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶具有一定的耐熱能力，而耐熱能力對食品發(fā)酵是至關(guān)重要的。因為食品發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一定的熱量，具有耐熱能力的蛋白酶即使溫度升高仍能保持較高且穩(wěn)定的酶活力[30]。圖6B表明，Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶的活性隨著NaCl質(zhì)量分數(shù)的升高而逐漸升高，當NaCl質(zhì)量分數(shù)達到15%時，蛋白酶活力達到最高，隨后蛋白酶活力隨NaCl質(zhì)量分數(shù)升高而急劇下降。這一結(jié)果表明該蛋白酶需要一定濃度的NaCl來達到最高酶活力并且可以在高鹽環(huán)境下保持性質(zhì)穩(wěn)定。圖6C表明，不同的金屬離子對Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶粗酶液的活性均有不同程度的抑制作用，其中Zn2+、Fe2+、Co2+對酶活力具有明顯的抑制作用。圖6D表明，EDTA、PMSF、Pepstatin對Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶也有不同程度的抑制作用，其原因是，該菌所產(chǎn)胞外蛋白酶的種類可能不只一種。而IAM是一種巰基反應物，在添加了一定濃度的IAM后，蛋白酶的活性幾乎不受影響，表明該粗酶液中不包含巰基蛋白酶。

圖5 Virgibacillus sp. P-4培養(yǎng)過程中時間（A）、溫度（B）、pH值（C）、NaCl質(zhì)量分數(shù)（D）對菌株生長量的影響Fig. 5 Effects of culture time (A), temperature (B), pH (C), and NaCl concentration (D) on biomass of Virgibacillus sp. P-4

圖6 溫度（A）、NaCl質(zhì)量分數(shù)（B）、金屬離子（C）、抑制劑（D）對Virgibacillus sp. P-4蛋白酶活力的影響Fig. 6 Effects of temperature (A), NaCl concentration (B), metal ions (C),and inhibitors (D) on protease activity of Virgibacillus sp. P-4

關(guān)于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）的嗜鹽性、胞外蛋白酶性質(zhì)及發(fā)酵特性近年來也曾有報道，Sinsuwan等[31]從發(fā)酵1個月的魚露中篩選到1株中度嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌Virgibacillus sp. SK37，其粗酶液在0%～25%NaCl下具有穩(wěn)定酶活力；Udomsil等[32]在魚露發(fā)酵過程中相繼接種Virgibacillus sp. SK37和Tetragenococcus halophilus MS33，結(jié)果表明這種發(fā)酵方式對改善產(chǎn)品的揮發(fā)性成分，提高谷氨酸含量和整體可接受度上具有較大潛力。由圖3的建樹結(jié)果可知P-4與Virgibacillus sp. SK 37處于同一分支，它們的16S rDNA序列相似度很高，都屬于嗜鹽菌。但是通過對比它們粗酶液的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)Virgibacillus sp.SK 37的酶活力最佳條件為p H 8.0和65 ℃[31]，而Virgibacillus sp. P-4的最佳酶活力則是在pH 7.0和40 ℃處獲得。由此表明，Virgibacillus sp. SK37所產(chǎn)蛋白酶對溫度的要求比較高，而Virgibacillus sp. P-4則可以在適宜溫度同時達到生長最佳和酶活力最高，因此Virgibacillus sp.P-4在實際生產(chǎn)中更具應用潛力。

2.6 Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶的酶解特異性

蛋白酶降解蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)的肽鍵破裂，導致氨基酸的釋放，用游離氨基酸的釋放速率來預測Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶優(yōu)先作用于哪些氨基酸組成的肽鍵。Lei Fenfen等[33]將應用最廣泛、效果較好、酶切位點確定的兩種商業(yè)酶（Papain和A lcalase 2.4L）用來酶解鳳尾魚蛋白和大豆蛋白時，通過游離氨基酸的釋放速率來預測酶切位點，所得結(jié)果與文獻報道的這兩種商業(yè)酶的特異性酶切位點結(jié)論幾乎完全一致。因此，游離氨基酸的釋放速率在一定程度上能夠反映蛋白酶的酶解特異性。

然而酶促反應通常很復雜，不一定滿足線性關(guān)系，但在酶促反應的初期可以認為是符合線性關(guān)系的。在本實驗中，南極磷蝦酶解的前11 h內(nèi)，游離氨基酸含量與時間有較好的線性關(guān)系，在這個時間段內(nèi)，游離氨基酸的釋放速率如表2所示，Virgibacillus sp. P-4的粗酶液在酶解南極磷蝦時，釋放速率最快的是Phe、Tyr、Lys、His、Pro與Leu，由此可推測Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶在酶解過程中優(yōu)先酶解含Phe-、Tyr-、Lys-、His-、Pro-及Leu-的肽鍵。

表2 Virgibacillus sp. P-4的蛋白酶酶解南極磷蝦各種氨基酸的釋放速率Table 2 The rate of release of FAAs from Antarctic krill meat hyd rolyzed by the protease from Virgibacillus sp. P-4

3 結(jié) 論

蝦醬作為一種特殊的鹽生環(huán)境，分布著多種嗜鹽菌，這些嗜鹽菌在蝦醬的發(fā)酵成熟過程中起著至關(guān)重要的作用。采用酪蛋白瓊脂平板法從蝦醬中分離得到一株在高鹽環(huán)境下仍能保持穩(wěn)定酶活力的蛋白酶產(chǎn)生菌Virgibacillus sp. P-4，并通過分子鑒定、表型鑒定、生長特性研究、酶學性質(zhì)研究、酶切位點預測等手段對其進行了全面解析，從實驗結(jié)果可以看出，Virgibacillus sp.P-4確實是一株嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌，其生長特性和胞外蛋白酶活力都對NaCl有較強依賴性，這為將其應用于鹽生環(huán)境發(fā)酵提供了可能性。其次，Virgibacillus sp. P-4的生長最適溫度和酶解最適反應溫度比較接近，在發(fā)酵過程中只需設置適宜溫度，即可讓Virgibacillus sp. P-4同時滿足生長最佳和胞外蛋白酶活力最高。以上這些結(jié)果都為進一步利用該菌株進行低鹽發(fā)酵提供了理論支持。

[1] MONTANO N, GAVINO G, GAVINO V C. Polyunsaturated fatty acid contents of some traditional fish and shrimp paste condiments of Philippines[J]. Food Chem istry, 2001, 75(2): 155-158. DOI:10.1016/S0308-8146(01)00126-1.

[2] 吳帥, 楊錫洪, 解萬翠, 等. 低值蝦發(fā)酵制備傳統(tǒng)蝦醬風味的綜合分析與比較[J]. 食品科學, 2016, 37(2): 121-127. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602021.

[3] GILDBERG A, ESPEJO-HERMES J, MAGNO-OREJANA F.Acceleration of autolysis during fish sauce fermentation by adding acid and reducing the salt content[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1984, 35(12): 1363-1369. DOI:10.1002/jsfa.2740351214.

[4] LOPETCHARAT K, PARK J W. Characteristics of fish sauce made from pacific whiting and surim i by-products during fermentation stage[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(2): 511-516. DOI:10.1111/j.1365-2621.2002.tb10628.x.

[5] BEDDOWS C G, ARDESHIR A G. The production of soluble fish protein solution for use in fish sauce manufacture Ⅰ. The use of added enzymes[J]. International Journal of Food Science & Technology,1979, 14: 603-612. DOI:10.1111/j.1365-2621.1979.tb00907.x.

[6] AKOLKAR A V, DURAI D, DESAI A J. Halobacterium sp. SP1(1)as a starter culture for accelerating fish sauce fermentation[J]. Journal of Applied M icrobiology, 2010, 109(1): 44-53. DOI:10.1111/j.1365-2672.2009.04626.x.

[7] VISESSANGUAN W, BENJAKUL S, SM ITINONT T, et al. Change in m icrobiological, biochem ical and physico-chem ical properties of Nham inoculated w ith different inoculum levels of Lactobacillus curvatus[J]. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 2006, 39(7):814-826. DOI:10.1016/j.lw t.2005.05.006.

[8] SPERANZA B, RACIOPPO A, BEVILACQUA A, et al. Selection of autochthonous strains as starter cultures for fermented fish products[J]. Journal of Food Science, 2015, 80(1): M 151-M 160.DOI:10.1111/1750-3841.12721.

[9] 段杉, 胡小喜, 廖廣強, 等. 鹽度對蝦油中蛋白酶系、微生物和及其品質(zhì)的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014(7): 38-43. DOI:10.13982/j.m fst.1673-9078.2014.07.021.

[10] 呂欣然, 李瑩, 馬歡歡, 等. 傳統(tǒng)錦州蝦醬中產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌的分離與鑒定[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(7): 121-125. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.016.

[11] TANASUPAWAT S, TAPRIG T, AKARACHARANYA A, et al.Characterization of Virgibacillus strain TKNR13-3 from fermented shrimp paste (ka-pi) and its protease production[J]. A frican Journal of M icrobiology Research, 2011, 5(26): 4714-4721. DOI:10.5897/AJMR10.520.

[12] 連鑫, 楊錫洪, 解萬翠, 等. 中國傳統(tǒng)蝦醬中產(chǎn)蛋白酶霉菌的分離和鑒定[J]. 食品與機械, 2014(3): 40-43. DO I:10.3969/j.issn.1003-5788.2014.03.010.

[13] 中國國家標準化委員會. 蛋白酶制劑: GB/T 23527—2009[S]. 北京:中國標準出版社, 2009.

[14] 李夢哲. 寬譜沙門氏菌噬菌體STP4-a的發(fā)酵制備及其在蛋雞體內(nèi)的抑菌研究[D]. 青島: 中國海洋大學, 2014.

[15] 蔡妙英, 東秀珠. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2001.

[16] 布坎南, 吉本斯. 伯杰細菌鑒定手冊[M] . 8版. 北京: 科學出版社, 1984.

[17] 雷芬芬. 深海菌株Exiguobacterium sp. SWJS2發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶、酶學性質(zhì)及酶解特異性研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2014.

[18] ROH S W, KIM K H, NAM Y D, et al. Investigation of archaeal and bacterial diversity in fermented seafood using barcoded pyrosequencing[J]. ISME Journal, 2009, 4(1): 1-16. DOI:10.1038/ismej.2009.83.

[19] DUAN S, HU X, LI M, et al. Composition and metabolic activities of the bacterial community in shrimp sauce at the flavor-forming stage of fermentation as revealed by metatranscriptome and 16S rRNA gene sequencings[J]. Journal of Agricultural and Food Chem istry, 2016,64(12): 2591-2603. DOI:10.1021/acs.jafc.5b05826.

[20] 吳燕燕, 游剛, 李來好, 等. 低鹽乳酸菌法與傳統(tǒng)法腌干魚制品的風味比較[J]. 水產(chǎn)學報, 2014, 38(4): 601-612. DOI:10.3724/SP.J.1231.2014.49049.

[21] DENARIAZ G, PAYNE W J, GALL J L. A halophilic denitrifier,Bacillus halodenitrificans sp. nov. Int J Syst Bacteriol[J]. International Jou rnal o f System atic Bacterio logy, 1989, 39(2): 145-151.DOI:10.1099/00207713-39-2-145.

[22] YOON J H, OH T K, PARK Y H. T ransfer o f Bacillus halodenitrificans Denariaz et al. 1989 to the genus Virgibacillus as Virgibacillus halodenitrificans comb. nov.[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary M icrobiology, 2004, 54(6): 2163-2167.DOI:10.1099/ijs.0.63196-0.

[23] PROOM H, KNIGHT B C. Bacillus panto thenticus (n.sp.)[J].Jou rnal o f Genera l M ic robio logy, 1950, 4(3): 539-541.DOI:10.1099/00221287-4-3-539.

[24] HEYRMAN J, LOGAN N A, BUSSE H J, et al. Virgibacillus carmonensis sp. nov. Virgibacillus necropo lis sp. nov. and Virgibacillus picturae sp. nov. three novel species isolated from deteriorated mural paintings, transfer of the species of the genus salibacillus to Virgibacillus, as Virgibacillus[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary M icrobiology, 2003, 53(Pt 2):501-511. DOI:10.1099/ijs.0.02371-0.

[25] GARABITO M J, ARAHAL D R, MELLADO E, et al. Bacillus salexigens sp. nov. a new moderately halophilic Bacillus species[J].International Journal of Systematic Bacteriology, 1997, 47(3):735-741. DOI:10.1099/00207713-47-3-735.

[26] ARAHAL D R, MáRQUEZ M C, VOLCANI B E, et al. Bacillus marismortui sp. nov. a new moderately halophilic species from the Dead Sea[J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1999,49 Pt 2(2): 521-530. DOI:10.1099/00207713-49-2-521.

[27] YOON J H, KANG S J, LEE S Y, et al. Virgibacillus dokdonensis sp. nov. isolated from a Korean island, Dokdo, located at the edge of the East Sea in Korea[J]. International Journal of Systematic &Evolutionary M icrobiology, 2005, 55(Pt 5): 1833-1837. DOI:10.1099/ijs.0.63613-0.

[28] WANG C Y, CHANG C C, NG C C, et al. Virgibacillus chiguensis sp.nov. a novel halophilic bacterium isolated from Chigu, a previously commercial saltern located in southern Taiwan[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary M icrobiology, 2008, 58(Pt 2):341-345. DOI:10.1099/ijs.0.64996-0.

[29] HUA N P, HAM ZACHAFFA I A, VREELAND R H, et al.Virgibacillus salarius sp. nov. a halophilic bacterium iso lated from a Saharan salt lake[J]. International Journal of Systematic &Evolutionary M icrobiology, 2008, 58(10): 2409-2414. DOI:10.1099/ijs.0.65693-0.

[30] 高瑞昌, 劉向東, 陸文婷, 等. 嗜鹽古生菌Halogranum rubrum RO2-11胞外蛋白酶酶學特性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015(2): 32-36.DOI:10.13982/j.m fst.1673-9078.2015.2.006.

[31] SINSUWAN S, RODTONG S, YONGSAWATDIGUL J. NaCl-Activated extracellular proteinase from Virgibacillus sp. SK37 isolated from fish sauce fermentation[J]. Journal of Food Science, 2007, 72(5):C264-C269. DOI:10.1111/j.1750-3841.2007.00375.x.

[32] UDOMSIL N, CHEN S, RODTONG S, et al. Imp rovemdent of fish sauce quality by combined inoculation of Tetragenococcus halophilus MS33 and Virgibacillus sp. SK37[J]. Food Control, 2016.DOI:10.1016/j.foodcont.2016.10.007.

[33] LEI F F, CUI C, ZHAO Q Z, et al. Evaluation of the hydrolysis specifi city of protease from marine Exiguobacterium sp. SWJS2 via free amino acid analysis[J]. Applied Biochem istry and Biotechnology,2014, 174(4): 1260-1271. DOI:10.1007/s12010-014-1088-7.

Isolation, Identification and Properties of Protease-Producing Halophilic Bacterium Virgibacillus sp. P-4 from Traditional Shrimp Sauce

ZHANG Yanjie, WANG Jingxue*, MOU Haijin
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Protease-producing bacteria were isolated from traditional shrimp sauce by using casein agar medium containing 10% NaCl. Based on its morphological, biochem ical and molecular properties, Virgibacillus sp. P-4 was determ ined as target strain for further study. The strain grew best at 30–37 ℃ w ith a salinity of 5%–15%. The protease produced by Virgibacillus sp. P-4 showed the optimum activity at 40 ℃, and was stable in the range of 20–50 ℃. The enzymatic activity reached its peak when NaCl concentration was 15%. Besides, Virgibacillus sp. P-4 m ight produce more than one extracellular protease except sulfhydryl protease. According to the rate of release of free am ino acids, the protease m ight preferably hydrolyze peptides containing Phe-, Tyr-, Lys-, His-, Pro- and Leu-.

protease-producing bacteria; halophilic bacteria; shrimp sauce; properties

10.7506/spkx1002-6630-201722016

TS254.1

A

1002-6630（2017）22-0102-07

張延杰, 王靜雪, 牟海津. 嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌Virgibacillus sp. P-4的篩選鑒定及其特性分析[J]. 食品科學, 2017, 38(22):102-108. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722016. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yanjie, WANG Jingxue, MOU Haijin. Isolation, identification and properties of protease-producing halophilic bacterium Virgibacillus sp. P-4 from traditional shrimp sauce[J]. Food Science, 2017, 38(22): 102-108. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722016. http://www.spkx.net.cn

2017-01-04

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項計劃項目（2015ZDZX05003）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（海水魚）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項（CARS-47）；水產(chǎn)品（甲殼類）高效保鮮模式的建立與示范項目（931566010）

張延杰（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：zhangyjouc@163.com

*通信作者：王靜雪（1976—），女，教授，博士，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：snow@ouc.edu.cn