陳宏杰，金永國(guó)，馬美湖*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070）

雞蛋黃蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物制備及其對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化的影響

陳宏杰，金永國(guó)，馬美湖*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070）

雞蛋黃經(jīng)脫脂得到蛋黃蛋白質(zhì)，直接以MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力為指標(biāo)，對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化，從而制備蛋黃蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（egg yolk proteins hydrolysate，EYPH）并對(duì)其促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞增殖分化的活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在對(duì)比胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶水解過程中，發(fā)現(xiàn)單一胰蛋白酶反應(yīng)得到產(chǎn)物活性最好，胰蛋白酶反應(yīng)的最佳水解條件為水解時(shí)間6 h、水解溫度37 ℃、酶與底物質(zhì)量比1∶50、pH 8.0。EYPH使MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力得到提高，為129.89%，細(xì)胞周期分析得到S期細(xì)胞增加了4.69%，這2 個(gè)方面證實(shí)EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活力有顯著的提高。EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞分化礦化有顯著影響，堿性磷酸酶活力提高了9.1%；刺激骨鈣素分泌，其含量上升2 mg/m L；形成更多的礦化結(jié)節(jié)。此外，EYPH還能刺激RUNX2特異性轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)，表達(dá)量提高了6.12倍。結(jié)果說明EYPH對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖分化有顯著的促進(jìn)作用，因此，EYPH對(duì)于抗骨質(zhì)疏松方面有較好的應(yīng)用潛力，為開發(fā)其功能性食品提供一定的數(shù)據(jù)參考。

蛋黃蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物；水解條件；MC3T3-E1細(xì)胞；增殖；分化

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的疾病，主要特征為骨質(zhì)量和微體系結(jié)構(gòu)受到系統(tǒng)性的損傷[1]。正常成年人的骨質(zhì)量穩(wěn)態(tài)是通過骨形成與骨吸收的平衡來維持。預(yù)防治療骨質(zhì)疏松癥是通過抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成來阻止骨質(zhì)的流失[2-4]。骨吸收是通過破骨細(xì)胞活化分解骨基質(zhì)所產(chǎn)生的，骨形成是通過成骨細(xì)胞增殖、胞外基質(zhì)成熟、胞外基質(zhì)礦化及凋亡所調(diào)控的[5]。成骨細(xì)胞的增殖及分化是骨形成的關(guān)鍵，提高成骨細(xì)胞分化活力可以有效的促進(jìn)骨形成[6]。誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化對(duì)于預(yù)防治療骨質(zhì)疏松癥具有重要意義。目前市面上銷售的治療骨質(zhì)疏松癥的骨合成藥劑特立帕肽是一種甲狀腺激素類似物，它不適用于骨質(zhì)疏松癥的所有患者[7]。因此，開發(fā)促進(jìn)骨形成的藥劑及功能產(chǎn)品具有重要研究意義。

目前，有研究[8-12]報(bào)道食源性功能產(chǎn)品對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化有促進(jìn)作用，說明可以在食品中尋找促進(jìn)骨形成的功能產(chǎn)品。蛋黃蛋白質(zhì)是蛋黃提取卵磷脂的副產(chǎn)物，在雞胚發(fā)育過程中這些蛋白質(zhì)是必需的生物活性物質(zhì)。有關(guān)提取卵磷脂后副產(chǎn)物的加工利用研究的報(bào)道[13-15]也逐漸增加，主要是通過蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解得到具有功能活性物質(zhì)，活性功能主要表現(xiàn)在抗氧化、抗高血壓、抗糖尿病等作用。據(jù)報(bào)道[16-17]由于蛋黃蛋白質(zhì)在胚胎骨骼發(fā)育過程起關(guān)鍵作用，所以蛋黃來源肽對(duì)于骨代謝有著保護(hù)作用，對(duì)預(yù)防骨質(zhì)疏松癥具有潛在效果。但是對(duì)于這一功能物質(zhì)的水解條件的研究目前鮮有報(bào)道，該蛋黃來源肽促進(jìn)骨形成的機(jī)理研究也不是很清楚。

因此，在本研究中以蛋黃蛋白質(zhì)為底物，以成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交法確定水解反應(yīng)的最優(yōu)條件，水解得到蛋黃蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（egg yolk proteins hydrolysate，EYPH）。研究其對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖活力、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、骨鈣素（osteocalcin，OC）含量和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RUNX 2的基因表達(dá)的影響，為開發(fā)預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的功能性產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋 武漢九峰山養(yǎng)殖場(chǎng)；MC3T3-E1細(xì)胞中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；α-M EM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素、鏈霉素） 美國(guó)Gibco公司；茜素紅染料 美國(guó)Sigm a公司；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)盒 北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；小鼠骨鈣素ELISA檢測(cè)試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、碘化丙啶PI試劑 武漢谷歌生物科技有限公司；RNaseA核糖核酸酶 北京So larbio公司；Trizo l RNA提取試劑盒美國(guó)Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒 美國(guó)Thermo Fisher公司；SYBR Green染料 瑞士Roche公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Sigma3-30K高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；ALPHA 1-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；HERAcell 150I型二氧化碳培養(yǎng)箱 德國(guó)Thermo公司；IX 71熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；iMark酶標(biāo)儀 聯(lián)想生物科技有限公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）儀 美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋黃蛋白質(zhì)的水解

將新鮮雞蛋進(jìn)行蛋黃分離，混勻后經(jīng)冷凍干燥機(jī)干燥，后將蛋黃粉經(jīng)乙醇和正己烷（體積比1∶2）溶液除去蛋黃中脂質(zhì)成分，得到蛋黃蛋白質(zhì)（egg yolk protein，EYP）。蛋白酶水解反應(yīng)是根據(jù)Zambrow icz等[18]的方法，作一定改動(dòng)：稱取一定量EYP溶于一定去離子水中（質(zhì)量濃度為5.0 mg/m L），充分混勻。將溶液放置恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)器中將溫度調(diào)節(jié)至蛋白酶最適溫度，將pH值調(diào)至蛋白酶最適值，最后加入一定量的蛋白酶反應(yīng)。制備得到的EYPH放置于95 ℃水浴中滅酶10 m in，冷卻后放置于冷凍離心機(jī)中離心（8 000×g，15m in），收集上清液凍干。

1.3.2 水解度的測(cè)定

根據(jù)藍(lán)澤林[19]的甲醛滴定法測(cè)定水解EYP的水解度（degree of hydrolysis，DH）。DH計(jì)算由公式（1）和公式（2）表示。

式中：h（NH2）為水解后的氨基態(tài)氮濃度/（mmol/g）；h0為水解前的氨基態(tài)氮濃度/（mmol/g）；htot為底物中的肽鍵濃度/（mmol/g），卵黃蛋白的htot為7.841 mmol/g。

式中：V1為樣品組所消耗的NaOH溶液的體積/m L；V2為對(duì)照組所消耗的NaOH溶液的體積/m L；C為NaOH的物質(zhì)的量濃度/（mol/m L）；V為待測(cè)液的體積/m L；V0為取水解產(chǎn)物的體積/m L；m為蛋黃蛋白質(zhì)質(zhì)量/g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在蛋白酶水解過程中，酶與底物比、反應(yīng)pH值、水解溫度、水解時(shí)間都影響著水解度（DH）[20]。水解過程中僅用DH來衡量水解條件的優(yōu)化是不夠的，對(duì)于制備活性水解產(chǎn)物，其不同的水解條件可以對(duì)其活性功能產(chǎn)生很大的影響。因此在對(duì)比DH的程度上使用其活性功能作為指標(biāo)去優(yōu)化其水解條件，首先采用單因素試驗(yàn)確定胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶各自適宜的水解條件。

每種蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，水解得到的產(chǎn)物活性也有所不同[21]。2 種酶復(fù)合后可能有協(xié)同的作用，對(duì)于蛋白質(zhì)中活性位點(diǎn)的釋放起到更好的作用。對(duì)胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的單一作用及復(fù)合作用進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their coded and actual levels used for orthogonal array design

1.3.4 MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力測(cè)定

將Li Jia等[22]使用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞增殖率的方法適當(dāng)改進(jìn)。將細(xì)胞按8×103個(gè)/孔接種于96孔板中，使其貼壁4 h，更換不同濃度的含有水解產(chǎn)物的培養(yǎng)液100 μL，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將96孔板放置于恒濕恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板更換正常培養(yǎng)液，再向每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h后，置于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。細(xì)胞增殖率按公式（3）計(jì)算：

1.3.5 MC3T3-E1細(xì)胞周期分析

根據(jù)Liu Junli等[23]的方法通過碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色檢測(cè)DNA的分布從而分析細(xì)胞周期。將細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，使貼壁4 h，加入質(zhì)量濃度為0、1、2 mg/m L的含水解產(chǎn)物的培養(yǎng)液2.5 m L，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)孔。孵育24 h后，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下培養(yǎng)板，加入體積分?jǐn)?shù)90%冰浴乙醇，保持-20 ℃的溫度12 h。用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，用RNaseA消化40 m in，加入PI避光染色20 m in，利用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm下進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞周期。

1.3.6 MC3T3-E1細(xì)胞ALP活力測(cè)定

取細(xì)胞濃度為9×104個(gè)/m L接種于12 孔板中，每孔接種1 m L，待48 h后，更換質(zhì)量濃度為0、1、2 mg/m L的含水解產(chǎn)物的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導(dǎo)分化5 d（每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)復(fù)孔），去除培養(yǎng)液，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%TritonX-100的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，取上清液，根據(jù)堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒的說明操作測(cè)定該上清液的ALP活力。

1.3.7 MC3T3-E1細(xì)胞OC含量的測(cè)定

將細(xì)胞按9×104個(gè)/孔的濃度接種于12 孔板中，培養(yǎng)48 h后，換質(zhì)量濃度為0、1、2 mg/m L的含水解產(chǎn)物的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導(dǎo)分化5 d（每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)復(fù)孔），收集培養(yǎng)液，根據(jù)小鼠骨鈣素ELISA試劑盒的說明操作檢測(cè)培養(yǎng)液中OC的含量。

1.3.8 RTFQ-PCR測(cè)定成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的基因表達(dá)

根據(jù)A lessand ro等[24]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，使用RTFQ-PCR儀對(duì)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的基因表達(dá)進(jìn)行分析。將細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后，換質(zhì)量濃度為0、1、2 mg/m L的含水解產(chǎn)物的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導(dǎo)分化5 d，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3 個(gè)孔。根據(jù)Trizol試劑說明提取細(xì)胞中總RNA，取2 μg RNA通過cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄用FQ-PCR進(jìn)行分析（95 ℃，15 s→65 ℃，60 s循環(huán)40 次），mRNAs是通過SYBR Green染色引物作為參照基因所測(cè)定，反應(yīng)引物序列見表2。

表2 RTFQ-PCR反應(yīng)引物Table 2 Primer sequences used for RTFQ-PCR analysis

1.3.9 MC3T3-E1細(xì)胞茜素紅染色分析

將細(xì)胞按2×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)48 h后，換質(zhì)量濃度為0、1、2 mg/m L的含水解產(chǎn)物的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導(dǎo)分化26 d。去除培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗2 次，用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液固定1 h，吸出固定液，用磷酸鹽緩沖液清洗2 次，向每孔中加入40 mmol/L的茜素紅染色液（由氨水溶解pH值調(diào)節(jié)至4.2），室溫放置15 m in。去除染色液，用去離子水洗滌染色后的細(xì)胞5 次，置于37 ℃烘箱烘干5 h，拍照觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P值小于0.05為顯著性差異，數(shù)據(jù)用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)對(duì)胰蛋白酶水解制備EYPH的影響

從圖1A可以看出，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，胰蛋白酶對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)的水解度也隨之增大，在4～7 h范圍內(nèi)水解速率較快，7 h后水解速率降緩，10 h后DH幾乎無(wú)變化。這可能是由于底物中胰蛋白酶的目標(biāo)位點(diǎn)被逐漸酶解，后不再酶解其余肽鍵，所以DH變化逐漸穩(wěn)定。DH不同，得到的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)也是有差異的。在水解6 h后所得到的產(chǎn)物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力的影響最高，細(xì)胞增殖率為115.77%。在水解6 h時(shí)，DH為18.6%，6 h后隨水解時(shí)間延長(zhǎng)DH增大，但產(chǎn)物活性均低于水解6 h的產(chǎn)物。產(chǎn)物活性并不隨DH的增加而增大，這可能是因?yàn)橐让笇a(chǎn)物中的活性物質(zhì)進(jìn)一步水解，而導(dǎo)致活性降低。所以后期水解條件優(yōu)化中，都使用MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力為衡量指標(biāo)。由圖1B可知，在pH值為8的水解條件下，得到的產(chǎn)物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力的影響是最佳的。由圖1C可知，水解溫度在37 ℃時(shí)，水解產(chǎn)物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力的影響是最大的。由圖1D可知，酶與底物質(zhì)量比為1∶50，水解產(chǎn)物活性最強(qiáng)。

圖1 4 種單因素條件對(duì)胰蛋白酶制備EYPH的影響Fig. 1 Effects of hydrolysis conditions for trypsin alone on cell proliferation promoting activity of EYPH

2.2 單因素試驗(yàn)對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解制備EYPH的影響

由圖2A可知，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，其產(chǎn)物對(duì)MC3T3-E1增殖的影響是先增加后減弱的，在6～8 h時(shí)水解產(chǎn)物的活性基本一致，在8 h后活性減弱，推測(cè)為過長(zhǎng)時(shí)間的水解使活性物質(zhì)進(jìn)一步的被酶切，導(dǎo)致活性降低。如圖2B所示，在pH值為7.5時(shí)所得到產(chǎn)物活性最強(qiáng)，在該酶水解時(shí)調(diào)節(jié)pH值為7.5。從圖2C可得，產(chǎn)物隨水解溫度活性先升高后降低，在50 ℃條件下活性最高，推測(cè)是由于溫度過高后使酶的活性受抑制。由圖2D可知，在酶與底物質(zhì)量比為1∶20時(shí)產(chǎn)物活性最高，可能由于風(fēng)味蛋白酶的分子質(zhì)量大，底物量過大時(shí)，少量的酶分子與底物接觸不完全，因此酶與底物質(zhì)量比過大時(shí)，產(chǎn)物活性降低。

圖2 4 種單因素條件對(duì)風(fēng)味蛋白酶制備EYPH的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis conditions for fl avourzyme alone on cell proliferation promoting activity of EYPH

2.3 胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合的正交試驗(yàn)結(jié)果

由于每種蛋白酶酶切的位點(diǎn)不同，為考察復(fù)合后是否有協(xié)同作用，進(jìn)行復(fù)合酶與單一酶的正交試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，其中水解時(shí)間為6 h。由表3可得，水解的最佳pH值為8，最佳溫度為37 ℃，最適用酶為單一胰蛋白酶，最佳酶與底物混合比為1∶75。各因素對(duì)細(xì)胞增殖率的影響順序?yàn)閜H值＞酶與底物質(zhì)量比＞胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比＞水解溫度，且由表4方差分析可知pH值影響顯著。最優(yōu)條件為A2B1C3D3，水解得到的產(chǎn)物加入培養(yǎng)基中，MC3T3-E1細(xì)胞增殖率為118.75%，進(jìn)而驗(yàn)證了正交試驗(yàn)結(jié)果，從這一結(jié)果可以得出單一胰蛋白酶水解要優(yōu)于復(fù)合酶水解。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design with experimental results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.4 EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖率的影響

細(xì)胞增殖是細(xì)胞新生的過程，它能使細(xì)胞數(shù)目迅速增多，細(xì)胞增殖是組織與器官發(fā)育的基礎(chǔ)[25]。在骨骼發(fā)育過程中，成骨細(xì)胞的增殖是這一過程的先決條件。如圖3A所示，EYPH顯著提高M(jìn)C3T3-E1的增殖活力，在質(zhì)量濃度偏低的情況下，隨質(zhì)量濃度增加其增殖率也增加，在質(zhì)量濃度偏高時(shí)，質(zhì)量濃度增加反而使其增殖率降低。如圖3B可知，在1 mg/m L時(shí)，MC3T3-E1增殖率達(dá)到129.87%，2 mg/m L時(shí)，增殖率為110.11%。從結(jié)果可知，1 mg/m L的EYPH可以顯著的提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞增殖率（P＜0.05），2 mg/m L的促進(jìn)效果不明顯，且2 個(gè)劑量組之間存在顯著差異（P＜0.05）。

圖3 EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響Fig. 3 Effect of EYPH on proliferation of MC3T3-E1 cells

2.5 EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞周期的影響

圖4 EYPH處理后MC3T3-E1細(xì)胞周期分布的改變Fig. 4 Effect of EYPH the cell cycle distribution of MC3T3-E1 cells

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期（G1、S、G2）與分裂期（M）。S期是細(xì)胞中從DNA合成開始到DNA合成結(jié)束的全過程，是細(xì)胞增殖周期的關(guān)鍵階段。通過流式細(xì)胞儀測(cè)定EYPH處理后細(xì)胞周期的分布，并在細(xì)胞周期分布水平上討論EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖率的影響。由圖4可知，經(jīng)EYPH處理后的MC3T3-E1細(xì)胞，處于S期細(xì)胞數(shù)都顯著高于對(duì)照組，1 mg/m L處理的S期細(xì)胞數(shù)占29.59%，2 mg/m L處理的S期細(xì)胞數(shù)占29.22%。從結(jié)果表明EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，且1 mg/m L處理時(shí)效果優(yōu)于2 mg/m L處理時(shí)效果，進(jìn)而從細(xì)胞周期水平驗(yàn)證了CCK-8法測(cè)定的結(jié)果。

2.6 EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中ALP活力的影響

ALP是成骨細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)成熟的標(biāo)志[26-27]，在測(cè)定成骨細(xì)胞活性中是一個(gè)重要的指標(biāo)，ALP活力的增加表示成骨細(xì)胞分化階段的促進(jìn)。由圖5可知，EYPH質(zhì)量濃度為1 mg/m L時(shí)，ALP活力高于對(duì)照組，ALP活力增加了9.1%，顯著高于對(duì)照組與2 mg/m L質(zhì)量濃度組（P＜0.05），質(zhì)量濃度為2 mg/m L時(shí)ALP活力與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。說明EYPH可以提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞ALP活力。

圖5 EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中ALP的影響Fig. 5 Effect of EYPH on ALP activity of MC3T3-E1 cells

2.7 EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞OC含量的影響

OC是成骨細(xì)胞特異性合成并分泌的一種蛋白，是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志物[28]。OC分泌量的增加也表明成骨細(xì)胞分化得到促進(jìn)。由圖6可知，在1 mg/m L處理下，OC分泌量要高于對(duì)照組與2 mg/m L組，但提高量不顯著（P＞0.05）。這可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)時(shí)間7 d時(shí)，細(xì)胞中OC的mRNA剛開始合成且還沒有轉(zhuǎn)錄成OC蛋白，則OC含量可能是成骨細(xì)胞分化后期的標(biāo)志物。

圖6 EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞OC含量的影響Fig. 6 Effect of EYPH on osteocalcin secretion in MC3T3-E1 cells

2.8 EYPH對(duì)成骨細(xì)胞中特異性轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的基因表達(dá)的影響

RUNX 2是成骨細(xì)胞中特異性轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，能刺激分化過程中蛋白的基因轉(zhuǎn)錄[29-30]。RUNX 2的基因表達(dá)水平是成骨細(xì)胞增殖、分化階段的重要指標(biāo)。如圖7所示，EYPH刺激MC3T3-E1細(xì)胞中RUNX 2的基因表達(dá)量并顯著上升，在1 mg/m L的EYPH刺激下RUNX2基因表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組提高了6.12 倍（P＜0.01），質(zhì)量濃度為2 mg/m L時(shí)提升了2.96倍。結(jié)果表明EYPH顯著刺激成骨細(xì)胞中RUNX2的表達(dá)，且低劑量刺激后效果更好。

圖7 EYPH處理后MC3T3-E1細(xì)胞中RUNX2的表達(dá)擴(kuò)增指數(shù)Fig. 7 Effect of EYPH on the expressions level of RUNX2 in MC3T3-E1 cells

2.9 EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的影響

礦化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞分化階段，胞外基質(zhì)成熟，通過與鈣離子的結(jié)合，形成的鈣離子螯合物。茜素紅染色液可以與其特異性結(jié)合，形成紅色的復(fù)合物，從而可以直觀的表征礦化結(jié)節(jié)的形成量。如圖8可知，在1 mg/m L的EYPH處理下，礦化結(jié)節(jié)形成的最多，其染色程度最深，應(yīng)該是結(jié)合的特異性產(chǎn)物比較多。結(jié)果表明EYPH可以有效刺激MC3T3-E1細(xì)胞的礦化，具有促進(jìn)骨形成的作用。

圖8 EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響Fig. 8 Effect of EYPH on m ineralization in MC3T3-E1 cells

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)將雞蛋黃經(jīng)有機(jī)溶劑脫脂后得到蛋黃蛋白質(zhì)，采用2 種蛋白酶進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化，并直接以水解產(chǎn)物對(duì)MC3T3-E1影響為指標(biāo)，得到了制備EYPH的最優(yōu)水解條件為單一胰蛋白酶水解、水解時(shí)間6 h、pH 8、水解溫度37℃、酶與底物質(zhì)量比1∶50。在此條件下制備得到的EYPH可以顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，增殖率為129.89%，MC3T3-E1中ALP活力提高了9.1%，該細(xì)胞中OC的分泌量增加了2 mg/m L，刺激MC3T3-E1中RUNX2的基因表達(dá)量極顯著的提高了6.12倍，促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生。綜上所述，EYPH具有顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化和礦化的作用，具有潛在的促進(jìn)骨形成的作用，為開發(fā)預(yù)防骨質(zhì)疏松的功能產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

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Preparation of Egg Yolk Protein Hydrolysate and Its Effect on Proliferation and Differentiation of MC3T3-E1 Cells

CHEN Hongjie, JIN Yongguo, MA Meihu*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In this study, the hydrolysis conditions for preparing egg yolk protein hydrolysate (EYPH) from defatted egg yolk were optim ized based on the viability of MC3T3-E1 cells when cultured in the presence of EYPH. Additionally, we also evaluated the promoting effect of EYPH on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. The results showed that the hydrolysis w ith trypsin alone yielded a product w ith stronger cell proliferation promoting activity than when it was used in combination w ith flavourzyme. The optimum hydrolysis conditions for trypsin were as follows: hydrolysis time, 6 h;temperature, 37 ℃; enzyme-to-substrate ratio, 1:50; and pH, 8.0. EYPH prepared under the optimized conditions increased the viability of MC3T3-E1 cells by 9.1% and the proportion of S-phase cells by 4.69% indicating that EYPH significantly increased the proliferation of MC3T3-E1 cells. EYPH significantly affected differentiation and mineralization of MC3T3-E1 cells as indicated by a 9.1% increase in alkaline phosphatase activity, an increase in osteocalcin secretion of 2 mg/m L, and the formation of more mineralized nodules of MC3T3-E1. Furthermore, EYPH also could stimulate the expression level of RUNX2 gene by 6.12 times. These finding showed that EYPH could significantly promote proliferation and differentiation in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Therefore, EYPH has the potential to be used as a functional food ingredient for its antiosteoporosis activity.

egg yolk protein hydrolysate; hydrolysis conditions; MC3T3-E1 cells; proliferation; differentiation

10.7506/spkx1002-6630-201722015

TS253.9

A

1002-6630（2017）22-0095-07

陳宏杰, 金永國(guó), 馬美湖. 雞蛋黃蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物制備及其對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化的影響[J]. 食品科學(xué), 2017,38(22): 95-101. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722015. http://www.spkx.net.cn

CHEN Hongjie, JIN Yongguo, MA Meihu. Preparation of egg yolk protein hydrolysate and its effect on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells[J]. Food Science, 2017, 38(22): 95-101. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722015. http://www.spkx.net.cn

2016-10-10

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303084）

陳宏杰（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榈捌房茖W(xué)。E-mail：598734780@qq.com

*通信作者：馬美湖（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品科學(xué)與技術(shù)。E-mail：mameihuhn@163.com