李學(xué)鵬，劉慈坤，周明言，王金廂，朱文慧，徐永霞，儀淑敏，林 洪，李鈺金，勵(lì)建榮,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；3.榮成泰祥食品股份有限公司，山東 榮成 264300）

羥自由基氧化對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和凝膠性質(zhì)的影響

李學(xué)鵬1，劉慈坤1，周明言1，王金廂1，朱文慧1，徐永霞1，儀淑敏1，林 洪2，李鈺金3，勵(lì)建榮1,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；3.榮成泰祥食品股份有限公司，山東 榮成 264300）

以草魚(yú)肉為研究對(duì)象，采用芬頓反應(yīng)體系（H2O2濃度分別為0.1、1.0、5.0、10.0 mmol/L）產(chǎn)生不同濃度·OH對(duì)其肌原纖維蛋白進(jìn)行模擬氧化，研究·OH氧化對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及凝膠性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，氧化使肌原纖維蛋白羰基含量顯著增加（P＜0.05），當(dāng)氧化劑H2O2的濃度為10.0 mmol/L時(shí)，羰基含量比對(duì)照組增加了111.35%；隨著H2O2濃度的提高，肌原纖維蛋白總巰基、活性巰基、游離氨基含量顯著下降（P＜0.05）；二聚酪氨酸水平和表面疏水性顯著增加（P＜0.05）。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明氧化使蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交聯(lián)和聚集，產(chǎn)生了分子質(zhì)量大于200 ku的蛋白聚集體。可見(jiàn)，·OH氧化使草魚(yú)肌原纖維蛋白中巰基、酪氨酸、色氨酸等氨基酸殘基發(fā)生了顯著氧化修飾，蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生了交聯(lián)和聚集，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了顯著變化。此外，氧化可進(jìn)一步影響肌原纖維蛋白的凝膠性質(zhì)，使其凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變疏松、凝膠孔隙增大，凝膠中部分不易流動(dòng)水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?，最終導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度和凝膠持水性顯著降低。

草魚(yú)；肌原纖維蛋白；蛋白質(zhì)氧化；結(jié)構(gòu)特征；凝膠性質(zhì)

近年來(lái)全球魚(yú)糜制品產(chǎn)量和消費(fèi)量高速增長(zhǎng)，我國(guó)魚(yú)糜制品產(chǎn)量更是以25%的年均增長(zhǎng)率遞增，魚(yú)糜制品成為我國(guó)增長(zhǎng)速度最快的水產(chǎn)加工品之一。傳統(tǒng)生產(chǎn)魚(yú)糜的原料主要是鱈魚(yú)等海水魚(yú)類，但海洋魚(yú)類資源日益缺乏，已不能滿足各國(guó)對(duì)魚(yú)糜制品的消費(fèi)需求。草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）又名鯇魚(yú)、草混，屬鯉形目、鯉科、草魚(yú)屬，是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，與青、鰱、鳙魚(yú)并稱為“四大家魚(yú)”[1-2]。草魚(yú)資源豐富，2014年全國(guó)總產(chǎn)量達(dá)537.68萬(wàn) t，且價(jià)格低，是生產(chǎn)魚(yú)糜制品的良好原料[3]。

為提高淡水魚(yú)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)淡水魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度的影響因素進(jìn)行了大量的研究，但研究主要集中在加工工藝、環(huán)境因素及添加物等方面[4]。隨著蛋白質(zhì)氧化成為食品化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，魚(yú)肉中的蛋白質(zhì)氧化及其對(duì)魚(yú)糜凝膠特性的影響也逐漸被關(guān)注[5]。蛋白質(zhì)在過(guò)渡態(tài)金屬離子、O2-·以及脂質(zhì)氧化副產(chǎn)物作用下發(fā)生氧化，導(dǎo)致其骨架、側(cè)鏈以及蛋白質(zhì)一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)（如溶解性、乳化性和凝膠性等）及肉類食用品質(zhì)（嫩度、多汁性、風(fēng)味和色澤等）[6]。研究表明，適度氧化會(huì)增加肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度，而過(guò)度氧化會(huì)降低凝膠強(qiáng)度[7]。魚(yú)糜在生產(chǎn)過(guò)程中，魚(yú)肉蛋白質(zhì)受光照、氧化消毒劑、金屬離子、脂質(zhì)氧化等因素影響，會(huì)發(fā)生一定程度的蛋白質(zhì)氧化，進(jìn)而影響其凝膠性等功能性質(zhì)[8]。但目前有關(guān)肌原纖維蛋白氧化對(duì)凝膠性質(zhì)影響的研究主要集中在畜禽肉和海水魚(yú)等方面[9-11]，草魚(yú)肌原纖維蛋白氧化對(duì)其結(jié)構(gòu)特征和凝膠性質(zhì)的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以草魚(yú)為研究對(duì)象，提取肌原纖維蛋白，采用不同濃度的芬頓氧化體系產(chǎn)生·OH對(duì)其進(jìn)行模擬氧化，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)中羰基、巰基、游離氨基含量，二聚酪氨酸水平，表面疏水性，內(nèi)源熒光以及凝膠品質(zhì)（凝膠強(qiáng)度、持水性、微觀結(jié)構(gòu)、水分分布）等指標(biāo)，研究氧化對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及其凝膠性質(zhì)的影響，為從蛋白質(zhì)氧化調(diào)控角度改善魚(yú)糜制品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活草魚(yú)購(gòu)于錦州市水產(chǎn)市場(chǎng)，平均體長(zhǎng)（32±5） cm、體質(zhì)量（480±50） g。

FeCl3、H2O2、抗壞血酸、鹽酸胍、乙酸乙酯、乙醇、尿素、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、乙醚、5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、8-苯胺基-1-萘磺酸銨（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS）、β-巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨（ammonium persulfate，APS）、溴酚藍(lán)、甘氨酸等，均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MS105DU分析天平、PL602-L電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2550紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；THZ-D型臺(tái)式恒溫振蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；970CRT熒光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；S4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、CR-400色彩色差計(jì) 日本Minolta公司；TA-XT Plus型質(zhì)構(gòu)分析儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；mDF-382E（CN）醫(yī)用低溫箱 大連三洋冷鏈有限公司；JHG-Q60-P100型實(shí)驗(yàn)室均質(zhì)機(jī) 上海融合機(jī)械設(shè)備有限公司；NMI20核磁共振成像儀 上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維的提取及氧化蛋白的制備

肌原纖維蛋白的提?。簠⒖嘉墨I(xiàn)[9]的方法，新鮮草魚(yú)電擊暈后宰殺去皮，取背部肌肉絞碎，加入5 倍體積的10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2），高速均質(zhì)3 次，每次30 s，在5 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，取沉淀，上述過(guò)程反復(fù)3 次，在最后一次沉淀中加入5 倍體積的10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.2），高速均質(zhì)，在5 000 r/min 、4 ℃條件下離心20 min，取上清液備用。

將制備的肌原纖維蛋白與不同濃度的芬頓溶液反應(yīng)（其中FeCl3、抗壞血酸濃度均為0.1 mmol/L，H2O2濃度分別為0.0、0.1、1.0、5.0、10.0 mmol/L），置于37 ℃避光條件下，在恒溫水浴中孵育24 h，并充分混勻，使魚(yú)蛋白發(fā)生不同程度的氧化。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液溫度迅速降到4 ℃以下，之后在冷凍干燥機(jī)中干燥，備用。

1.3.2 草魚(yú)肌原纖維蛋白氧化程度和結(jié)構(gòu)特征的測(cè)定與表征

1.3.2.1 羰基含量的測(cè)定

參考Oliver等[12]的方法并稍加修改。用10 mmol/L Tris-HCl（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.2）將氧化后的肌原纖維蛋白粉配成5 mg/mL溶液。取1 mL蛋白液放入塑料離心管并加入1 mL 10 mmol/L DNPH溶液（含2 mol/L HCl），室溫條件下避光靜置1 h（每隔15 min振蕩一次），添加3 mL 20% TCA后以10 000 r/min離心5 min，棄上清液，用1 mL乙酸乙酯-乙醇體積比1∶1洗沉淀3 次，加5 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，37 ℃保溫30 min溶解沉淀，以10 000 r/min離心5 min，最后獲得物在370 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.2.2 總巰基和活性巰基含量的測(cè)定

采用DTNB法[13]進(jìn)行測(cè)定。取1 mL 5 mg/mL蛋白溶液加入試管中，每管中加入9 mL、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（8 mol/L尿素、0.6 mol/L KCl、10 mmol/L EDTA，pH 7.0）。取4.5 mL上述混合液加入0.5 mL 0.1% DTNB，30 min后在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，即為總巰基的吸光度。而活性巰基含量的測(cè)定是在不存在尿素的情況下，將反應(yīng)混合液在4 ℃反應(yīng)30 min，然后在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

1.3.2.3 游離氨基含量的測(cè)定

參照Habeeb[14]的方法略加修改。取5 mg/mL的蛋白液1 mL加入到4 mL 0.1 mol/L的四氫硼酸鈉緩沖溶液（含1% SDS，pH 9.3）中，室溫條件下磁力攪拌2 h后10 000×g離心30 min。取上清液4 mL與1 mL 0.1% TNBS溶液混合均勻，隨后在37 ℃水浴中避光反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液中加入2 mL 0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值，最后取反應(yīng)液在335 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，對(duì)照為6 mL 20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液。

1.3.2.4 表面疏水性的測(cè)定

采用Saeed等[15]的方法并加以修改。將樣品用20 mmol/L含0.6 mol/L KCl的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）稀釋至0～1 mg/mL，加入25 μL 8 mmol/L ANS（用20 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制）后混合均勻，避光靜置10 min，然后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。測(cè)定條件為：激發(fā)波長(zhǎng)374 nm，狹縫5 nm，掃描范圍250～500 nm。以蛋白質(zhì)量濃度為橫軸、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，曲線初始斜率即為所求的表面疏水性指數(shù)。

1.3.2.5 二聚酪氨酸水平的測(cè)定

參考Davies等[16]方法。取5 mg/mL蛋白液1 mL，用pH 6.0濃度為20 mmol/L高離子強(qiáng)度的磷酸鹽緩沖液（含有0.6 mol/L的KCl）稀釋到1 mg/mL。溶液用濾紙過(guò)濾除去不溶性物質(zhì)，用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，然后再利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定二聚酪氨酸的吸光度，二聚酪氨酸水平用相對(duì)熒光值表示。測(cè)定條件：激發(fā)波長(zhǎng)選擇325 nm，發(fā)射波長(zhǎng)選擇420 nm，狹縫寬度均為10 nm，靈敏度為2。

1.3.2.6 內(nèi)源熒光的測(cè)定

準(zhǔn)確量取5 mg/mL的蛋白液1 mL加入9 mL 50 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液。采用F96型熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)295 nm條件下得到300～450 nm之間的發(fā)射光譜（靈敏度為2）。

1.3.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參考Xiong Youling L.等[17]的方法，分離膠12%、濃縮膠4%，還原劑為β-巰基乙醇，運(yùn)用Quantity One軟件進(jìn)行分析和處理。

1.3.3 草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠特性的測(cè)定

凝膠制作：將1.3.1節(jié)中得到的蛋白粉末，用Tris-HCl（含0.6mol/L NaCl，pH 7.2）將蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度稀釋到160 mg/mL，攪拌均勻后轉(zhuǎn)入25 mm×40 mm（直徑×高度）的玻璃杯中，保持厚度約為30 mm，40 ℃水浴保溫30 min后轉(zhuǎn)入90 ℃水浴鍋中保溫30 min，取出迅速冷卻后置于4 ℃冰箱中冷卻12 h后進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.1 凝膠白度的測(cè)定

參照Sánchez-González等[18]方法略作修改，測(cè)量前取出樣品，在室溫條件下恢復(fù)30 min，將凝膠樣品切成5 mm×5 mm×5 mm的方塊，采用色差計(jì)測(cè)定L*、a*和b*值。樣品測(cè)定3 次。白度值根據(jù)式（1）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3.2 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

用TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀對(duì)蛋白凝膠強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，采用P/5S探頭，參數(shù)設(shè)定為下壓距離8.0 mm，觸發(fā)力為10.0 g，測(cè)試前速率為1.0 mm/s，測(cè)試速率為1.0 mm/s，測(cè)試后速率為1.0 mm/s。

1.3.3.3 凝膠持水性的測(cè)定

[19]的方法，稱取5 g蛋白凝膠樣品，用濾紙包好固定在50 mL離心管中間，3 000 r/min離心10 min，稱量離心后的樣品質(zhì)量。凝膠持水性（waterholding capacity，WHC）根據(jù)式（2）計(jì)算。

式中：m1為離心前凝膠質(zhì)量/g；m2為離心后凝膠質(zhì)量/g。

1.3.3.4 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考文獻(xiàn)[20]的方法，采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。將肌原纖維蛋白凝膠切成大小均勻薄片，用2.5%、pH 6.8的戊二醛固定24 h，再用磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L，pH 7）漂洗3 次，每次10 min。然后分別采用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液梯度脫水，每次10 min，迅速放入冷凍干燥機(jī)中干燥。掃描時(shí)將粉末用雙面膠粘在掃描電子顯微鏡樣品臺(tái)上，用離子濺射鍍膜儀進(jìn)行離子濺射噴金，進(jìn)行掃描觀察。

1.3.3.5 凝膠中水分狀態(tài)的分析

參考文獻(xiàn)[21]的方法，采用低場(chǎng)核磁共振（low fieldnuclear magnetic resonance，LF-NMR）儀通過(guò)測(cè)定凝膠中水分的橫向弛豫時(shí)間T2進(jìn)行分析。將肌原纖維蛋白凝膠切成5 mm×5 mm×10 mm左右的凝膠塊并裝入核磁管中，采用LF-NMR儀弛豫測(cè)定凝膠樣品的橫向弛豫時(shí)間T2。測(cè)定條件：質(zhì)子共振頻率為22 MHz，測(cè)定溫度為32 ℃，參數(shù)設(shè)定為：τ-值150 us，重復(fù)掃描8 次，重復(fù)間隔時(shí)間4 000 ms，所得脈沖系列（Carr Purcell Meiboom Gill，CPMG）指數(shù)衰減曲線儀，采用儀器自帶的軟件進(jìn)行反衍得到T2圖譜。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

除了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）和掃描電子顯微鏡外，其他指標(biāo)均至少設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。采用SPSS Statistics 19分析軟件中的ANOVA程序進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 ·OH氧化對(duì)肌原纖維蛋白氧化程度和結(jié)構(gòu)特征的影響

2.1.1 對(duì)肌原纖維蛋白羰基含量的影響

圖1 ·OH氧化對(duì)肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effect of ·OH oxidation on carbonyl content of myofibrillar protein

不同濃度·OH對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白羰基含量的影響由圖1可知，對(duì)照組羰基含量為5.37 nmol/mg，隨著H2O2濃度的增加羰基含量顯著增加（P＜0.05），當(dāng)H2O2濃度增至10.0 mmol/L時(shí)，羰基含量達(dá)到11.35 nmol/mg，與對(duì)照組相比增加了111.35%，這與李艷青等[22]研究鯉魚(yú)肌原纖維蛋白氧化所得的結(jié)果一致。在·OH氧化體系中，H2O2濃度越高，·OH濃度也越高，羰基含量的增加說(shuō)明·OH對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白具有氧化修飾作用，且自由基濃度越高氧化程度也越高。羰基含量增加可能是因?yàn)椤H攻擊了蛋白質(zhì)的側(cè)鏈或肽鍵，形成了蛋白過(guò)氧化物，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成羰基，從而使羰基含量增加[23]。

2.1.2 對(duì)肌原纖維蛋白巰基含量的影響

圖2 ·OH氧化對(duì)肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig. 2 Effect of ·OH oxidation on sulfhydryl group content of myofibrillar protein

不同氧化程度的草魚(yú)肌原纖維蛋白巰基含量的變化情況從圖2可以看出，未氧化蛋白的總巰基含量為39.18 nmol/mg，H2O2濃度在0.1 mmol/L時(shí)，總巰基含量變化不大；當(dāng)H2O2濃度達(dá)到1.0 mmol/L時(shí)，總巰基含量開(kāi)始顯著下降（P＜0.05）；當(dāng)H2O2濃度為10.0 mmol/L時(shí)，總巰基含量下降至29.98 nmol/mg?；钚詭€基含量也呈下降趨勢(shì)，但降低幅度小于總巰基含量。巰基含量的降低一方面可能是因?yàn)檠趸沟鞍踪|(zhì)分子之間或內(nèi)部形成了二硫鍵，或者是進(jìn)一步氧化成磺酸類或其他氧化產(chǎn)物[24]；另一方面可能是氧化使蛋白質(zhì)變性形成聚集體，堆積在蛋白質(zhì)表面使檢測(cè)到的巰基含量下降[25]。另外，活性巰基含量下降的幅度比總巰基含量小，可能是因?yàn)樵诓蒴~(yú)肌原纖維蛋白中活性巰基含量占總巰基含量比例較小[26]。

2.1.3 對(duì)肌原纖維蛋白游離氨基含量的影響

圖3 ·OH氧化對(duì)肌原纖維蛋白游離氨基含量的影響Fig. 3 Effect of ·OH oxidation on free amine content of myofibrillar protein

由圖3可知，游離氨基對(duì)·OH氧化較為敏感，0.1 mmol/L H2O2的氧化作用即可使其含量發(fā)生顯著下降（P＜0.05），但在較低H2O2濃度范圍內(nèi)（0.1～1.0 mmol/L），含量下降并不顯著（P＞0.05），而當(dāng)H2O2濃度達(dá)到5.0 mmol/L以上時(shí)，游離氨基含量才發(fā)生顯著下降（P＜0.05）。這可能是因?yàn)椤H將蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的ε-氨基轉(zhuǎn)化成為羰基，與蛋白質(zhì)氨基反應(yīng)形成席夫堿，從而使得游離氨基含量下降[27-28]。

2.1.4 對(duì)肌原纖維蛋白二聚酪氨酸水平的影響

圖4 ·OH氧化對(duì)肌原纖維蛋白二聚酪氨酸水平的影響Fig. 4 Effect of ·OH oxidation on bityrosine level of myofibrillar protein

二聚酪氨酸的形成是因?yàn)檠趸^(guò)程中蛋白質(zhì)酪氨酸殘基氧化，通過(guò)共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵作用形成蛋白質(zhì)聚集物，可用來(lái)反映蛋白質(zhì)氧化的程度和蛋白結(jié)構(gòu)的變化[29-30]。草魚(yú)肌原纖維蛋白經(jīng)·OH氧化后二聚酪氨酸水平的變化由圖4可知，0.1 mmol/L H2O2的氧化同樣可使二聚酪氨酸水平顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明酪氨酸殘基對(duì)·OH也較為敏感。與游離氨基含量的變化相似，低H2O2濃度范圍內(nèi)二聚酪氨酸含量變化不明顯，當(dāng)H2O2濃度達(dá)5.0 mmol/L以上時(shí)才顯著增加（P＜0.05）。

2.1.5 對(duì)肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光的影響

圖5 ·OH氧化后肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光圖譜Fig. 5 Effect of ·OH oxidation on intrinsic fluorescenceof myofibrillar protein

內(nèi)源熒光主要反映蛋白質(zhì)分子中色氨酸等熒光基團(tuán)的氧化程度及其所處環(huán)境變化的情況，進(jìn)而用來(lái)表征氧化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的影響[31-32]?！H氧化對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光的影響如圖5所示，可以看出隨著H2O2濃度的增加蛋白熒光強(qiáng)度顯著下降，濃度為0.1 mmol/L時(shí)下降尤為顯著，說(shuō)明草魚(yú)肌原纖維蛋白色氨酸殘基對(duì)·OH也較為敏感。之后下降趨勢(shì)緩慢，當(dāng)H2O2濃度為10.0 mmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度僅下降了28.57%。蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降的原因，一方面可能是由色氨酸殘基包埋引起的，并且在氧化初期，這種包埋程度受氧化劑濃度的影響相對(duì)較大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，包埋效率會(huì)越來(lái)越低；另一方面可能是氧化使蛋白質(zhì)側(cè)鏈中的熒光氨基酸被猝滅[31]。

2.1.6 對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

圖6 ·OH氧化對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig. 6 Effect of ·OH oxidation on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

蛋白質(zhì)的表面疏水性能反映表面疏水性氨基酸的相對(duì)含量，其變化可以間接反映蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化[33]。從圖6可以看出，草魚(yú)肌原纖維蛋白表面疏水性隨著H2O2濃度的升高而逐漸增大，且H2O2濃度達(dá)10.0 mmol/L時(shí)增加尤為顯著（P＜0.05）。Sun Weizheng[34]、Liu Qian[35]等分別在廣東臘腸和鯉魚(yú)肉中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化也會(huì)使蛋白質(zhì)表面疏水性增加。表面疏水性的增加，是由于氧化使蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象發(fā)生了變化，一些疏水性的脂肪族與芳香族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)從蛋白分子內(nèi)部暴露出來(lái)，使蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊，導(dǎo)致了疏水性的增加[8]。與此同時(shí)，暴露出來(lái)的疏水性氨基酸也會(huì)進(jìn)一步被·OH氧化，氨基酸間的疏水相互作用以及氧化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集也會(huì)影響蛋白質(zhì)的疏水性，因此蛋白質(zhì)疏水性的變化是蛋白質(zhì)側(cè)鏈氧化、去折疊及其聚集三者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果[8]。

2.1.7 SDS-PAGE分析

圖7 不同氧化程度的肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 7 SDS-PAGE pattern of myofibrillar protein at different oxidation degrees

從圖7可以直觀地看出蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)、聚集及降解情況[36]。從圖7a中可以看出，隨著H2O2濃度的增加，肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白條帶逐漸變淺，而在分離膠的頂端形成了聚合物條帶。當(dāng)加入還原劑β-巰基乙醇后（圖7b），分離膠頂端聚合物條帶減弱，肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白條帶明顯加粗，說(shuō)明氧化促使肌原纖維蛋白分子之間發(fā)生了交聯(lián)或聚集，從而形成分子質(zhì)量較大且不可溶的聚集體。同時(shí)說(shuō)明二硫鍵是主要交聯(lián)方式，但聚合物并未完全被還原，說(shuō)明形成的聚集體中還有其他交聯(lián)方式（如形成二聚酪氨酸等）的存在[37]。

2.2 ·OH氧化對(duì)肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)的影響

2.2.1 對(duì)肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度、持水性和白度的影響

圖8 ·OH氧化對(duì)肌原纖維蛋白凝膠特性的影響Fig. 8 Effect of ·OH oxidation on gel properties of myofibrillar protein

由圖8可知，草魚(yú)肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度、凝膠持水力和凝膠白度均隨著H2O2濃度增加呈下降趨勢(shì)，其中凝膠持水性的變化呈現(xiàn)明顯的H2O2濃度依賴效應(yīng)，低濃度范圍內(nèi)凝膠強(qiáng)度和凝膠白度受H2O2濃度影響不顯著（P＞0.05）。值得注意的是，本研究中并未出現(xiàn)Xiong Youling L.等[38]報(bào)道的低濃度氧化有助于提高凝膠強(qiáng)度的現(xiàn)象，這可能與蛋白質(zhì)組成上的差異以及氧化引起的蛋白質(zhì)交聯(lián)程度和方式的不同有關(guān)。氧化雖然能使部分蛋白質(zhì)通過(guò)二硫鍵和二聚酪氨酸等方式發(fā)生交聯(lián)和聚集，但同時(shí)改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，因此會(huì)影響肌原纖維蛋白正常凝膠過(guò)程中的有序聚集，破壞凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的均勻性，使凝膠結(jié)構(gòu)變得疏松、孔隙增大，使凝膠保持水分的毛細(xì)管作用力下降，進(jìn)而引起持水性的下降[39]。

2.2.2 對(duì)肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖9 不同氧化程度的肌原纖維蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)Fig. 9 Scanning electron microscopy of myofibrillar protein gel

由圖9可以看出，不同氧化程度的草魚(yú)肌原纖維蛋白形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)明顯不同。未氧化的肌原纖維蛋白形成的凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)細(xì)膩、均勻、孔隙較??；而氧化蛋白形成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)粗糙、不均勻、孔隙較大且氧化程度越大，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重。蛋白質(zhì)熱誘導(dǎo)凝膠主要是通過(guò)二硫鍵、疏水相互作用、靜電作用和其他相互作用促使蛋白聚集而形成的，而氧化使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象發(fā)生變化，改變其表面疏水性及電荷，使蛋白分子間的吸引力和排斥力受到影響，導(dǎo)致蛋白形成較大的聚集體，不同程度地阻礙凝膠形成過(guò)程中分子間的交聯(lián)，進(jìn)而影響凝膠中蛋白質(zhì)分子間作用力，使凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)失去均勻性[40]。

2.2.3 對(duì)肌原纖維蛋白凝膠中水分分布的影響

圖10 不同氧化程度下肌原纖維蛋白凝膠水分子的T2弛豫特性Fig. 10 T2 relaxation of water from heat-induced myofibrillar protein gel

表1 ·OH氧化對(duì)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠水分子弛豫峰比例的影響Table 1 Effect of ·OH oxidation on peak area fraction of water from heat-induced myofibrillar protein gel

研究表明，蛋白質(zhì)凝膠中水分主要呈3 種狀態(tài)分布：結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水[41-42]。其中，結(jié)合水主要通過(guò)化學(xué)作用力結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，不易流動(dòng)水是指被束縛在凝膠致密的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的水分，自由水是在凝膠空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)外部、可以自由移動(dòng)的水分。結(jié)合水含量很低，不是決定凝膠持水性的關(guān)鍵因素。存在于凝膠孔徑中的不易流動(dòng)水是蛋白質(zhì)凝膠中含量最多的水分，它與自由水的變化直接關(guān)系到凝膠的持水性能[43]。因此凝膠網(wǎng)絡(luò)對(duì)水分子的包埋是凝膠保持水分的主要原因，凝膠網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)特征（孔徑大小、均勻程度等）顯著影響產(chǎn)品的持水性能[44]。草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠經(jīng)低場(chǎng)核磁掃描、反衍得到4 個(gè)峰T21、T22、T23、T24（圖10），其中T21、T22被認(rèn)為代表結(jié)合水，T23和T24代表不易流動(dòng)水及自由水。不同氧化程度的草魚(yú)肌原纖維蛋白形成凝膠中結(jié)合水變化不大，不易流動(dòng)水和自由水發(fā)生了顯著變化（表1），從峰面積可以看出，不易流動(dòng)水T23比例顯著減?。≒＜0.05），自由水T24比例顯著增大（P＜0.05）。凝膠中水分狀態(tài)的分布與凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，氧化導(dǎo)致草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變疏松且孔隙增大，導(dǎo)致凝膠保持水分的毛細(xì)管作用力降低，使部分不易流動(dòng)水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?，這也是凝膠持水性降低的主要因素[39]。

3 結(jié) 論

草魚(yú)肌原纖維蛋白經(jīng)過(guò)·OH氧化后形成了較多的羰基，羰基含量顯著增加，同時(shí)部分酪氨酸殘基發(fā)生聚合形成了二聚酪氨酸。氧化可引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，疏水性氨基酸發(fā)生暴露，導(dǎo)致表面疏水性的增加。巰基被氧化形成二硫鍵或磺酸類產(chǎn)物，導(dǎo)致巰基含量降低。游離氨基、色氨酸殘基等熒光基團(tuán)對(duì)氧化也較為敏感，使蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度顯著下降。由SDS-PAGE分析結(jié)果得知，氧化使肌原纖維蛋白發(fā)生了交聯(lián)或聚集，產(chǎn)生了分子質(zhì)量大于200 ku的聚集體。進(jìn)一步，·OH氧化顯著影響草魚(yú)肌原纖維蛋白的凝膠性能，使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變疏松、凝膠孔隙增大，凝膠中部分不易流動(dòng)水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤罱K導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度和凝膠持水性的顯著降低。氧化能改變草魚(yú)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)特征、降低其凝膠性能，因此在貯藏加工過(guò)程中應(yīng)該采取有效措施防止魚(yú)肉蛋白發(fā)生氧化，減少氧化引起的魚(yú)肉品質(zhì)和加工性能的劣變，以保障魚(yú)肉加工產(chǎn)品的品質(zhì)。

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Effect of Hydroxyl Radical Oxidation on Structural and Gel Properties of Myofibrillar Protein from Grass Carp

LI Xuepeng1, LIU Cikun1, ZHOU Mingyan1, WANG Jinxiang1, ZHU Wenhui1, XU Yongxia1, YI Shumin1, LIN Hong2, LI Yujin3, LI Jianrong1,*
(1. National and Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, College of Food Science and Engineering, Bohai University, Jinzhou 121013, China; 2. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3. Rongcheng Taixiang Food Co. Ltd., Rongcheng 264300, China)

In this paper, myofibrillar protein from grass carp was artificially oxidized in hydroxyl radical-generating system with H2O2concentrations of 0.1, 1.0, 5.0 and 10.0 mmol/L, and the effect of oxidization on the structural characteristics and gel properties of myofibrillar protein was investigated. The results showed that the carbonyl content increased significantly(P 〈 0.05) after oxidization by 111.35% compared to the initial value when the concentration of H2O2was 10.0 mmol/L.With the increase in H2O2concentration, the total thiol group level, free thiol group level, and free amine content decreased significantly (P 〈 0.05), while bityrosine content and surface hydrophobicity increased significantly (P 〈 0.05). The sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) result showed that hydroxyl radical oxidation could induce the crosslinking and aggregation of protein molecules, thereby forming aggregates with molecular mass higher than 200 ku. The above results indicated that the thiol group, tyrosine and tryptophane residues of myofibrillar protein were modified after hydroxyl radical oxidation, thus leading to a significant change in protein structure. In addition, the gel properties of myofibrillar protein were also influenced by oxidation, the network structure of the gel was damaged, and the portable water in the gel was converted to free water. These changes finally induced apparent decreases in the gel strength and water-holding capacity.

grass carp (Ctenopharyngodon idellus); myofibrillar protein; protein oxidation; structural characteristics;gel properties

10.7506/spkx1002-6630-201721005

TS254.1

A

1002-6630（2017）21-0030-08

2016-07-20

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31771999）；中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2015M582143）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD17B03）；遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（LZ2014047）

李學(xué)鵬（1982—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品貯藏加工。E-mail：xuepengli8234@163.com

*通信作者：勵(lì)建榮（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品貯藏加工與食品安全。E-mail：lijr6491@163.com

李學(xué)鵬, 劉慈坤, 周明言, 等. 羥自由基氧化對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和凝膠性質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(21):30-37.

10.7506/spkx1002-6630-201721005. http://www.spkx.net.cn

LI Xuepeng, LIU Cikun, ZHOU Mingyan, et al. Effect of hydroxyl radical oxidation on structural and gel properties of myofibrillar protein from grass carp[J]. Food Science, 2017, 38(21): 30-37. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721005. http://www.spkx.net.cn