昝珂　黃莉莉　過(guò)立農(nóng)　劉杰　鄭健　馬雙成　錢正明　李文佳

[摘要]采用高效液相色譜法建立冬蟲(chóng)夏草野生及人工繁育品的特征圖譜，并同時(shí)測(cè)定4種主要核苷的含量。以尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷和腺苷等4種成分為對(duì)照品，采用Waters XSelect HSS T3 C18 （46 mm×250 mm， 5 μm）； 水（A） 乙腈 （B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～5 min，0% B；5～15 min，0～10% B，15～30 min，10%～20% B ；30～33 min，20%～50% B； 33～35 min，50%～0% B；35～40 min，0% B），流速06 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL，建立冬蟲(chóng)夏草野生品和人工繁育品的特征圖譜，并同時(shí)測(cè)定4種主要核苷的含量。冬蟲(chóng)夏草人工繁育品和野生品之間特征圖譜和4種主要核苷含量均無(wú)顯著性差異，該研究能夠?yàn)槎x(chóng)夏草人工繁育品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]冬蟲(chóng)夏草； 野生品； 人工繁育品； 特征圖譜； 核苷； 高效液相色譜

[Abstract]This study is to establish the HPLC specific chromatogram and determine four main nucleosides of wild and cultivated Cordyceps sinensis Uridine， inosine， guanosine and adenosine were selected as reference substance HPLC analysis was performed on a Waters XSelect HSS T3 C18 （46 mm×250 mm， 5 μm）， with a mobile phase consisting of water（A）acetonitrile （B） at a flow rate of 06 mL·min-1 （05 min，0% B；515 min，0%10% B， 1530 min，10%20% B， 3033 min， 20%50% B， 3335 min， 50%0% B， 3540 min， 0% B） The detection wavelength was 260 nm and the column temperature was controlled at 30 ℃， and the injection volume was 5 μL HPLC specific chromatogram of wild and cultivated C sinensis was established and four main nucleosides were simultaneously determined by the above method Specific chromatograms and contents of four main nucleosides showed no significant differences between cultivated and wild C sinensis These results can provide scientific evidences for further development and utilization of cultivated C sinensis.

[Key words]Cordyceps sinensis； wild； cultivated； specific chromatograms； nucleosides； HPLC

冬蟲(chóng)夏草為麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草菌Cordyceps sinensis （BerK） Sacc寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座和幼蟲(chóng)尸體的干燥復(fù)合體，主要分布在我國(guó)青海、西藏、甘肅、云南和四川等高海拔地區(qū)，是傳統(tǒng)的名貴中藥材，在中國(guó)有悠久的藥用歷史，具有補(bǔ)腎益肺、止血化痰的功效[13]。近年來(lái)，冬蟲(chóng)夏草的人工繁育技術(shù)獲得突破，為冬蟲(chóng)夏草野生資源稀缺可持續(xù)發(fā)展提供了一條途徑[4]。核苷類成分是冬蟲(chóng)夏草的主要活性成分，具有明顯的藥理活性，《中國(guó)藥典》以腺苷為含量測(cè)定指標(biāo)[513]。冬蟲(chóng)夏草的核苷類成分研究較多，但野生品和人工繁育品之間的特征圖譜和主要成分含量比較的研究較少。本文建立冬蟲(chóng)夏草野生品和人工繁育品的HPLC特征圖譜，并進(jìn)行相似度比較；同時(shí)測(cè)定尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷和腺苷等4種主要核苷的含量，為冬蟲(chóng)夏草人工繁育品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)使用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料

11儀器

1260型高效液相色譜儀（安捷倫公司），二極管陣列檢測(cè)器（安捷倫公司），QUINTIX3131CN型1/1萬(wàn)電子天平（Sartorius公司），MSE125S型1/10萬(wàn)電子天平（Sartorius公司），KQ300DV型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司），MilliQ純水儀（密理博公司）。

12試藥

對(duì)照品尿苷（批號(hào)110887200202）、肌苷（批號(hào)140669201305）、鳥(niǎo)苷（批號(hào)111977201501）和腺苷（批號(hào)110879200202）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；HPLCDAD（面積歸一化法）檢測(cè)純度均大于980%。甲醇和乙腈為色譜純（Fisher公司），試驗(yàn)用水為超純水。

13藥材

野生冬蟲(chóng)夏草1～26采自于西藏自治區(qū)、青海省、四川省、甘肅省、云南?。欢x(chóng)夏草人工繁育品1～20）由廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司提供；蛹蟲(chóng)草1～2采自廣東省和天津市；發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉（Cs4）1～2采自江西省；發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉（CsCQ80）1～2采自浙江省。

實(shí)驗(yàn)樣品均經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所鄭健研究員鑒定；冬蟲(chóng)夏草人工繁育品和野生品鑒定為麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草菌C sinensis寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座和幼蟲(chóng)尸體的干燥復(fù)合體；蛹蟲(chóng)草鑒定為麥角菌科真菌蛹蟲(chóng)草C militaris L Link的子實(shí)體；發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉（Cs4）為麥角菌科真菌蝙蝠蛾擬青霉Paeailonyces hepialid Chen Cs4菌株，經(jīng)生物工程液體深層發(fā)酵所得菌絲體的干燥粉末；發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉為CsCQ80中華被毛孢Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yuet Zeng （1989） 經(jīng)液體深層發(fā)酵所得菌絲體的干燥粉末。endprint

2方法與結(jié)果

21溶液的制備

211混合對(duì)照品溶液的制備

取尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷和腺苷對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含尿苷、鳥(niǎo)苷、肌苷和腺苷分別為5025，4840，4675，2030 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加水制成每1 mL含尿苷、鳥(niǎo)苷、肌苷和腺苷分別為5025，4840，4675，2030 μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

212供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約02 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水10 mL，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz，20 ℃以下）30 min，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

23色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱Waters Xselect HSS T3 C18（46 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相水（A）乙腈（B）梯度洗脫（0～5 min，0% B；5～15 min，0%～10% B；15～30 min，10%～20% B；30～33 min，20%～50% B； 33～35 min，50%～0% B；35～40 min，0% B）；流速 06 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng) 260 nm；柱溫 30 ℃。

24特征圖譜

241冬蟲(chóng)夏草特征圖譜的建立

取冬蟲(chóng)夏草野生品1～26和人工繁育品1～20粉末，精密稱定，按22項(xiàng)方法制備供試品溶液，精密吸取5 μL，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄40 min的HPLC色譜圖，轉(zhuǎn)換成AIA格式，采用導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012130723版本，下稱“指紋圖譜軟件”）見(jiàn)圖1，2。26批野生冬蟲(chóng)夏草的色譜圖生成對(duì)照特征圖譜見(jiàn)圖3；以此野生冬蟲(chóng)夏草對(duì)照特征圖譜為參照?qǐng)D譜計(jì)算野生品、人工繁育品、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉（Cs4）、發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉（CsCQ80）及蛹蟲(chóng)草的相似度，結(jié)果見(jiàn)表1，2。

從下到上分別為對(duì)照特征圖譜、野生冬蟲(chóng)夏草1～26。

從下到上分別為對(duì)照特征圖譜，冬蟲(chóng)夏草人工繁育品1～20，發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉，發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉蛹蟲(chóng)草。

242特征峰的標(biāo)定

根據(jù)26批冬蟲(chóng)夏草野生品的特征圖譜檢測(cè)結(jié)果，共標(biāo)定12個(gè)特征峰。經(jīng)過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，可知5號(hào)峰為尿苷，7號(hào)峰為肌苷，8號(hào)峰為鳥(niǎo)苷，10號(hào)峰為腺苷；經(jīng)文獻(xiàn)分析，1號(hào)峰為尿嘧啶，2號(hào)峰為酪氨酸，3號(hào)峰為次黃嘌呤，4號(hào)峰為黃嘌呤，6號(hào)峰為2′去氧尿苷，9號(hào)峰為胸苷，11號(hào)峰為2′脫氧腺苷，12號(hào)峰為色氨酸。

243方法學(xué)考察

2431精密度試驗(yàn)精密吸取野生冬蟲(chóng)夏草1供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖。以腺苷為參照峰，計(jì)算特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<10%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對(duì)峰面積RSD<20%，采用指紋圖譜軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度為099，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2432穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取野生冬蟲(chóng)夏草1供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h，按3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以腺苷為參照峰，計(jì)算特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<10%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對(duì)峰面積RSD<20%，采用指紋圖譜軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度為099，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2433重復(fù)性試驗(yàn)精密吸取野生冬蟲(chóng)夏草1供試品溶液6份，精密稱定，按22項(xiàng)方法分別制備供試品溶液，按3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以腺苷為參照峰，計(jì)算特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對(duì)峰面積RSD<2%，采用指紋圖譜軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度為099，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好。

244野生品和人工繁育品特征圖譜比較

建立的HPLC特征圖譜能夠區(qū)別冬蟲(chóng)夏草及發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉（Cs4）、發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉（CsCQ80）和蛹蟲(chóng)草。與對(duì)照特征圖譜相比，發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉（Cs4）的相似度為084～086，發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉（CsCQ80）為075～076，蛹蟲(chóng)草為079～080，三者相似度均小于09。而46批冬蟲(chóng)夏草的相似度均在09以上，26批野生冬蟲(chóng)夏草的相似度在091以上，20批冬蟲(chóng)夏草人工繁育品的相似度均在094以上。冬蟲(chóng)夏草人工繁育品與野生冬蟲(chóng)夏草的特征圖譜基本一致。

25含量測(cè)定

251系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷和腺苷4種成分分離度大于15，理論塔板數(shù)大于1萬(wàn)，色譜圖見(jiàn)圖4。

252方法學(xué)考察

2521線性關(guān)系考察精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液01，02，05，10，20 mL分別置于5個(gè)10 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻各系列濃度的混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以各對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg·L-1）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表3，表明各化合物在相應(yīng)線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2522精密度試驗(yàn)精密吸取21項(xiàng)混合對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的峰面積的RSD分別為036%，029%，045%，048%（n=6），表明儀器精密度良好。

A 混合對(duì)照品溶液；B 野生品 ；C 人工繁育品；5尿苷； 7肌苷；8鳥(niǎo)苷；10腺苷。

2523重復(fù)性試驗(yàn)取樣品粉末（野生品1）6份，分別按照22項(xiàng)方法制備供試品溶液，按3項(xiàng)色譜方法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果各份供試品溶液的尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的測(cè)定結(jié)果RSD（n=6）分別為089%，096%，078%，12%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。endprint

2524溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液（野生品1），分別于0，2，4，8，12 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的峰面積的RSD（n=6）分別為038%，035%，079%，091%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2525加樣回收試驗(yàn)取已知含量的1號(hào)冬蟲(chóng)夏草野生品粉末6份，每份約01 g，置具塞錐形瓶中，精密加入各對(duì)照品溶液（尿苷2010 mg·L-1、肌苷1936 mg·L-1、鳥(niǎo)苷935 mg·L-1和腺苷7105 mg·L-1）各1 mL，分別按照22項(xiàng)方法制備供試品溶液，按3項(xiàng)色譜方法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率結(jié)果尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷和腺苷平均加樣回收率（n=6）分別為1016%，1025%，1023%，9860%，RSD分別為17%，15%，13%，17%。

2526樣品含量測(cè)定分別取野生冬蟲(chóng)夏草和人工繁育品，按22項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3討論

31色譜條件的選擇

本文采用梯度洗脫法分離冬蟲(chóng)夏草藥材中的4種主要核苷類成分，40 min內(nèi)完成分離，尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺苷分離效果良好，符合含量測(cè)定要求。本文通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器考察所測(cè)物質(zhì)紫外吸收，4種成分均為260 nm，故選擇260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相選擇乙腈水系統(tǒng)，以純水為起始溶劑梯度洗脫各色譜峰均實(shí)現(xiàn)基線分離，能夠達(dá)到定量要求。

32提取條件的選擇

冬蟲(chóng)夏草服用時(shí)多以水提取，加上核苷類成分極性大、水溶性好，流動(dòng)性以純水為起始梯度，提取溶劑中存在有機(jī)相容易導(dǎo)致色譜圖鼓包，本試驗(yàn)選擇以純水為溶劑制備供試品溶液。由于部分核苷類成分熱穩(wěn)定性差，超聲提取時(shí)加冰塊以避免核苷分解。

33含量測(cè)定結(jié)果分析

采用SPSS 190軟件處理20批冬蟲(chóng)夏草人工繁育品和26批野生冬蟲(chóng)夏草的4種主要核苷（尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷和腺苷）的含量測(cè)定結(jié)果。冬蟲(chóng)夏草人工繁育品和野生品2個(gè)樣本組，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示無(wú)顯著性差異；通過(guò)主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖5，2組樣本之間分布均勻，結(jié)果顯示野生品和人工繁育品2組之間4種主要核苷含量均無(wú)顯著性差異。

本研究建立冬蟲(chóng)夏草野生品和人工繁育品的特

征圖譜，并同時(shí)測(cè)定4種主要核苷類成分，并進(jìn)行了比較分析，為冬蟲(chóng)夏草藥材質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。冬蟲(chóng)夏草人工繁育品和野生品核苷類成分

基本一致，其他類型化學(xué)成分以及藥理活性尚需進(jìn)一步研究。

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[責(zé)任編輯丁廣治]endprint