姚 婷，黃津津，任向峰，張 燕，何欣萌，王友升*

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)，北京 100048）

5 株櫻桃果實(shí)采后病原真菌分離及rDNA ITS區(qū)序列分析

姚 婷，黃津津，任向峰，張 燕，何欣萌，王友升*

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)，北京 100048）

從采后貯藏過(guò)程中自然發(fā)病的“拉賓斯”、“紅燈”櫻桃果實(shí)中分離到5 株絲狀病原真菌319#、323#、367#、369#和370#。對(duì)分離得到的菌株純化、回接、再分離純化，并觀察菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)。提取5 株病原真菌DNA，PCR擴(kuò)增rDNA ITS區(qū)序列后測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。綜合形態(tài)學(xué)特征和rDNA ITS區(qū)序列鑒定分析結(jié)果，得到菌株319#為匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、菌株323#為蘋(píng)果果腐病菌（Diaporthe perniciosa）、菌株367#為黑附球菌（Epicoccum nigrum）、菌株369#為核果褐腐病菌（Monilinia laxa）和菌株370#為圓孤青霉菌（Penicillium cyclopium），其中D. perniciosa、E. nigrum和P. cyclopium為在櫻桃果實(shí)上首次分離到的病原真菌。

櫻桃；病原真菌；形態(tài)學(xué)觀察；rDNA ITS區(qū)序列分析

櫻桃（Cerasus pseudocerasus）果實(shí)富含維生素、鈣、鐵、磷及鉀等多種元素，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，但由于櫻桃皮薄多汁，果實(shí)在采后貯藏過(guò)程中易受微生物侵染而發(fā)生品質(zhì)裂變[1-2]。據(jù)報(bào)道，導(dǎo)致櫻桃果實(shí)采后貯藏期間腐爛損失嚴(yán)重的病原真菌有灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers. ex Fr.）引起的灰霉病、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）引起的軟腐病、鏈核盤(pán)菌（Monilinia sp.）引起的褐腐病、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病和鏈格孢菌（A lternaria alternata）引起的交鏈孢霉腐病等[3-4]。目前對(duì)引起櫻桃采后病害的其他病原微生物，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。

rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（in ternal transc ribed spacer，ITS）存在保守序列和可變序列，利用可變區(qū)分化程度高、變異性強(qiáng)的特點(diǎn)可從分子水平上解決真菌分類鑒定及進(jìn)化水平上的差異性問(wèn)題[5-7]?？赏ㄟ^(guò)分析較短的rDNA ITS區(qū)序列信息，快速有效地對(duì)真菌進(jìn)行分類鑒定，而被廣泛應(yīng)用，rDNA ITS區(qū)序列是真菌鑒定的有效途徑[8-9]。但目前未見(jiàn)利用rDNA ITS區(qū)序列分析技術(shù)系統(tǒng)研究櫻桃果實(shí)采后病原真菌的報(bào)道。

本研究從采后櫻桃果實(shí)上分離得到5 株絲狀真菌，結(jié)合菌落和個(gè)體形態(tài)學(xué)特征及rDNA ITS區(qū)序列分析，發(fā)現(xiàn)了引起甜櫻桃果實(shí)采后病害的新病原微生物，以期進(jìn)一步豐富櫻桃果實(shí)采后病原微生物的種類的同時(shí)，為櫻桃果實(shí)采后病害的生物防治供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

從采后貯藏過(guò)程中自然發(fā)病“拉賓斯”櫻桃果實(shí)中分離到2 株絲狀真菌319#、323#，“紅燈”櫻桃果實(shí)中分離到3 株絲狀真菌367#、369#和370#。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂（potato dex trose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮后切片，稱取200 g，加1 L無(wú)菌水煮沸30 m in后，過(guò)濾取汁液，向?yàn)V液中加入瓊脂18 g、葡萄糖20 g、最后加水補(bǔ)足至1 L，在高溫高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 m in。

麥芽浸粉瓊脂（malt extract agar，ME）培養(yǎng)基：麥芽浸粉20 g、瓊脂18 g，調(diào)節(jié)pH值至5.5±0.2，在高溫高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 m in。

1.1.3 試劑

DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2×Taq PCR Master M ix、MarkerⅦ、6×Loading Buffer（溴酚藍(lán)） 天根生化試劑公司；通用引物ITS-4和ITS-5由Invitrogen公司負(fù)責(zé)合成。十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸鈉（sodium ethylene diam ine tetracetate，EDTA） 美國(guó)Amersco公司；乙醇、鹽酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

微量移液器 美國(guó)Effendorf公司；HQ45恒溫?fù)u床武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限公司；Imager 2200凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)ALpha公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；4 ℃預(yù)冷離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；生物安全柜美國(guó)Thermo公司；Axio Image A 1顯微鏡 德國(guó)Zeiss公司；PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離、純化與回接[10]

分離：取發(fā)病櫻桃果實(shí)的發(fā)病、健康交界處組織于PDA固體培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)3 d。

純化：取分離菌邊緣菌塊，分別三點(diǎn)轉(zhuǎn)接到PDA和ME培養(yǎng)基平板上，于25 ℃培養(yǎng)14 d，觀察7 d和14 d菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)特征。

回接：挑選健康無(wú)損傷的櫻桃果實(shí)，75%乙醇溶液表面消毒，用無(wú)菌接種針刺孔，取純化后的菌塊接種至傷口處，觀察果實(shí)接種處的病癥。

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察

從分離得到生長(zhǎng)于PDA上的菌落外沿取菌塊分別三點(diǎn)轉(zhuǎn)接到到PDA和ME培養(yǎng)基上，于25 ℃條件下培養(yǎng)14 d，分別于7 d和14 d觀察菌落形態(tài)、色澤等。培養(yǎng)期間，若培養(yǎng)基上長(zhǎng)出孢子，于潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，將插片培養(yǎng)的蓋玻片置染色液中，置于顯微鏡下觀察菌落產(chǎn)生分生孢子及分生孢子梗的形狀、色澤，分生孢子隔膜等性狀[11]。

1.3.3 基因組DNA的提取及ITS區(qū)PCR擴(kuò)增

基因組DNA的提?。翰捎酶牧己骃DS-氯化芐法提取待鑒定菌株的基因組DNA[7]作為PCR模板。

ITS區(qū)PCR擴(kuò)增：以真菌rDNA ITS區(qū)的通用引物ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS-5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）作為PCR擴(kuò)增引物。25 μL 2×Taq PCR MasterM ix、ITS4和ITS5兩條正反向引物各4 μL和5 μL基因組模板、12 μL ddH2O，將體系混勻。在PCR儀中94 ℃預(yù)變性3 m in，94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃再延伸10 min；30 個(gè)循環(huán)。

反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物加1 μL 6×Loading Buffer（溴酚藍(lán)）混勻，進(jìn)行染色。將染色后的樣品加到1.0%瓊脂糖凝膠膠孔中，180 V、180 m A條件下電泳30 m in，電泳后在EB染液中染色10 m in后于紫外燈下觀察電泳條帶。

1.3.4 測(cè)序結(jié)果分析

PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行脫鹽、純化和雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在CExpress軟件中進(jìn)行序列拼接，將拼接結(jié)果在網(wǎng)站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進(jìn)行核酸比對(duì)[10]，根據(jù)比對(duì)結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中找目的菌株同源序列，通過(guò)MEGA 6軟件進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與回接

圖1 5 株病原真菌分離與回接病癥Fig. 1 Naturally and artificially infected fruits

從采后自然發(fā)病的“拉賓斯”櫻桃果實(shí)中分離到絲狀真菌319#和323#，從“紅燈”櫻桃果實(shí)中分離到367#、369#和370#（圖1a1～e1），純化后回接到健康無(wú)傷的相應(yīng)品種的櫻桃果實(shí)上，在接種部位均出現(xiàn)相同的病癥（圖1a2～e2），并能從該病害部位再次分離得到相應(yīng)病原菌，因此，可確定上述5種絲狀真菌均為櫻桃果實(shí)致病菌。

2.2 病原菌的形態(tài)觀察

2.2.1 菌落形態(tài)

圖2 5 株櫻桃果實(shí)采后絲狀病原真菌分別在PDA和ME培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7、14 d的菌落特征Fig. 2 Colony grow th of five fungal pathogens cu ltured on ME and PDA p lates at 25 ℃ for 7 and 14 days

由圖2可以看出，5 株病原菌在PDA和ME培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)條件下均生長(zhǎng)旺盛，但菌落形態(tài)差異較大?！袄e斯”櫻桃上分離的菌株319#和323#菌絲呈白色，外觀干燥，不透明（圖2a1、a2、b1、b2），其中菌株319#菌絲長(zhǎng)而疏松，氣生的匍匐菌絲分布在培養(yǎng)基表層（圖2a1、a2）。而菌株323#菌絲質(zhì)地緊密，呈溝紋狀（圖2b1、b2），但這兩種菌繼續(xù)培養(yǎng)至14 d菌落形態(tài)并無(wú)明顯變化。

“紅燈”櫻桃上分離的菌株367#、369#和370#在PDA和ME培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d后，兩種培養(yǎng)基上菌落形態(tài)較一致，菌落質(zhì)地緊密且菌絲較短。比較而言，菌株367#在PDA和ME培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌絲均長(zhǎng)到2/3平板，呈橙黃色（圖2c1、c2），14 d后，菌絲顏色均加深并分布在板上的面積增大（圖2c3、c4）。而菌株369#在PDA上7 d后已經(jīng)鋪滿板，而ME培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)到2/3平板，呈棕褐色（圖2d1、d2），但14 d后，菌絲顏色均加深并分布在板上的面積增大（圖2d3、d4）。菌株370#在PDA和ME培養(yǎng)基上菌絲零星滿板，菌落呈灰綠色（圖2e1、e2），14 d后，菌絲顏色均加深并分布在板上的面積增大（圖2e3、e4）。

2.2.2 顯微形態(tài)

圖3 5 株病原菌真菌的顯微形態(tài)觀察Fig. 3 M orphological characteristics of five pathogenic fungi

圖3顯示了5種絲狀病原真菌在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d后菌絲及孢子形態(tài)觀察。結(jié)果表明，5 株病原菌菌絲均多分枝且內(nèi)部具有隔膜，菌絲與孢子梗有明顯的區(qū)別。其中菌株319#、323#、367#和370#菌絲細(xì)且著色淺，而菌株369#菌絲較粗且著色深（圖3a1～e1）。菌株319#、323#、369#和370#孢子形態(tài)各異，而菌株367#未觀察到孢子（圖3a2～e2）。比較而言，菌株319#分生孢子穗呈球形，黑色或黑褐色，分生孢子梗光滑頂囊膨大，分生孢子粗糙，常具黑褐色條紋（圖3a2）。菌株323#菌絲上生出許多橫隔，內(nèi)部灰色，然后從分隔處斷裂，產(chǎn)生梭形至橢圓形的雙細(xì)胞孢子（圖3b2）。菌株369#孢子梗有隔膜，頂端分枝，分生孢子單孢、串生且分枝較多，孢子球形或卵形，孢子壁光滑（圖3d2）。菌株370#分生孢子梗從菌絲垂直生出，有橫隔，頂端生排列成帚狀分生孢子串呈不分枝的鏈狀，單個(gè)孢子球狀、卵圓形或橢圓形，綠色（圖3e2）。

本研究分離到的5 株絲狀真菌與《真菌鑒定手冊(cè)》等文獻(xiàn)[12-13]中的菌落、菌絲和孢子形態(tài)描述進(jìn)行比較，確定319#屬于藻菌綱、毛霉目、毛霉科的根霉屬；323#屬于子囊菌綱、鹿角菌目、腐皮殼科的腐皮殼屬；367#屬于殼霉目、杯霉科、黑附球菌，369#屬于半知菌類從梗孢目、從梗孢科、串珠霉屬的核果褐腐串珠霉；370#屬于半知菌類從梗孢目、從梗孢科的青霉屬。

2.3 基因組DNA的PCR擴(kuò)增

圖4 5 株病原真菌的ITS區(qū)rDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖譜Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of ITS rDNA sequence of five pathogenic fungi

5 株病原真菌ITS區(qū)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測(cè)結(jié)果表明，不同菌株序列長(zhǎng)度存在差異，其中菌株369#、323#、367#和370#在500～600 bp之間，而菌株319#片段在900 bp左右（圖4）。這可能由于rDNA ITS區(qū)存在長(zhǎng)度和序列多態(tài)性[8]。

2.4 構(gòu)建ITS區(qū)r DNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將5 株菌株ITS區(qū)測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相似度達(dá)97%以上的同源序列，通過(guò)MEGA 6軟件Bootstraps功能計(jì)算目的菌株所在進(jìn)化樹(shù)各分枝的置信度，發(fā)現(xiàn)5 株病原真菌分別屬于5個(gè)不同的屬。

圖5 以ITS rDNA基因序列為分子標(biāo)記的5 株菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic tree for each fungal strain based on ITS rDNA sequence

菌株319#在NCBI網(wǎng)站上比對(duì)只出現(xiàn)根霉屬，進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，319#與匍枝根霉（R. stolonifer）（JQ991620.1）在同一分支上，置信度支持率可達(dá)94%（圖5a）。

菌株323#序列與腐皮殼屬D iaporthe、鏈格孢屬Alternaria、擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis相關(guān)菌株均具有較高相似度，但與腐皮殼屬Diaporthe的一個(gè)亞種相似度最高，找相應(yīng)屬的同源序列，對(duì)目的序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析，323#與蘋(píng)果果腐病菌（D. perniciosa）（HQ908492.1）在同一個(gè)分支上，通過(guò)Bootstraps的驗(yàn)證表明它們的置信度支持率可達(dá)75%（圖5b）。

菌株367#在NCBI中的比對(duì)結(jié)果顯示只與黑附球菌（E. nigrum）具有很高的相似度，進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示367#與黑附球菌這個(gè)種的菌株E. nigrum（GU014950.1）在同一分枝上，與該菌株在進(jìn)化過(guò)程中的親緣性最近，置信度支持率可達(dá)93%（圖5c）。

菌株369#在NCB I同源性比對(duì)過(guò)程中與灰霉屬Botrytis、鏈核盤(pán)菌屬M(fèi)onilinia、核盤(pán)霉屬Sclerotinia相關(guān)菌株具有較高相似度，但與鏈核盤(pán)菌屬M(fèi)onilinia相似度最高，找3個(gè)屬的同源序列，進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，369#與M. laxa（KC515383.1）在同一分枝上，置信度支持率可達(dá)83%（圖5d）。

菌株370#在NCBI網(wǎng)站上比對(duì)只出現(xiàn)青霉屬，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)370#為圓孤青霉菌，與菌株P(guān). cyclopium（KJ783269.1）在同一分枝上，且置信度支持率達(dá)100%（圖5e）。

綜上所述，分離得到的5 株病原真菌，rDNA ITS區(qū)序列鑒定結(jié)果為：菌株319#匍枝根霉（R. stolonifer）、菌株323#蘋(píng)果果腐病菌（D. perniciosa）、菌株367#黑附球菌（E. nigrum）、菌株369#核果褐腐病菌（M. laxa）和菌株370#圓孤青霉菌（P. cyclopium）。

3 討 論

據(jù)報(bào)道，櫻桃果實(shí)的病原菌主要有褐腐病菌[2]、灰霉病菌[4]、鏈格孢菌[14]、軟腐病菌[15]和青霉病菌[16]等，前期的研究中也分離到了灰葡萄病菌（B. cinerea）和鏈格孢菌（A. a lternata）（結(jié)果待發(fā)表）。本研究從采后貯藏期間“拉賓斯”櫻桃果實(shí)上分離到匍枝根霉（R. stolonifer）（菌株319#），何煜波等[15]也從甜櫻桃果實(shí)上分離到R. stolonifer，且該病原菌還能夠引起橘子、梨、葡萄和油桃[17-20]等果實(shí)軟腐病。此外，本研究分離到的蘋(píng)果果腐病菌（D. perniciosa）能夠侵染采后貯藏期間的蘋(píng)果果實(shí)[21-22]，但鮮見(jiàn)該菌侵染采后貯藏期間櫻桃果實(shí)的報(bào)道。

類似地，從“紅燈”櫻桃果實(shí)上分離到的核果鏈核盤(pán)菌（M. laxa）（菌株369#），據(jù)報(bào)道該病原菌與該屬的美澳型核果鏈核盤(pán)菌（M. fructicola）均能侵染桃、杏、油桃和櫻桃等核果果實(shí)而導(dǎo)致褐腐病[23-25]，表明鏈核盤(pán)菌屬（Monilinia）中關(guān)系較近的這兩種真菌的寄主特異性并不明顯。

此外，本研究從“紅燈”櫻桃果實(shí)上分離到圓弧青霉（P. cyclopium）（菌株370#），該菌在食品工業(yè)中主要用于生產(chǎn)葡萄糖酶，也可侵染蘋(píng)果、番茄等果實(shí)[26-27]，而引起櫻桃果實(shí)青霉病的主要是擴(kuò)展青霉（P. expansum）[28]，但鮮見(jiàn)P. cyclopium侵染櫻桃果實(shí)的報(bào)道。類似的，本研究分離到的黑附球菌（E. nigrum）（菌株367#）可侵染采后脫水干癟的葡萄果實(shí)[29]，也可作為拮抗菌來(lái)防治桃果實(shí)的褐腐病菌[30]，但鮮見(jiàn)侵染櫻桃果實(shí)的報(bào)道。

4 結(jié) 論

從櫻桃上分離得到的5 株病原真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及rDNA ITS區(qū)序列進(jìn)化樹(shù)分析分別鑒定為匍枝根霉（R. stolonifer）、蘋(píng)果果腐病菌（D. perniciosa）、黑附球菌（E. nigrum）、核果褐腐病菌（M. laxa）和圓孤青霉（P. cyclopium）。目前鮮見(jiàn)D. perniciosa、E. nigrum和P. cyclopium侵染櫻桃果實(shí)的報(bào)道，為櫻桃果實(shí)采后貯藏期間分離到的病原真菌。

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Morphological Characterization and rDNA ITS Sequence Analysis of Five Pathogenic Fungi Isolated from Cherry Fruits

YAO Ting, HUANG Jinjin, REN Xiangfeng, ZHANG Yan, HE Xinmeng, WANG Yousheng*
(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Laboratory for Food Quality and Safety,Beijing Technology & Business University (BTBU), Beijing 100048, China)

Five fungal strains isolated from naturally infected cherry fruit were purified, re-inoculated and identified as pathogens of cherry fruits. The results of morphological characterization and ribosomal DNA internal transcribed spacer(rDNA-ITS) analysis showed that strain 319#, 323#, 367#, 369#and 370#were identified as Rhizopus stolonifer, Diaporthe perniciosa, Epicoccum nigrum, Monilinia laxa and Penicillium cyclopium, respectively. In this study, D. perniciosa,E. nigrum and P. cyclopium were isolated from cherry fruits for the fi rst time.

cherry fruit; pathogenic fungi; morphological characterization; rDNA ITS sequence analysis

10.7506/spkx1002-6630-201722012

Q93-331

A

1002-6630（2017）22-0074-06

姚婷, 黃津津, 任向峰, 等. 5 株櫻桃果實(shí)采后病原真菌分離及rDNA ITS區(qū)序列分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22): 74-79.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722012. http://www.spkx.net.cn

YAO Ting, HUANG Jinjin, REN Xiangfeng, et al. Morphological characterization and rdna its sequence analysis of five pathogenic fungi isolated from cherry fruits[J]. Food Science, 2017, 38(22): 74-79. (in Chinese w ith English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722012. http://www.spkx.net.cn

2017-05-15

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD16B06）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471626）

姚婷（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：yaoting0127@163.com

*通信作者：王友升（1976—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楣呔G色保鮮及其高值化。E-mail：wangys@btbu.edu.cn